专利名称：聚乙烯亚胺纳米凝胶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种聚乙烯亚胺纳米凝胶及其在体内外基因转染中的应用。
背景技术：
很多疾病和癌症已经被证实是由单个基因的突变和缺失引起的，基因治疗就是将正常基因导入体内来弥补缺失和(或)突变基因的不足。目前，人类基因组计划已经完成，而后基因组计划正在实施中。开发新功能型的基因药物正逐渐成为世界科学研究的热点之一，而作为基因药物研制的一个重要环节——载体的研制和开发也吸引着越来越多的研究者。
用来介导DNA或寡聚核苷酸结合的载体主要有病毒类载体和非病毒类载体两类。病毒类载体使用重组病毒实现转染治疗基因，如逆转录酶病毒(retroviral vectors，RV)已经广泛用于多种细胞组织的临床基因治疗，另外还有腺病毒载体(adenoviral vectors，AV)、单纯疱疹病毒载体(herpes simplex viralvectors，HSV)，以及目前正在兴起的慢病毒载体(lentiviral vectors)等。在这些病毒类载体中，有些对所能携带的基因片断的长度有限制，体内导入效率极低且无靶向性，有些存在机体变异、致癌等副作用及危险。例如美国3名接受基因治疗的“气泡儿童”综合症患者被诊断为白血病，因此FDA2003年1月14日宣布暂停了27项类似的以逆转录病毒为载体的基因治疗。
传统的非病毒载体，比如裸DNA、脂质体，磷酸钙，以及电转移等，虽然安全，但转导效率极低，难以获得有意义的基因表达。而非病毒类载体中的阳离子聚合物和DNA结合形成的复合物具有低毒、低免疫反应、外源基因整合几率低、无插入基因大小片段限制等优点，且制备方法简单多样，使用方便，便于保存和检验，是目前基因治疗载体研究的热点。
目前国外正在研究的可作为基因转染载体的阳离子聚合物主要有精胺(spermine)、多聚精氨酸(polyarginine)、鱼精蛋白(protamine)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚丙烯亚胺树状物(polypropylenimine dendrimers)、多聚胺树状物(polyamidoamine dendrimers)、组氨酸赖氨酸分枝状聚合肽和壳聚糖(chitosan)等。自1995年Boussif等(O.Boussif，F.Lezoualc’h，M.A.Zanta，M.D.Merbny，D.Scherman，B.Demeneix，J.P.Behr，A versatile vector for gene andoligonucleotide transfer into cells in culture and in vivopolyethylenimine，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)7297-7301)首先报道了聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)可作为非病毒载体后，PEI作为一种重要的真核细胞的基因转染载体已经成为研究最为广泛的非病毒型基因转染载体之一。大量的体内和体外的转染实验已经证实PEI具有显著的基因转染效率，在转染过程中能够更好地保护DNA不受其它酶类如DNase1和DNase2的攻击而降解。
目前国内外已有商品化的PEI，其常被用作高分子凝聚剂、分散剂，部分可用于基因转染。它们的合成方法通常为传统的化学方法，如微乳液聚合(Xin Chen et al.，The synthesis and characterizations of monodispersecross-linked polymer microspheres with carboxyl on the surface，Polymer 43(15)(2003)4147-4152)、多步化学合成等。而这些合成方法中有些步骤较多并繁杂、反应时间长，副反应多且不可控制，而且在这些常规的有机化学合成工艺中，通常需要一些具有生物毒性的有机溶剂作为反应溶剂，或添加一些化学引发剂或乳化剂，如二氯甲烷(Young Heui Kim，Jeong Hyun Park，et al.，Polyethylenimine with acid-labile linkages as a biodegradable gene carrier，Journal of Controlled Release(2004)(In press))；又如用2-氨基乙醇为起始原料合成聚乙烯亚胺，产品中有毒的反应物难以除尽，且反应物产率很低，粒径大小难以精确控制(Anke von Harpe，et al.，Characterization of commerciallyavailable and synthesized polyethylenimines for gene delivery，Journal ofControlled Release(2000))。这不仅使产品的纯化工艺复杂，严重地污染环境，而且影响载体在生物医药领域应用的安全性。
另一方面，由于同一类型载体的基因转染效果及安全性等方面可因其理化性质不同而有差异，如载体的分子量，分子量的分布，颗粒粒径大小及其分布等，特别是载体纳米粒子在体内及体外的吸收对粒径大小具有依赖性，通常50nm～100nm粒径的转染效果较好。控制载体纳米凝胶的产品在一定的尺度具有窄粒径分布，有助于提高转染效率，提高产品的利用率、减少用量、减小细胞毒性等。但现有作为基因转染载体的PEI的分子量大都为0.6～25kDa，其结构 中不含有双键或不稳定环，用常规的化学法很难引发其继续聚合，且由于现有PEI合成技术很难控制反应按需结束，故所得PEl分子量及粒径大小不易控制，分子量分布范围较宽、粒径大小不均匀、分散性差，如目前用作基因转染载体的日本东京化成工业株式会社出品的PEI预聚体的PCS(photon correlation spectroscopy，中文译名为光子相关光谱法)结果提示为多峰分布，粒径分布范围宽(如图1所示)。
发明内容
本发明的目的是解决上述问题，提供一种新的聚乙烯亚胺纳米凝胶。
本发明的聚乙烯亚胺纳米凝胶，其由聚乙烯亚胺预聚物水溶液，在pH不超过ll的碱性条件下，采用抽氢剂经紫外光照合成反应制得，其颗粒粒径采用光子相关光谱法表示为单峰分布，多分散系数(Poly.Index)为0.1～0.7。
本发明的聚乙烯亚胺纳米凝胶颗粒粒径通常在20～600nm范围，较佳的用作基因转染载体的粒径为30～200nm。
其中，本发明所说的聚乙烯亚胺预聚物是指结构式如上所示的链状或树枝分叉状的不含有双键或不稳定环的低分子量(其分子量一般＜25kDa)聚乙烯亚胺，该聚乙烯亚胺预聚物水溶液也为凝胶形态；本发明选用的聚乙烯亚胺预聚物在反应体系中的重量浓度为0.05-16％，较佳为1-7％。
而本发明在聚乙烯亚胺预聚物溶液中还可以加有成核剂，所说的成核剂是指能与PEI上的N发生络合，可以控制粒度大小并提高PEI分散性，从而得到大小更均匀且储存稳定性高的纳米凝胶的物质。已知化学领域中能与N络合的物质，如过渡金属盐等均可作为本发明成核剂，例如铁、铜、稀土元素等的金属盐；优选羧酸铁、氯化亚铁、氯化铜、氯化亚铜等。
加入的成核剂在反应体系中的浓度较佳地为0.07-20mg/ml，更佳为1.5-3.5mg/ml。
上述的碱性条件是指pH≥7，较佳的是7.6～11，更佳的是8～10。
本发明中所说的抽氢剂是指在紫外光光照下产生羟基等自由基可以从一些有机物分子上抽取C、N或S等原子上连接的H原子，从而得到新的自由基而引发一系列的交联反应的一类分子。其可为现有紫外光合成反应中常用的各种光引发剂，如过氧化物，本发明的抽氢剂优选过氧化氢，其在反应体系中的体积浓度为0.02-3％，较佳为0.05-1％，更佳的是0.1～0.5％。
基于如图3所示的本发明合成体系的紫外分光光度吸收光谱图，本发明选用的紫外光波长为200～260nm，本发明选择能高效产生其中253.7nm短波长紫外光的低压汞灯为辐照源，其较佳的光照强度为＞0、≤18mw/cm2，更佳的是3～18mw/cm2，光照时间一般不少于5分钟，最长不超过3小时；本发明为便于观察及控制反应条件，通常选用光照强度18mw/cm2，光照时间选择5分钟～1小时之间。
同大多数高分子有机反应一样，本发明纳米凝胶在制备过程中进行搅拌，由于本发明中需搅拌物质流动性较好，所以根据常规采用越高的搅拌速度越好，一般为140～500转/分钟，为便于观察及控制反应条件，本发明采用140转/分钟左右的机械搅拌。
而本发明中所说的紫外光照合成反应，同现有紫外光合成反应一样，在除氧条件下进行，本发明采用最简易的氮气鼓泡法。
更佳地，尤其为得到更好的基因转染载体，本发明还可以将上述合成工艺制得的聚乙烯亚胺纳米凝胶随后进一步纯化得到纯品即先用0.45μm针式滤器纯化，再用分子量为10000-12000道尔顿的透析袋纯化去除未经反应的成分及其它杂质。当然，也可以根据不同产品要求，采用其它的过滤、萃取等常规PEI凝胶的提纯方法。
本发明采用短波长的紫外光引发低分子量的PEI预聚体产生自由基，进一步聚合得到高分子量的PEI纳米凝胶。在PEI预聚体中不含有双键或不稳定环，用常规的化学法很难引发其聚合，而本发明光化学合成法是利用抽氢剂在253.7nm波长下产生的羟基自由基抽取预聚体上的H原子从而使其发生交联，生成高分子量的分叉状PEI目标产物，另外还可使用成核剂与PEI上的N发生络合得到大小更均匀的纳米凝胶，其反应过程如图2所示。
本发明PEI纳米凝胶的红外光谱及核磁碳谱数据提示其含有C＝N-键，和反应前预聚体所含有的官能团不一样。
本发明的聚乙烯亚胺纳米凝胶可用于制备基因转染载体。
本发明的积极进步效果在于第一、本发明通过紫外光辐照引发不含双键和不稳定环的物质的聚合，不需要添加引发剂及表面活性剂，具体而言，其使抽氢剂在紫外光照射下分解产生羟基自由基，抽取PEI预聚体上的氢原子使预聚体发生交联，最终得到更高分子量的PEI纳米凝胶，而PEI预聚体本身在该波长下是很难发生光降解的；另外，反应在水溶液中进行，无具有生物毒性的有机溶剂参与，可以提高其体内试验的安全性；而253.7nm的紫外光可以使大肠菌、红痢菌、伤寒菌、葡萄球菌、结核菌、枯草菌、谷物霉菌等细菌和病毒死亡，保证了本发明PEI纳米凝胶的医用质量。第二、本发明制备方法工艺简单，反应时间快，一般仅需5min～1小时，所用试剂生物毒性小，有利于环保，从而降低了生产成本。第三、本发明的高分子纳米凝胶接近球状，其粒径可控，粒径分布窄，表面呈分叉状，分散性好，稳定性好，细胞毒性和免疫原性低，不和人外周血有核细胞发生外源基因转染，小牛血清培养液不会改变基因转染效率，对人肿瘤细胞的基因转染效率超过30％。
图1为现有PEI预聚体的PCS检测结果。
图2为本发明采用PEI预聚体光化学合成反应过程示意图。
图3为本发明各种合成体系的紫外分光光度吸收光谱图；其中，A图为现有PEI预聚体凝胶水溶液；B图为PEI预聚体凝胶水溶液加入成核剂后的反应体系；C图为抽氢剂双氧水的反应体系。
图4为本发明聚乙烯亚胺纳米凝胶的核磁共振碳(C13)谱图。
图5为本发明聚乙烯亚胺纳米凝胶的红外光谱图。
图6为本发明一实施例3个样品的PCS检测结果(A图为1号样品，B图为2号样品，C图为3号样品)。
图7为本发明另一实施例3个样品的PCS检测结果(A图为4号样品，B图为5号样品，C图为6号样品)。
图8为本发明一实施例聚乙烯亚胺纳米凝胶的扫描电子显微镜(A)和原子力显微镜(B)图。
图9为单个含水聚乙烯亚胺纳米凝胶颗粒的原子力显微镜图。
图10大剂量聚乙烯亚胺纳米凝胶对小鼠肝脏、肾脏和心脏超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响图表；图11为小剂量聚乙烯亚胺纳米凝胶对小鼠肝脏、肾脏和心脏超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响图表；图12为大剂量聚乙烯亚胺纳米凝胶对小鼠肝脏、肾脏和心脏谷胱甘肽(GSH)含量的影响图表；图13为小剂量聚乙烯亚胺纳米凝胶对小鼠肝脏、肾脏和心脏谷胱甘肽(GSH)含量的影响图表；图14为大剂量聚乙烯亚胺纳米凝胶对小鼠肝脏、肾脏和心脏丙二醛(MDA)含量的影响图表；图15为小剂量聚乙烯亚胺纳米凝胶对小鼠肝脏、肾脏和心脏丙二醛(MDA)含量的影响图表；在图10～15中，生理盐水(NS)作为阴性(空白)对照，PEI预聚体作为阳性对照，其中▲P＜0.05(vs NS)，*P＜0.05(vs PEI预聚体)，n＝6。
图16为小牛血清培养液对本发明PEI纳米凝胶基因转染效率的影响图表。
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不仅限于此。
其中，PEI预聚体(Polyethyleneimine)购自日本东京化成工业株式会社，原液是30％(w/w)的水凝胶溶液；水为二蒸水；其余试剂为常规市售AR试剂。
用英国MARLVEN公司Zetasizer 3000HS型激光粒度散射仪，对本发明PEI纳米凝胶粒子的粒径进行PCS表征，测试时的温度为25℃，入射激光的波长为633nm，其偏振方向与散射检测光平面垂直。并使用Nanoscope IIIaAFM原子力显微镜(Digital Instruments，Santa Barbara，CA)和LEO1530VP型扫描电子显微镜(SEM)对纯化后的纳米粒子的形貌进行表征。
实施例1在50ml石英烧瓶中，加入下列各种组分组成反应体系，每种组分的浓度依次为PEI预聚物的浓度为1.15％(w/w)、羧酸铁作为成核剂的浓度为1.54mg/ml，加入极少量稀盐酸溶液(0.5M)调节pH值至9.5。控制搅拌速度为140转/分钟左右，通氮气除氧30分钟后，加入3％的双氧水(过氧化氢)，使其在反应液中的浓度为0.057％(v/v)。在连续通氮气(氮气流量80ml/min)的情况下，用紫外低压汞灯，以光照强度为18mw/cm2光照1h(小时)引发反应。控制如上所述的反应条件进行三次重复试验得到1号、2号、3号三个样品，对所得三次重复样品用0.45μm针式滤器(ANPEL产品)和分子量10000-12000道尔顿的透析袋(华美生物工程公司)纯化样品。
用上述激光粒度散射仪PCS法测量三个纳米凝胶样品的粒径各三次，结果示单峰分布，粒径分布窄(如图6所示)，所得平均值分别为1号，91.9nm；2号，79.4nm；3号，89.9nm，它们的多分散系数依次为0.303、0.6、0.439，平均粒径大小约为87nm。
对样品进行冷冻真空干燥后用扫描电子显微镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)表征其形状为球形结构，整体分散性较好，局部有团聚现象，结果如图8所示。用AFM观察单个粒子，可以在粒子上见到明显的沟槽，推测为疏松的枝杈状结构，结果见图9。作为对照，将现有的上述PEI预聚体同样条件下进行PCS检测，结果如图1所示，多峰分布，粒径分布宽，大小十分不均匀，分散性差。
实施例2PEI预聚物浓度为4.8％(w/w)、氯化亚铁浓度为3.21mg/ml、加入极少量稀盐酸溶液调节溶液的pH值至10.0。加入3％的过氧化氢，使其在反应液中的浓度为0.12％(v/v)，余同实施例1。
将纯化后的聚乙烯亚胺纳米凝胶样品用激光粒度散射仪PCS法测量，均示单峰分布(图未示)，该聚乙烯亚胺纳米凝胶的粒径平均值为172.9nm，多分散系数为0.355。在4℃条件下放置21天后再检测，其粒径的平均值为171.7nm，多分散系数为0.415。结果表明聚乙烯亚胺纳米凝胶样品在放置过程中基本保持稳定，粒径没有发生明显变化，具有一定的贮存稳定性。经真空干燥的聚乙烯亚胺纳米凝胶样品以扫描电子显微镜测试该样品的形状也同实施例1近于球形，分散性好。
实施例3
PEI浓度为1.15％(w/w)、羧酸铁浓度为1.54mg/ml、加入稀盐酸溶液调节pH值至8.0。控制搅拌速度为140转/min左右，通氮气除氧30min后，加入3％的过氧化氢，使其在反应液中的浓度为0.11％(v/v)。在连续通入氮气(氮气流量80ml/min)的条件下，紫外光光照强度为18mw/cm2光照1h引发反应。控制如上所述的反应条件每隔一个月进行一次重复试验，得到4号、5号、6号三个样品，样品经0.45μm针式滤器过滤和三次透析纯化后，经PCS测量三个纳米凝胶样品的粒径各三次，结果示单峰分布，粒径分布窄(如图7所示)，所得平均值分别为4号，136.5nm；5号，146.4nm；6号，150.4nm，它们的多分散系数依次为0.300、0.437和0.408。
实施例4每种组分的浓度依次为PEI浓度为6.3％(w/w)，不添加成核剂，加入极少量稀盐酸溶液(0.5M)调节pH值＝10.6，在通氮除氧30min后加入过氧化氢使其在反应液中的浓度为1.36％(v/v)，控制紫外光光照强度为18mw/cm2，光照反应时间为3小时，余同实施例1。纯化后用PCS测得结果示单峰分布，纳米凝胶的粒径为38nm，多分散系数为0.200。
实施例5PEI预聚物浓度为6％(w/w)、成核剂羧酸铁的浓度为0.1mg/ml、调节溶液的pH值至10.0，余同实施例1，用PCS测得结果示单峰分布，所得纳米凝胶的粒径为341nm左右，多分散系数为0.105。
实施例6PEI浓度为16％(w/w)，成核剂浓度为20mg/ml，调节pH值＝9.5，双氧水在反应液中的浓度为2.8％(v/v)，余同实施例1。纯化后，用PCS测得结果示单峰分布，纳米凝胶的粒径为106nm，多分散系数为0.502。
实施例7PEI浓度为3.7％(w/w)，成核剂氯化亚铁浓度为0.7mg/ml，调节pH值＝10.6，双氧水在反应液中的浓度为0.05％(v/v)，余同实施例1。纯化后用PCS测得结果示单峰分布，纳米凝胶的粒径为600nm，多分散系数为0.700。
实施例8PEI浓度为4.8％(w/w)，成核剂浓度为3.2mg/ml，调节pH值＝10.6，加入过氧化钠，使其在反应液中的浓度为0.13％(v/v)，控制紫外光光照强度为3mw/cm2，光照0.5小时，余同实施例1。纯化后，用PCS测得结果示单峰分布，纳米凝胶的粒径为200nm，多分散系数为0.450。
实施例9PEI预聚物浓度为0.05％(w/w)、成核剂浓度为0.56mg/ml、调节溶液的pH值至8，加入3％的过氧化氢，使其在反应液中的浓度为0.02％(v/v)，紫外光光照强度为18mw/cm2，光照5分钟引发反应，余同实施例1。
纯化后的聚乙烯亚胺纳米凝胶用PCS测得结果示单峰分布，其粒径平均值为256nm，多分散系数为0.30。
实施例10PEI预聚物浓度为3.7％(w/w)、成核剂氯化亚铁浓度为0.07mg/ml、调节溶液的pH值至7.6，加入3％的过氧化氢，使其在反应液中的浓度为0.037％(v/v)，紫外光光照强度为18mw/cm2，光照0.5小时引发反应，余同实施例1。纯化后的聚乙烯亚胺纳米凝胶用PCS测得结果示单峰分布，其粒径平均值为325nm，多分散系数为0.670。
上述实施例制得的本发明PEI纳米凝胶使用华东师范大学的500MHZ的核磁共振仪对预聚体和本发明的高分子量PEI纳米凝胶进行分子结构表征，其中本发明PEI纳米凝胶的13C-NMRδ35.20，36.28，37.96，39.77，42.73，44.06，46.15，47.69，52.01，54.25，57.65，59.31，60.00，63.66，65.15，67.42，69.44，76.02，164.92，166.35(如图4所示)，二者的分子结构不相同，本发明的PEI在164.92-166.35处出现了新的峰，该峰为-C＝N的峰，而在30～70ppm范围内的峰也发生了较大变化，是因为反应过程中-CH2上的H被抽氢剂抽走，经反应得到了新的一些烷基键，这进一步验证了紫外光引发的交联反应的发生。根据结果，我们推断合成的PEI纳米凝胶中含有C＝N-键。
此外，本发明PEI纳米凝胶的红外光谱数据为IR(KBr，cm-1)3418.95(vs)，2948.03(s)，2834.95(s)，2359.02(w)，1651.92(m)，1574.98(s)，1471.35(s)，1313.61(m)，1117.61(m)，586.30(m)，其图谱如图5所示，与上述预聚体的红外光谱相比，本发明PEI在1574.98处出现了一个新峰，而1651.92，1471.35处的峰也发生了强度的变化，说明在分子中增加了C-H键的含量，而出现了C＝N-新键，这和C13核磁共振谱的结果相吻合，即也证实PEI纳米凝胶含有C＝N-键，和反应前预聚体所含有的官能团不一样。
应用实施例1 PEI纳米凝胶作为肿瘤治疗基因转导载体的安全性在徐州医学院的协作下，对本发明的高分子量PEI纳米凝胶作为肿瘤治疗基因转导载体的安全性进行了验证。
其中，大剂量试验给小鼠100mg/kg体重，0.2ml，1次注射下列样品；小剂量试验给小鼠按总共5mg/kg体重的剂量，1次/天，分3天连续注射下列样品；样品为实施例1～4制备得到的各种粒径的PEI纳米凝胶，同剂量的生理盐水(NS)作为阴性(空白)对照，PEI预聚体作为阳性对照，采用SPSS12.0统计软件LSD方法对下列各组数据进行方差分析及差异作统计学比较，结果如图10～15所示。结论为1、对小鼠肝脏、肾脏和心脏超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响大剂量试验如图10所示，可见随PEI纳米凝胶粒径的增大超氧化物歧化酶活力逐渐减小，近似于一定斜率的线性关系，且PEI预聚体毒性最大。
小剂量试验如图11所示，本发明各种粒径的PEI纳米凝胶对小鼠肝脏、肾脏和心脏SOD活力无显著影响，但PEI预聚体降低了小鼠肝脏、肾脏和心脏SOD活力。
2、对小鼠肝脏、肾脏和心脏谷胱甘肽(GSH)含量的影响大剂量试验如图12所示，可见随PEI纳米凝胶粒径的增大谷胱甘肽含量逐渐减小，近似于一定斜率的线性关系，且PEI预聚体毒性最大。
小剂量试验如图13所示，本发明各种粒径的PEI纳米凝胶对小鼠肝脏、肾脏和心脏GSH含量无显著影响，但PEI预聚体降低了小鼠肝脏、肾脏和心脏GSH含量。
3、对小鼠肝脏、肾脏和心脏丙二醛(MDA)含量的影响大剂量试验如图14所示，可见随PEI纳米凝胶粒径的增大MDA含量逐渐增大，近似于一定斜率的线性关系，且PEI预聚体毒性最大。
小剂量试验如图15所示，本发明各种粒径的PEI纳米凝胶对小鼠肝脏、肾脏和心脏MDA含量无显著影响，但PEI预聚体显著提高了小鼠肝脏、肾脏和心脏MDA含量。
另外，实验还表明本发明各种粒径的PEI纳米凝胶和PEI预聚体对小鼠外周血白蛋白、小鼠外周血小鼠肌酐、小鼠外周血白蛋白\球蛋白比例、小鼠外周血小鼠丙氨酸氨基转移酶、小鼠外周血小鼠尿素氮、小鼠脾脏淋巴细胞细胞周期和凋亡等均无显著影响。
综上所述，本发明的PEI纳米凝胶对小鼠肝脏、肾脏和心脏SOD活力、GSH含量、MDA含量等均无显著影响，说明本发明的PEI基因转染载体在动物整体水平上无生物毒性。而PEI预聚体会显著降低小鼠肝脏、肾脏和心脏SOD活力和GSH含量，显著提高小鼠肝脏、肾脏和心脏中的MDA含量，这说明预聚体对小鼠重要脏器有氧化性损伤。
应用实施例2 本发明PEI纳米凝胶基因转染效率的表征转染方法(1)报告基因pLEGFP-C1质粒的扩增、提取和纯化可按现有常规方法进行，报告基因的获取pLEGFP-C1购自Clonetech公司。
重组DNA转化宿主细胞感受态细胞大肠杆菌DH5α的制备，转染大肠杆菌HB101或DH52，应用抗生素平板筛选含有阳性重组子的菌落，并扩菌制备高纯度的pLEGFP-C1。
细菌的收集高纯度的pLEGFP-C1制备，按质粒提纯试剂盒(购自QIAGEN公司)说明操作。
核酸的定量UV-2401PC型紫外分光光度仪(日本岛津公司)(2)转染细胞转染细胞分别为Bell肝癌细胞、A549肺癌细胞、HELA宫颈癌细胞、BGC-823胃癌细胞(购自中国医学科学院药物研究所)和人外周血有核细胞(实验者本人)。
(3)利用荧光显微镜和流式细胞仪测定在本发明上述各种粒径、不同浓度(浓度梯度设为4μg、6μg、8μg)的PEI纳米凝胶(实施例1～4产品)介导下转染Bell肝癌细胞、A549肺癌细胞、HELA宫颈癌细胞和BGC-823胃癌细胞。转染前24h，分别将上述肿瘤细胞接种在24孔细胞培养板中，每孔接种5×104个细胞，待细胞丰度50％～80％左右进行转染，转染前细胞用PBS洗涤1次，加入1ml不含血清及抗生素的PR1640培养基。
2μg的DNA溶于50μl生理盐水。不同浓度PEI预先无菌抽滤(最优浓度由预试验确定，并上下个移动一个梯度，共计三个浓度梯度(4μg、6μg、8μg)溶于50μl生理盐水。
本发明PEI加入DNA，室温孵育10分钟。100μl的PEI/DNA复合物加入细胞培养孔，转入培养箱37℃温育2h。PBS洗涤2次，加入含10％FCS(小牛血清)和抗生素的细胞培养液培养，每孔重复12孔。24～36h后荧光显微镜下观察荧光表达并计数表达率。同时消化，收集细胞PBS洗涤2次，6个复孔流式细胞仪检测荧光阳性表达，计算结果时，阳性细胞百分数值均减去未加质粒的空白对照细胞组的自发性荧光值。其余6个复孔的细胞收集洗涤后加入预冷的75％酒精1ml固定1～2h，PBS洗涤2次加入10μl PI(propidium iodide碘化丙啶)混匀，至4℃闭光30min，流式细胞仪(FACSCalibur美国BD公司)检测细胞周期和凋亡。
注流式细胞仪(FACS Calibur美国BD公司)光源为488nm的氩离子激光器。GFP(绿色荧光蛋白)受488nm激发后发出507nm的绿色荧光。测定完成后在计算机上用Cells Quest软件分析数据。
利用台盼蓝染色法和MTT法研究本发明PEI体外在最优转染浓度(最优浓度由预试验确定，并上下各移动一个梯度，共计三个浓度梯度)及十倍最优浓度下对Bell肝癌细胞、A549肺癌细胞、HELA宫颈癌细胞和BGC-823胃癌细胞的毒性等可能影响因素。
(4)人外周血有核细胞的提取和处理抽取人血24ml，分装于带有抗凝剂的无菌试管中，3ml/管。将3ml淋巴细胞分离液移入10ml具塞离心管中，再将等量人血缓慢加入离心管中，以1500r/min离心15min。用细长毛细吸管小心吸取云雾状中间层，共移入3个5ml EP管中，用PBS洗涤2次。将其中一个EP管用无血清、无抗生素的1640混匀，以8×105/孔的细胞数分装入24孔培养板中，按肿瘤细胞的转染方法进行转染实验(PEI的浓度梯度设为4μg、6μg、8μg，DNA均取2μg，并重复3次)，作为对照组。
将另外2个EP管分别用含5μg/ml conA的1640生长液和含20μg/ml PHA的1640生长液混匀，以8×105/孔的细胞数分装入24孔培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中孵育。待含有conA刺激因素的细胞孵育20h后按肿瘤细胞的转染方法进行转染实验(PEI的浓度梯度设为4μg、6μg、8μg，DNA均取2μg，并重复3次)。待含有PHA刺激因素的细胞孵育48h后按肿瘤细胞的转染方法进行转染实验(PEI的浓度梯度设为4μg、6μg、8μg，DNA均取2μg，并重复3次)。
(5)统计学处理采用SPSS12.0统计软件LSD方法对各组数据进行方差分析及差异作统计学比较。
结果用流式细胞仪和荧光显微镜测定本专利合成的PEI纳米凝胶对Bell肝癌细胞、A549肺癌细胞、HELA宫颈癌细胞和BGC-823胃癌细胞转染效率的值如下表所示
同时我们还用原子力显微镜观察到浓缩DNA的复合物纳米粒子为毛刺状结构(图未示)，也证实了PEI和DNA通过静电作用结合到一起的设想，DNA是缠绕在PEI的表面，在进入细胞后，通过细胞中pH值的改变，会使DNA比较容易从复合物上释放出来。
特别需要指出的是，本发明的高分子量PEI纳米凝胶对经PHA和conA处理的人外周血有核细胞进行转染，分别于转染后24h、48h、72h进行观察，均未发现有阳性表达，说明本发明的PEI纳米凝胶不会导致血液内有核细胞的外源基因转染。
应用实施例3 小牛血清培养液对本发明PEI纳米凝胶基因转染效率的影响Ogris等认为培养基中含有血清时会影响基因转染载体的基因转染效率(Ogris M，Steinlein P，Kursa M，et al.，The size of DNA/transferring-PEIcomplexes is an important factor for gene expression in cultured cells，Gene Ther.5(10)(1998)1425-1433)。而本实验用于研究小牛血清培养液对本发明PEI纳米凝胶基因转染效率的影响。
样品为实施例1、实施例2、上述商品化基因转染PEI预聚体、和现常用于基因转染研究的DOTAP脂质体(取自上海交通大学)。试验过程参见应用实施例2，其中将各种载体/DNA复合物加入96孔板，在有或无FBS(小牛血清，10％)的情况下，转染96孔板中的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，结果如图16所示。
结论本试验证实本发明的高分子量PEI纳米凝胶用于细胞转染时，小牛血清培养液不会改变基因转染效率，这对开展动物基因转染研究具有十分重要的意义。
权利要求
1.一种聚乙烯亚胺纳米凝胶，其由聚乙烯亚胺预聚物水溶液，在pH不超过11的碱性条件下，采用抽氢剂经紫外光照合成反应制得，其颗粒粒径采用光子相关光谱法表示为单峰分布，多分散系数为0.1～0.7。
2.如权利要求1所述的聚乙烯亚胺纳米凝胶，其特征在于其颗粒粒径为20～600nm。
3.根据权利要求2所述的聚乙烯亚胺纳米凝胶，其特征在于其颗粒粒径为30～200nm。
4.根据权利要求1所述的聚乙烯亚胺纳米凝胶，其特征在于该聚乙烯亚胺预聚物在反应体系中的重量浓度为0.05-16％。
5.根据权利要求1所述的聚乙烯亚胺纳米凝胶，其特征在于该聚乙烯亚胺预聚物水溶液中还加入成核剂，其在反应体系中的浓度为0.07-20mg/ml。
6.根据权利要求5所述的聚乙烯亚胺纳米凝胶，其特征在于该成核剂为过渡金属盐。
7.根据权利要求1所述的聚乙烯亚胺纳米凝胶，其特征在于该抽氢剂为过氧化物，其在反应体系中的体积浓度为0.02-3％；该紫外光波长为200～260nm。
8.根据权利要求7所述的聚乙烯亚胺纳米凝胶，其特征在于该紫外光波长为253.7nm，其光照强度为＞0、≤18mw/cm2，光照时间为5分钟至3小时。
9.根据权利要求1所述的聚乙烯亚胺纳米凝胶，其特征在于将权利要求1～9所述的聚乙烯亚胺纳米凝胶先用0.45μm针式滤器纯化，再用分子量为10000-12000道尔顿的透析袋纯化制得其纯品。
10.如权利要求1～9所述的聚乙烯亚胺纳米凝胶在制备基因转染载体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种聚乙烯亚胺纳米凝胶，其由聚乙烯亚胺预聚物水溶液，在pH不超过11的碱性条件下，采用抽氢剂经紫外光照合成反应制得，其颗粒粒径采用光子相关光谱法表示为单峰分布，多分散系数为0.1～0.7。本发明还公开了其作为基因转染载体的用途。本发明PEI纳米凝胶粒径可控，粒径分布窄，比较均匀，由此降低了细胞毒性和免疫原性，提高了其作为载体在生物医药领域应用的安全性及转染效率，并不和人外周血有核细胞发生外源基因转染，转染效率也不受小牛血清培养液影响。
文档编号C08L39/00GK1737037SQ20051002674
公开日2006年2月22日 申请日期2005年6月15日 优先权日2005年6月15日
发明者姚思德, 徐冬梅, 刘永彪, 乔向利, 余家会, 孙汉文, 盛康龙 申请人:中国科学院上海应用物理研究所