亲水性优异的新型填充剂及其制备方法

专利名称：：亲水性优异的新型填充剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种由有机化合物形成的填充剂，所述有机化合物对在水溶液中溶解的物质(特别是蛋白质)显示吸附、脱离作用，适合于目标物质的捕集和通过液相色谱法进行分离纯化。更具体地讲，本发明涉及对高浓度的碱水溶液化学稳定性高、亲水性优异，可用于蛋白质的分离、纯化的新型填充剂。
背景技术：
：作为蛋白质的吸附、分离、纯化中使用的色语用填充剂，有以二氧化硅化合物等为代表的无机类填充剂和由有机聚合物形成的有机类填充剂.有机类填充剂大致可以分成使用以苯乙烯、(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺类为代表的合成化合物的合成类填充剂，和使用以琼脂糖(Agarose)、葡聚糖、甘露聚糖等为代表的天然多糖类的天然类填充剂。合成类填充剂，一般是例如专利文献1~3所公开的那样，使用甲基丙烯酸缩水甘油酯与乙二醇二甲基丙烯酸酯那样的单官能性单体与多官能性单体的混合液，通过悬浮聚合法等制备，然后用水溶性的多元醇等进行亲水化来制备基材。随着近年来合成类填充剂中的亲7JC化技术的进步，已经发现了制造在亲水性上不逊色于天然类的合成类填充剂的方法。另外，具有如下优点，由于一般使用单官能性单体和多官能性单体，用悬浮聚合制备粒子的方法，所以可以通过调节多官能性单体的添加量来自由设计从硬到软的填充剂。从要制备硬且不脆的填充剂的观点出发，在合成类填充剂的情况下，一般使用容易得到高分子量的聚合物的(甲基)丙烯酸酯类或(甲基)丙烯酰胺类单体来制备填充剂。并且，从粒子化后容易形成与蛋白质相互作用的配位子的观点出发，提出很多使用了具有作为反应基点的缩水甘油基的所谓的甲基丙烯酸缩水甘油基酯(GMA)单体的填充剂。如上所述，这些填充剂的主要用途是通过液相色谱法分离纯化蛋白质。作为被纯化的蛋白质的主要用途是医药品(注射用蛋白质制剂)，在该领域中要求彻底排除污染物质的污染导致的副作用隐患。作为可混入的污染物质，可以认为有(1)来自目标蛋白质的生产工序的，例如，培养液、血清等中含有的异种蛋白质、核酸、内毒素(endotoxin)、病毒，(2)生产、保存中必要的添加物等成分，和来自纯化工序中使用的器具、填充剂、分离剂、溶液等的污染成分，(3)在前次纯化中吸附在填充剂中没有溶出的成分，等等。将填充剂填充在柱子中，在纯化工序中使用，但首次使用前，以及再次使用前必须经检验过的洗净方法进行洗净。最一般的纯化工序的装置内部的洗净方法是用1N氢氧化钠洗净。这是由于1N氢氧化钠可分解洗净蛋白质、内毒素等的缘故。美国食品医药品局的指南(guideline)中推荐该洗净方法，在首次和再次使用时也是有效的方法。即，每一批次使用，一般都要对进行医药用蛋白质纯化的GMP设施，进行柱子装置内部的洗净。另外在有批次间隔的情况中，有时在柱子中封入净皮稀释至0.01N0.1N的氢氧化钠水溶液，停放装置。进而，为了除去朊病毒(Prion)等异常蛋白质，需要用更高浓度(例如2N浓度的氢氧化钠水溶液进行洗净。然而，由于GMA单体具有显示高亲水性的酯基部位，所以与碱性药品长时间接触，会使酯水解，释放醇化合物，生成羧酸。如果可以通过洗净完全除去释放出的醇，则不存在问题，但如果不能除去，则它有可能成为污染物质。另外，通过生成羧酸，填充剂本来的性能发生改变，失去了分离纯化再现性，所以会出现纯度不好的问题。即对于耐碱性弱的填充剂而言，不仅性能恶化使可使用期间变短，而且还存在发生未知溶出物的隐患、纯化操作时的溶出造成污染的隐患、和性能恶化造成发生纯度不良等问题。上述那样的合成类填充剂，由于较硬(机械强度高)，所以具有适于高速.高分离的优点，并且具有高亲水性的优点，但另一方面，目前的现状是期待具有更好的耐碱性的合成类填充剂的开发.专利文献1:特公昭58-058026号公才艮专利文献2:特开昭53-0卯991号公才艮专利文献3:特开平05-009233号公报
发明内容本发明是鉴于上迷课题而作出的，其目的在于提供适于高速.高分离，富有亲水性，并且对高浓度的碱水溶液具有耐性的填充剂，更加详细地说，本发明提供一种具有可适用于高速高分离的M强度，具有为不引起对蛋白质的非特异吸附的充分的亲水性，进而，即使在高浓度的碱水溶液中浸渍，蛋白质的吸附量、保持力等的变化也较小的新型填充剂。本发明者们，为了解决上述课题，进行了反复深入的研究，结果发现使用显示聚合性的(甲基)丙烯酰化合物中的具有特定结构的化合物作为单体的填充剂，具有耐碱性。本发明是基于上述认识完成的。即，本发明如下所示，是亲水性优异的新型填充剂、其制备方法、和使用该填充剂的蛋白质的分离方法。1一种填充剂，其特征在于由交联聚合物粒子形成，所述交联聚合物粒子含有2095mol。/。的从下式(1)所示的(甲基)丙烯酰类单体衍生出的重复单元，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式(l)中，W表示氩原子或碳数14的烷基，Ri表示-NR、R、R5或-0-R4-R5，W表示氢原子或碳数l4的烷基，W表示含有脂肪族环的碳数为6~15的亚烷基、或碳数为48的直链亚烷基，RS表示卤素原子、醇性OH基、、缩氷甘油基、或环氧基，当R5是环氧基时，该环lt^可以是向R4中所含的脂肪族环的一部分直接导入的环氧基，也可以以侧链形式附加到脂肪族环上的环氧基，另外，当RS是缩水甘油基时，以缩水甘油醚的形式与114结合。或m所述的填充剂，由上式(1)所示的(甲基)丙烯酰类单体和多官能性单体聚合得到的交联聚合物粒子形成。[5I的任一项所述的填充剂的制备方法，使含有2095mol。/。的上式(1)所示的(曱基)丙烯酰类单体和交联剂的单体混合物，以及悬浮稳定剂在水相中悬浮、进行聚合。[5的任一项所述的填充剂，在其粒子表面具有亲水性基团。问的任一项所述的填充剂与亲水化剂作用而得到的。所述的填充剂，在使用普鲁兰作为标准物质，使用纯水作为洗脱液的情况下，分子量排除极限为50万~200万。的任一项所述的填充剂，其粒子表面具有离子交换基团。上述[131所述的填充剂，是使形成上述[l[5]的任一项所述的填充剂的交联聚合物粒子中含有的环氡基团开环，导入离子交换基团而形成的。15]上述13所述的填充剂，是4吏形成上述10]~[12]的<壬一项所述的填充剂的交联聚合物粒子环氧化，然后使环氧基团开环，导入离子交换基团而形成的。[15的任一项所述的填充剂，离子交换基团是选自磺酸基、羧基、伯氨基、仲氨基、叔氨基、和季铵基中的至少l种。[17〗一种蛋白质的分离方法，作为色i昝用填克剂使用上述[13~16的任一项所迷的填充剂。本发明的填充剂，由于硬度、机械强度高，所以可以在高速下使用，对高浓度的碱水溶液化学稳定性高。另外，通过在本发明的填充剂的反应基点导入取代基，可容易地调制出亲水性优异的填充剂和具有离子交换基的填充剂，适合于蛋白质的分离纯化。具体实施例方式首先，对本发明的填充剂[下面，称作填充剂(l)l予以说明，所述填充剂的特征在于，由交联聚合物粒子形成，所述交联聚合物粒子含有2095mol。/。的从上式(1)所示的(甲基)丙烯酰类单体衍生出的重复单元。在本发明中，作为填充剂(1)没有特殊限定，作为优选例可以列举出例如，由下述交联聚合物粒子形成的填充剂，所述交联聚合物粒子含有2095mol。/。的从上式(1)所示的(甲基)丙烯酰类单体衍生出的重复单元、和805mol。/。的从多官能性单体衍生出的重复单元。更具体地讲，作为优选例可以列举出，由下述交联聚合物粒子形成的填充剂，所述交联聚合物粒子含有2095mol。/n的上式(2)所示的重复单元、和805mol。/。的上式(3)所示的重复单元。在本发明中，作为填充剂(1)的制备方法，没有特殊限定。例如，可以通过使含有2095mol。/。的上式(1)所示的(甲基)丙烯酰类单体和交联剂的单体混合物，与悬浮稳定剂在水相中悬浮、进行聚合来制备。更加具体地讲，可以通过使含有2095mol。/。的上式(1)所示的(甲基)丙烯酰类单体和805mol。/。的作为交联剂使用的多官能性单体的单体混合物，与悬浮稳定剂一起在7jc相中悬浮、进行聚合来制备。下面，对使用上式(1)所示的(甲基)丙烯酰类单体的填充剂(1)的一般制备方法进行说明，但制备方法并不限于这些。首先作为连续相，向例如蒸馏水中添加规定的表面活性剂，进而根据需要添加无机盐，充分搅拌使之溶解，形成水溶液。然后，将该水溶液升温至规定的温度。然后，分别量取规定量的本发明的(甲基)丙烯酰类单体、作为交联剂使用的多官能性单体、聚合引发剂，进而根据需要量取规定量的其他单体和为了调节细孔而添加的有机溶剂等，制成调节混合液。然后向正在搅拌的加有表面活性剂的水溶液中滴入该调节混合液，使之液滴化，同时在规定的温度下进行聚合，制备聚合物粒子。对于此时的聚合温度，只要是可使聚合引发剂分解，产生自由基的温度就没有特殊限定。一般，优选在2080TC的范围，更优选在4070。C的范围进行聚合。本发明的填充剂(1)中使用的(甲基)丙烯酰类单体，只要是相当于上式(1)的，具有用于在交联聚合物粒子化后导入取代基的反应基点的(曱基)丙烯酰类单体，就没有特殊限定。可以列举出例如，(甲基)丙烯酸4-羟基丁基酯缩水甘油基醚、(甲基)丙烯酸6-氯己基酯、(甲基)丙烯酸4-溴丁基酯、(甲基)丙烯酸4-羟基丁基酯、(甲基)丙烯酸羟基戊基酯、6-氨基己基(甲基)丙烯酰胺、(曱基)丙烯酸3,4-环氧环己基曱基酯、(甲基)丙烯酸3,4-二羟基环己基甲基酯以及其二羟基的一部分或全部被缩水甘油基取代的化合物；(甲基)丙烯酸3，4_环氧环己基乙基酯、(甲基)丙烯酸3，4-二羟基环己基乙基酯及其二羟基的一部分或全部被缩水甘油基取代的化合物；(曱基)丙烯酸3,4-环氧环己基丙基酯、(曱基)丙烯酸3,4-二羟基环己基丙基酯及其二羟基的一部分或全部被缩水甘油基取代的化合物；2，5-二(氨甲基)双环[2，2，1庚烷的一个氨基与(甲基)丙烯酰卣的反应物；2，5-二(羟曱基)双环[2，2，11庚烷的一个羟基与(甲基)丙烯酰卤的反应物；2，6_二(氨曱基)双环[2，2，11庚烷的一个氨基与(甲基)丙烯酰卤的反应物；2，6-二(羟曱基)双环[2，2，1庚烷的一个幾基与(曱基)丙烯酰闺的反应物；1，3-二羟基金刚烷的一个羟基与(甲基)丙烯酰卣的反应物；1,3-二M金刚烷的一个氨基与(曱基)丙烯酰卣的反应物等。另外，上述(甲基)丙烯酰类单体可以单独使用，也可以混合使用。在本发明的填充剂(1)中，上式(1)所示的(曱基)丙烯酰类单体的比例，在全部单体中，通常在20mol。/o以上95molo/。以下的范围，优选在30mol。/。以上93mol。/。以下的范围。作为优选该比例的理由是，如果(甲基)丙烯酰类单体小于20mo1。/。，则存在下述那样的问题。即(a)对碱稳定性降低，(b)生成粒子中用于导入取代基的反应基点变少，即使是用亲水化剂赋予亲水性，也得不到在蛋白质等的分离中所必需的亲水性，(c)如果比例大于95mol%,则作为交联剂共聚的多官能性单体比例过小，填充剂变软，等等。作为本发明的填充剂(1)中使用的多官能性单体，没有特殊限定。可以列举出例如，二乙烯基苯；碳数为1~4的亚烷基二醇的重复单元数为1~5的亚烷基二醇-二(甲基)丙烯酸酯类；亚烷基(碳数111)二(甲基)丙烯酸酯类；亚烷基(碳数111)二(甲基)丙烯酰胺类等。可与上式(l)所示的(甲基)丙烯酰类单体共聚的多官能性单体并不限于这些。进而，也可以将在合成本发明的(甲基)丙烯酰类单体时所生成的副产物即2官能性化合物，作为交联剂即可共聚的多官能性单体来使用。如果列举出作为多官能性单体的具体的化合物例子，则可以列举出，二乙烯基苯、二乙烯基曱苯、二乙烯基二甲苯、1，3-金刚烷二甲基丙烯酸酯、乙二醇二(曱基)丙烯酸酯、二甘醇二(曱基)丙烯酸酯、三甘醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(曱基)丙烯酸酯、甘油二(曱基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、亚乙基二丙烯酰胺等。在本发明的填充剂(1)中，多官能性单体的比例没有特殊限定，但在全部单体中，通常在5mol。/。以上80mol。/o以下的范围，优选在7moI。/。以上70molo/。以下的范围。作为优选该比例的理由是，如果多官能性单体小于5mol%，则填充剂得不到充分的^JL，在高压力下填充剂有可能崩溃。另外，如果交联剂为80mol。/。以上，则用于向生成粒子中导入取代基的反应基点变少，即使用亲水化剂赋予亲水性，也不能得到蛋白质等分离中所必需的亲水性。进而，不仅对碱的稳定性变低，而且有时填充剂变脆，存在向柱子的填充操作、搅拌等中产生微粒子等问题。在本发明的填充剂(1)中，除了上式(1)所示的(曱基)丙烯酰类单体、上述多官能性单体以外，还可以在不违背本发明的宗旨的范围内使用其他的单体。作为这样的其他的单体，可以列举出例如，(甲基)丙烯酸羟乙基酯、(甲基)丙烯酸羟丙基酯、(甲基)丙烯酸缩水甘油基酯、(甲基)丙烯酸碳数为1~3的直链状或支链状的烷基酯类等(曱基)丙烯酸酯化合物；羟乙基(甲基)丙烯酰胺、羟丙基(甲基)丙烯酰胺、羟丁基(甲基)丙烯酰胺、碳数为1~3的直链状或支链状的烷基(曱基)丙烯酰胺类等的聚合性(甲基)丙烯酰胺化合物；芳基胺、芳基氯、芳基缩水甘油基醚等聚合性芳基化合物；卤代烷基(碳数1~4)乙烯基醚、羟基烷基(碳数1~4)乙烯基醚、乙酸乙烯基酯等聚合性乙烯基化合物等。并用的其他单体只要可满足本发明的功能，就没有特殊限定。另外，这些并用的其他单体可以单独使用，也可以混合使用。作为在本发明的填充剂(1)的制备中使用的聚合引发剂，可以列举出例如，通常在悬浮聚合中使用的有机过氧化物、偶氮类化合物等。作为上述有机过氧化物，在丁基过氧化物类中可以列举出例如，过氧化新癸酸叔丁基酯、过氧化2-乙基己酸叔丁基酯、过氧化异丁酸叔丁基酯、2，5-二甲基-2，5-二(过氧化苯甲酰基)己烷、过氧化乙酸叔丁基酯、过氧化苯甲酸叔丁基酯等。在戊基过氧化物类中，可以列举出过氧化2-乙基己酸叔戊基酯、过氧化正辛酸叔戊基酯、过氧化乙酸叔戊基酯、过氧化苯甲酸叔戊基酯等。在过氧化碳酸酯类中，可以列举出过氧化异丙基碳酸叔丁基酯、过氧化2-乙基己基碳酸叔丁基酯、过氧化2-乙基己基碳酸叔戊基酯、二(2-乙基己基)过氧化二碳酸酯、二(仲丁基)过氧化二碳酸酯等。在二烷基过氧化物类中，可以列举出过氧化二枯基、2，5-二甲基-2,5-二(过氧化叔丁基)己烷、过氧化二叔丁基、过氧化二叔戊基等。另外，在过氧化缩酮类中，可以列举出l，l-二(过氧化叔丁基)环己烷、2，2-二(过氧化叔丁基)丁烷、乙基-3，3-二(过氧化叔丁基)丁酸酯、l，l-二(过氧化叔戊基)环己坑等。另一方面，作为偶氮类化合物，在偶氮腈类中，可以列举2，2，-偶氮二(4-曱氧基-2，4-二曱基戊腈)、2，2，-偶氮二(2，4-二甲基戊腈)、2，2，-偶氮二(2-甲基丙腈)、2，2，-偶氮二(2-甲基丁腈)、l，l，-偶氮二(环己烷陽l國甲腈)等。在偶氮酰胺类中，可以列举出2,2，-偶氮二1^-(2-丙烯基)-2-甲基丙酰胺I、2,2，-偶氮二N-丁基-2-甲基丙酰胺、2,2，-偶氮二[^环己基-2-曱基丙酰胺等。进而，还可以列举出其他偶氮类化合物中的2,2，-偶氮二(2-曱基丙酰胺肟)、2,2，-偶氮二(2-甲基丙酸曱酯)、4，4，-偶氮二(4-氰基戊酸)、2，2，-偶氮二(2，2,4-三甲基戊烷)等。但只要是可以使(曱基)丙烯酰类单体聚合的聚合引发剂就可以使用，并不特别限定于上述化合物。这些聚合引发剂的添加量如果过少，则有时聚合率降低，单体大量残留。如果过多，则在聚合物粒子中残留聚合引发剂，给蛋白质等的吸附分离带来不好的影响。因此，通常聚合引发剂相对于全部单体，在0.05重量％~20重量％的范围使用，优选在0.2重量％10重量％的范围使用。在本发明中，作为在悬浮聚合中使用的悬浮稳定剂，只要是在连续相中可溶解的表面活性剂就没有特殊限定。可以列举出例如，阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂等，可以使用任一种。另夕卜，关于悬浮稳定剂的分子量没有特殊限定，可以使用低分子化合物，也可以使用高分子化合物。作为具体例，作为阴离子表面活性剂，可以列举出脂肪酸盐、高级醇的硫酸酯盐、脂肪醇的磷酸酯盐、烷基芳基磺酸盐、福尔马林缩合M酸盐等。作为阳离子表面活性剂，可以列举出烷基伯胺盐、烷基仲胺盐、烷基叔胺盐、烷基季铵盐、吡梵吝t盐等。作为非离子表面活性剂，可以列举出聚氧乙烯烷基醚类、聚氧乙烯烷基苯基醚类、聚氧乙烯烷基酯类、失水山梨糖醇烷基酯类、聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯类。另一方面，作为高分子表面活性剂，可以列举出部分皂化的聚乙烯醇、淀粉、甲基纤维素、羧曱基纤维素、羟乙基纤维素、部分皂化的聚甲基丙烯酸盐等。在本发明中，除了上述表面活性剂以外，根据需要，还可以进一步添加无机盐，例如硫酸钡、硫酸钾、硫酸铝、碳酸钓、滑石等。上述悬浮稳定剂的添加量，没有特殊限定，通常相对于连续相在0.01重量％~30重量%的范围，优选在0.1重量％~15重量％的范围。在色i普用填充剂中，已知有吸附负荷量较多的多孔性填充剂，和为了抑制细孔内的溶质分子扩散造成分离带变宽，以实现高分离性能而使用的非多孔性填充剂。本发明的填充剂，没有特殊限定，可以根据不同的制备方法制备多孔性、非多孔性中的4壬一种填充剂。在多孔性填充剂的情况中，需要调节细孔径。下面示出了调节方法的一个例子，但本发明并不限定于该方法。这里，由于以调节细孔为目的而添加的有机溶剂，受到所使用的本发明的(甲基)丙烯酰类单体的量和种类、与多官能性单体和其他单体的量比、多官能性单体的种类和量、聚合引发剂的种类和量、聚合温度等的影响，因此不能一概而论。一般来讲，如果使用对生成的聚合物粒子溶胀性高的有机溶剂，则可以制备细孔径小的聚合物粒子，而如果使用可以溶解单体但不能溶解聚合物的不良溶剂，则可以制备细孔径大的聚合物粒子。作为以调节细孔为目的而添加的有机溶剂的例子，可以列举出曱苯、二甲苯、二乙基苯、十二烷基苯等芳香族烃类；己烷、庚烷、癸烷等饱和烃类；异戊醇、己醇、辛醇等醇类，等等。其中，只要是对水为不溶性的，但可以溶解使用的单体和聚合引发剂的有机溶剂就没有特殊限定。以调节细孔为目的而添加的有机溶剂的添加量会影响填充剂的孔隙率(表示填充剂粒子的细孔容积相对4^容积的比例)。孔隙率根据填充剂的使用目的的不同而变化，不能一概而论。一般:使用孔隙率为40%~90%范围的填充剂，更加优选孔隙率为55%~80%范围的填充剂。这是由于，如果孔隙率偏离该范围，则与使填充剂吸附更多的蛋白质等水溶性化合物的目的相偏离，所以功能上不优选。孔隙率的调节，一般由添加的有机溶剂相对全部单体的比例决定，如果使用大量的有机溶剂，则孔隙率变大，如果使用的有机溶剂少，则孔隙率变小。但如果改变单体的反应率，或制备高孔隙率的聚合物粒子后，将粒子表面用别的化合物包覆，也可以改变孔隙率，所以并不限定于上述的方法。另一方面，在制备非多孔性填充剂的情况下，不添加调节细孔的有机溶剂，作为调节混合液使用(曱基)丙烯酰类单体、多官能性单体和聚合引发剂来制备。另外为了使细孔容积少且细孔径小，优选多官能性单体的比率在10mol。/。以上80mol。/。以下的范围。本发明的填充剂(1)的平均粒径，根据使用目的和蛋白质的纯化量来设定，所以不能一概而论。例如，在多孔性填充剂的情况中，通常在m500jLim，优选在5Mm~300um的范围。另一方面，在非多孔性填充剂的情况中，通常在1.5lim60pm,优选在2|im30pm的范围。如果粒径过小，则在高速分离纯化蛋白质等时，装有填充剂的柱子内的压力损失变大，需要使用耐压容器，设备上需要花费巨大的费用。另外，如果粒径过大，则水溶液中的蛋白质到ii^立子表面需要较长时间，蛋白质向粒子的移动速度降低，出现扩散的问题。因此，平均粒径优选上述范围。这样制备的交联聚合物粒子内含有为了调节细孔而添加的有机溶剂、微量的残留单体等夹杂物。因此，一般用例如丙酮、四氢呋喃等水溶性有机溶剂洗净粒子，除去该夹杂物后，进行亲水化>^应、离子交换基的导入等取代基的导入。下面，对本发明的特征在于在上述填充剂(1)的粒子表面存在亲水性基团的填充剂以下称作填充剂(2)l进行说明。本发明的填充剂(1)中使用的交联聚合物粒子，具有用于导入取代基的反应基点，即卤素原子、醇性OH基、氨基、缩水甘油基、或环氧基。因此，通过与亲7jc化剂作用，可以容易地赋予交联聚合物粒子亲水性。这里所用的亲水化剂可以含有2个以上活性氢，但没有特殊限定。可以列举例如，水；以乙二醇、二甘醇、三甘醇等为代表的氧亚乙基重复单元为20个以下，更优选为IO个以下的二醇类等；以甘油、山梨糖醇为代表的多元醇类等。除此以外，多官能环氧化物的水解物等也可以作为多元醇使用。进而，在作为亲水化剂使用的化合物中，可以使用反应前显示疏水性，反应后显示亲水性那样的化合物作为亲7jC化剂。可以列举出例如，山梨糖醇聚缩7jC甘油醚类、失水山梨糖醇聚缩水甘油醚类、季戊四醇聚缩水甘油醚类、甘油聚缩水甘油醚类、新戊二醇二缩水甘油醚类等。在使用这样的亲水化剂，与交联聚合物粒子进行反应后，根据需要可以使残留的环fL^与上述的具有2个以上活性氢的化合物进行进一步反应。只要是显示这样的水溶性的二幾基化合物、多羟基化合物或反应后显示亲水性的化合物，均可以作为亲水化剂使用。在本发明中，使用上式(1)所示的(甲基)丙烯酰类单体进行聚合，在用水溶性有机溶剂洗净后得到的交联聚合物粒子中，如上所述，含有作为反应基点的卤素原子、醇性OH基、氨基、缩水甘油基或环氧基等。下面根据不同的反应基点来说明亲水化方法。在反应基点是卤素原子时，可以列举在水溶液中*!"在下，通过使卤素基水解转化成OH基的方法，或者在碱催化剂下，使之与含有2个以上OH基的化合物进行所谓的威廉逊制醚反应(WilliamsonReaction)从而固定化的方法等。在反应基点是醇性OH基时，可以列举出在碱催化剂下，例如与上述的环氧化合物进行反应，进而根据需要，使残留的环氡基与多元醇进行反应的方法。另外还可以列举出在碱催化剂下，使用表氯醇进行环氧化后，将含有2个以上OH基的化合物固定化的方法。在反应基点是氨基时，可以列举出与上述的环氧化合物进行反应，进而根据需要，使残留的环氧基与多元醇进行反应的方法，另外还可以列举出使用表氯醇进行环氧化后，将含有2个以上OH基的化合物固定化的方法。在反应基点是缩水甘油基或环氧基时，可以列举出在酸或碱催化剂的存在下，将含有2个以上OH基的化合物固定化的方法。这样得到的本发明的填充剂(2)的分子量排除极限，在使用普鲁兰作为标准物质，使用纯水作为洗脱液的情况下，优选在50万200万的范围。本发明的填充剂(2)，可以作为例如色语用亲7jC化基材使用。一般对于以生物高分子的分离纯化为目的的色镨用亲水化基材而言，在用盐浓度为O.lmol/1的中性洗脱液进行溶出时，优选在对象生物高分子与填充剂没有相互作用的情况下进行溶出。也就是说，如果亲水性基材是多孔性基材，则基于体积排阻色镨(sizeexclusionchromatography:以下简称SEC)的原理，从分子体积大的分子开始按顺序溶出，优选以不大于柱子中全部洗脱液量的溶出容量溶出全部分子。在本发明中，这样的亲水化基材的物性和化学结构优选满足以下那样的必要条件。亲水性基材的物性，基本是由细孔物性、机械强度、以及粒径分布和形状决定的。细孔径分布和孔隙率可以决定大部分细孔物性。适当的细孔物性依赖于分离目的、方法和对象高分子的分子尺寸。例如，对象是一般的球形蛋白质(globularproteins)时，如果是脱盐用、非多孔性填充剂用基材，则细孔径优选分子量排除极限为5千(以普鲁兰分子量校准)以下，孔隙率在脱盐用途中，优选尽可能大，6095%较合适。另一方面，对于非多孔性填充剂用基材而言，为了提高机械强度，孔隙率相反是优选尽可能小的，20%以下的较合适。在蛋白质的SEC分离用途中，分子量排除极限优选为5千~50万(以普鲁兰分子量校准)。另外，为了将离子交换基、疏水性基、或亲和用配体固定在基材上，优选分子量排除极限为1万~500万(以普鲁兰分子量校准)，孔隙率为50~95%。在多孔性填充剂用基材的情况中，无论哪一种分离方法，孔隙率越大，粒径反而越小，则单位体积的分离性能越高。如果孔隙率变大，则填充剂的机械强度变弱，洗脱液通过时易变形，所以孔隙率优选为95%以下。特别是作为以分析为目的的高性能液相色谱用填充剂的基材时，孔隙率优选为柳V。以下。如果粒径变小，则填充柱的单位高度的压力损失增加，需要逐渐提高机械强度。因此，为了使洗脱液以合适的流速流通，需要提高填充剂的机械强度，还必须调节孔隙率和粒径4吏压力损失不高于必要以上。另外，如果填充剂的形状不是球形的，则在填充于柱子时，填充剂形成桥连(bridge)，出现空隙，不能最紧密地填充。因此实际应用中，溶出峰形状变为非对称的，峰变宽，成为性能低下的柱子。因此，填充剂的形状优选球形。另外，作为亲水性基材的化学结构，需要易修饰官能团，所述易修饰的官能团作为用于合成各种填充剂的基点。优选在表面具有醇性羟基，使得可以在溶质与官能团的固有的相互作用不受妨害下进行固定化。即优选在细孔内部和外部表面具有较多醇性羟基、未离子化的极性官能团。较为理想的是没有妨碍目标溶质与导入的官能团的固有相互作用的官能团，并且用筒单修饰就可掩蔽(masking)的范围。即优选离子性基团、疏水性基团尽可能少。下面，对特征在于在本发明的填充剂(1)或填充剂(2)的粒子表面存在离子交换基的填充剂[以下称作填充剂(3)予以说明。作为本发明的填充剂(3)具有的离子交换基团，没有特殊限定，但作为优选例可以列举出磺^、M、、季铵基。在本发明中，作为向填充剂(1)或填充剂(2)导入离子交换基的方法，没有特殊限定。可以列举出例如，使用上式(1)的(甲基)丙烯酰单体进行聚合，用水溶性有机溶剂洗净后，在聚合物粒子中具有作为反应基点的缩水甘油基或环氧基的情况，通过使用亚硫酸钠或酸性亚硫酸钠，使环氧基开环导入磺g，可制成阳离子交换树脂。另外，如果使用伯氨基、仲氨基、叔氨基来代替亚硫酸钠类，使环氧基开环而导入氨基，可以制成阴离子交换树脂。除此以外，可以使用作为填充剂(2)使用的亲水化的交联聚合物粒子，通it^氯醇进行环氧化，然后导入亚硫酸钠类或胺类，可调制成本发明的填充剂(3)。作为这里使用的胺类，没有特殊限定。可以列举出氨、碳数为1~4的烷基胺、碳数为1~4的二烷基胺、碳数为14的三烷基胺、羟基烷基(碳数14)胺、二羟基烷基(碳数14)胺、三羟基烷基(碳数14)胺、N-羟基乙基哌溱、N-氨基乙基哌溱、吗啉、乙二胺、二亚乙基三胺等。在反应基点是卣素原子时，如果使用上述胺类进行反应，可以制成阴离子交换树脂。另外在反应基点是氨基时，可以将其直接作为阴离子交换树脂使用。进而如果需要，也可以使表氯醇介在，进一步导入氨基。在反应基点是醇性OH时，如果使用溴代乙磺酸、单氯代乙酸、1,3-丙烷磺酸内酯进行反应，则可以制成阳离子交换树脂。另外，如果使用2-氯乙基二乙胺盐酸盐、缩水甘油基三甲基氯化铵等进行反应，则可以制成阴离子交换树脂。进而如果使用表氯醇进行反应，则可以导入环氧基。这样得到的本发明的填充剂(3),例如，可以作为色谱用填充剂，在蛋白质等生物高分子的分离纯化时使用。以生物高分子的分离纯化为目的的离子交换色谱用填充剂，是在亲水化基材的说明中所述的基材上固定了同类的阳离子交换基团或阴离子交换基团而成的填充剂。这样的填充剂的大部分物性依赖于基材，但通过导入离子交换基团，在改变洗脱液的盐浓度时，可以改变粒子内外部分的渗透压。通过这样的作用，填充剂在低盐浓度下溶胀，在高盐浓度下收缩。在蛋白质的离子交换色谱中，多使用逐渐增加盐浓度，W目互作用小的蛋白质开始按顺序溶出的方法。此时溶胀收缩比大的填充剂，柱床(columnbed)容积变化大，填充状态每一次都变化，不能实现再现性良好的分离。溶胀收缩比的大小，是由基材骨架(matric)的强度(硬度)和离子交换容量决定的。一般离子交换容量越大，影响越大。因此，基材骨架难以溶胀收缩，且离子交换容量不超过必要以上的是较好的。具体地讲，离子交换容量为30300meq/1是合适的范围。另外，对于其他的生物高分子，例如核酸(DNA,RNA)离子交换容量优选为200meq/1以下，对于肽、低聚糖等，离子交换容量优选50~500meq/l。离子交换色谱的溶出方法，有通常的上述逐渐增加盐浓度从而溶出的方法，改变洗脱液的pH以使pH从目标溶质与离子交换基结合的pH向目标溶质与离子交换基排斥的pH逐渐变化的方法，或这两种方法的组合方法等。由于除此之外在再生、洗净等中也^f吏用碱溶液，所以优选基材骨架难以溶胀收缩的填充剂。实施例以下通过实施例来详细说明本发明的填充剂及其制备方法，但本发明并不受这些实施例的限定。制备例1首先，将皂化率88%、聚合度3500的聚乙烯醇(悬浮稳定剂)1.5g和l升水装入带有搅拌器的反应器中，进行充分搅拌，使聚乙烯醇在水中溶解。然后调节该水溶液成60'C，将其作为调节水溶液。接着，制作由45g甲基丙烯酸缩水甘油酯、15g乙二醇二曱基丙烯酸酯、65g氯苯、0.3g偶氮二异丁腈形成的调节混合液，一边搅拌，一边将该调节混合液滴入到60'C的上述调节水溶液中。接着，搅拌下使该悬浮物在60'C下聚合6小时。然后，将反应器冷至室温，过滤生成物，多次用温水进行洗净，然后用二喁烷洗净，从而得到粒状的凝胶(交联聚合物粒子)。〈亲7JC化基材的调制〉将所得的粒状凝胶进一步用水进行充分洗净，然后将20g该聚合物与200ml的0.5N石克酸水溶液进行充分混合，将其在水浴上加热至卯"C，进行5小时反应，使环氧基进行7jc解反应。然后，用水进行充分洗净，在水浴中进行筛分级，得到粒径40lim90um的粒状凝胶。将该凝胶作为亲水化基材l。〈含水率的测定〉用凯特(亇、乂卜)式水分计，从120C下加热15分钟后亲水化基材1减少的重量求出亲水化基材1的含水率。结果含水率为57.2%。〈环氧基的定量〉将约2g的亲水化基材1加入容量200ml的带塞的三角烧瓶中，然后称量。接着，向该烧瓶内准确加入25ml的约0.2M-盐^/二噍烷溶液，加入搅拌子，温和地在室温下搅拌3小时。接着，向该烧瓶内加入SOml的乙醇和lml的酚酞溶液，用O.lN-NaOH溶液滴定，求出残留的盐酸量。另外，同时用O.lN-NaOH溶液滴定该约0.2M-盐酌二巧悉烷溶液，求出其中的盐酸浓度，进而，将该2g的亲水化基材1加入容量200ml的带塞三角烧瓶，称量，加入75ml的乙醇，在室温下搅拌约30分钟，以酚酞溶液为指示剂，用O.lN-NaOH溶液滴定，求出所测定凝胶中的酸价。从这样得到的残留盐酸量、酸价、凝胶的含水率求出每lg干燥凝胶的环氧量。该亲水化基材的环氧量是每lg干燥凝胶为0.3mmo1以下。〈分子量排除极限和孔隙率的测定〉使用亲水化基材1的凝胶浆水溶液，以成为最致密填充那样将亲7jc化基材l填充至内径10.7mm、长150mm的不锈钢制柱子中。接着，将该柱子安装在配备有RI-8000检测器(东y—社制)的HLC-803D(东V—社制)上。接着，标准物质^f吏用分子量4000万的葡聚糖和各种分子量的普鲁兰，以0.5ml/分钟的流速注入各种分子量的标准物质，从其溶出容量求出分子量排除极限。另外，从葡聚糖和乙二醇的溶出容量和柱容积求出孔隙率。亲水化基材l粒子的分子量排除极限为IOO万，孔隙率为62%。〈M化填充剂的调制〉将所得的亲水化基材1用纯水洗净，吸滤，然后将50ml的亲水化基材1转移至300ml的可拆分式烧瓶中，加入20ml纯水、加ml的35%氢氧化钠水溶液，搅拌混合。接着，一边将反应温度保持在3s"ox:，一边用4小时滴入33g的表氯醇和39g二乙氨基乙醇，然后进一步在40匸下继续反应5小时。反应结束后，吸滤反应液，依次用纯水、0.5N盐酸、再次纯水进行洗净，将反应所得的填充剂作为#^化填充剂1。制备例2除了使用由49g甲基丙烯酸缩水甘油酯、llg乙二醇二甲基丙烯酸酯、65g氯苯、0.3g偶氮二异丁腈形成的调节混合液以外，其他与制备例1一样，用同样的方法一边搅拌，一边将该调节混合液滴入到调节至幼x:的调节水溶液中。接着，搅拌下使该悬浮物在60。C下聚合6小时。然后，将反应器冷至室温，过滤生成物，多次用温水进行洗净，然后用二，恶烷洗净，得到粒状:^(交联聚合物粒子)。将25g上迷粒状凝胶、200g聚乙二醇(平均分子量200)和100g二嗜、烷进行克分混合，接着向其中加入lml三氟化硼乙醚配合物，搅拌下加热至85iX:，继续加热4小时。接着，将反应物冷至室温，用水充分洗净，在水浴中进行筛分级，得到粒径40Mm90ym的粒状凝胶。将该凝胶作为亲水化基材2。依照制备例1所述的方法测定亲水化基材2的物性。结果含水率为55.9%,残留的环氧量，每lg干燥基材为0.3mmol以下，分子量排除极限为IIO万，孔隙率为63.2%。进而，依照制备例l所述的方法，向亲水化基材2导入氨基。将该反应得到的填充剂作为M化填充剂2。制备例3除了使用由56g甲基丙烯酸缩水甘油酯、4g乙二醇二曱基丙烯酸酯、65g氯苯、0.3g偶氮二异丁腈形成的调节混合液以外，其他与制备例l一样，用同样的方法一边搅拌，一边将该调节混合液滴入到调节至60'C的调节水溶液中。接着，搅拌下使该悬浮物在60X:下聚合6小时。然后，将反应器冷至室温，过滤生成物，多次用温水进行洗净，然后用二悉烷洗净，得到粒状凝胶(交联聚合物粒子)。将25g上述粒状劍吏、200g聚乙二醇(平均分子量200)和100g二巧悉烷进行充分混合，接着向其中加入lml三氟化硼乙醚配合物，搅拌下加热至85X:，继续加热4小时。接着，将^Ji物冷至室温，用水充分洗净，在7jc浴中进4亍筛分级，得到粒径40jam90jLim的粒状^。将该^M作为亲^c化基材3。依照制备例1所述的方法测定亲7JC化基材3的物性。结果含水率为69.4%,残留的环氧量，每lg干g材为0.3mmol以下，分子量排除极限为165万，孔隙率为69.4%。进而，依照制备例l所述的方法，向亲水化基材3导入氨基。将该反应得到的填充剂作为M化填充剂3。制备例4将皂化率88%、聚合度3500的聚乙烯醇(悬浮稳定剂)10g溶解在1升水中形成水溶液，使由甲基丙烯酸3，4-环氧环己基甲酯、16g乙二醇二甲基丙烯酸酯、140g乙酸丁酯、31g氯苯、1.4g过氧化新戊酸叔丁酯形成的混合物悬浮在上述水溶液中。一边继续搅拌，一边将该混合物在60t:下加热6小时，进行聚合。将反应液冷至室温，用玻璃过滤器过滤所生成的粒状的皿态聚合物。将该聚合物多次用温水进行洗净，然后用1,4-二喷、烷洗净，得到粒状凝胶(交联聚合物粒子)。将50g上迷粒状凝胶、200g聚乙二醇(平均分子量200)和200g的1,4-二喁烷进行充分混合，接着向其中加入2ml三氟化硼乙醚配合物，搅拌下加热至85。C，继续加热4小时。接着，将反应物冷至室温，用水充分洗净，进行筛分级，得到粒径4090nm的粒状皿。将该凝胶作为亲水化基材4。依照制备例1所述的方法测定亲7jc化基材4的物性。结果含水率为68.5%,残留的环氧量，每"干燥基材为0.311111101以下，分子量排除极限为110万，孔隙率为74%。进而，依照制备例l所述的方法，向亲水化基材4导入氨基。将该反应得到的填充剂作为氨基化填充剂4。制备例5将皂化率88%、聚合度2400的聚乙烯醇(悬浮稳定剂)溶解在1升水中形成水溶液，使由58g曱基丙烯酸3，扣环氧环己基曱酯、6g曱基丙烯酸缩7jC甘油醚、16g乙二醇二甲基丙烯酸酯、加0g氯苯、0.6g偶氮二异丁腈形成的混合物悬浮在上述水溶液中。一边继续搅拌，一边将该混合物在60。C下加热6小时，进行聚合。将反应液冷至室温，用玻璃过滤器过滤所生成的粒状的凝胶态聚合物。为了除去聚合物表面上附着的悬浮稳定剂，将聚合物多次用温水洗净，然后用1,4-二^恶烷洗净，得到粒状凝胶(交联聚合物粒子)。将50g上述粒状凝胶、50g聚乙二醇、50g聚甘油聚缩水甘油醚(商品名，于〕一少EX-521、于力、ir化成工业社制)和200g的1，4-二噁烷进行充分混合，接着向其中加入2ml三氟化硼乙醚配合物，搅拌下加热至85'C，继续加热4小时。接着，将反应物冷至室温，用水充分洗净，进行篩分级，得到粒径40~90nm的粒状凝胶。将该凝胶作为亲水化基材5。依照制备例1所述的方法测定亲水化基材5的物性。结果含水率为70.5%，残留的环氧量，每lg干燥基材为0.3mmol以下，分子量排除极限为卯万，孔隙率为72%。进而，依照制备例i所述的方法，向亲水化基材5导入氨基。将该反应得到的填充剂作为M化填充剂5。制备例6将168g的3-金刚烷二醇和80吡咬溶解在400g四氢呋喃中，一边搅拌该溶液，一边^A应温度保持在40n，向该溶液中滴入84g甲基丙烯酰氯，反应2小时。在35匸以下的温度下从所得的反应液中减压蒸馏除去四氢呋喃，用正己醇提取残留物。接着，依次用纯水、0.1M的磷酸水溶液、0.1M的碳酸钠水溶液、纯水，从正己烷相中提取除去未反应的1,3-金刚烷二醇、盐类、吡啶、曱基丙烯酸。最后用甲醇提取正己烷相，在35C以下的温度下减压蒸馏除去甲醇溶液。对所得的生成物进行气相色谱分析，结果该生成物的组成为120g的3-羟基金刚烷-l-甲基丙烯酸酯、4g的1，3-金刚烷二甲基丙烯酸酯。接着，将皂化率88%、聚合度2400的聚乙烯醇(悬浮稳定剂)10g溶解在1升水中形成水溶液，使由60g该生成物、2g二乙烯基苯、10g三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、50g乙酸丁酯、100g氯苯、0.6g偶氮二异丁腈形成的混合物悬浮在上述水溶液中。一边搅拌，一边将该混合物在60X:下加热6小时，进行聚合。然后将反应物冷至室温，用玻璃过滤器过滤所生成的粒状的凝胶态聚合物。将聚合物多次用温水洗净，然后用1，4-二7恶烷洗净，从而得到粒状凝胶(交联聚合物粒子)。将50g上述粒状凝胶、20g乙二醇、30g2，3-环氧-1-丙醇和150g的1,4_二喷、烷进行充分混合，接着向其中加入2ml三氟化硼乙醚配合物，搅拌下加热至85X:，继续加热4小时。接着，将反应物冷至室温，用水充分洗净，进行筛分级，得到粒径4090nm的粒状凝胶。将该凝胶作为亲水化基材6。依照制备例1所述的方法测定亲水化基材6的物性。结果含水率为67%，残留的环氧量，每lg干燥基材为0.3mmo1以下，分子量排除极限为60万，孔隙率为70%。进而，依照制备例l所述的方法，向亲水化基材6导入氨基。将通过该反应得到的填充剂作为M化填充剂6。制备例7将皂化率88%、聚合度3500的聚乙烯醇(悬浮稳定剂)15g溶解在1升水中形成水溶液，使由64g的1，4-环己烷二甲醇单丙烯酸酯(日本化成社制)、6g的丙烯酸4-羟基丁酯(日本化成社制)、18g乙二醇二甲基丙烯酸酯、240g氯苯、和1.0g的过氧化新戊酸叔丁酯形成的混合物悬浮在上述水溶液中。一边搅拌，一边将该混合物在60'C下加热6小时，进行聚合。然后将反应液冷至室温，用玻璃过滤器过滤所生成的粒状的凝胶态聚合物。多次用温水洗净聚合物，然后用丙酮洗净，接着用水洗净，得到粒状凝胶(交联聚合物粒子)。将50g上迷粒状凝胶、25g聚甘油聚缩水甘油醚(商品名X于^一EX-512、于^f七化成工业社制)和80g纯水进行充分混合，在45'C下向其中滴入5N的氢氧化钠溶液30ml，搅拌3小时进行混合。接着，将反应物冷至室温，用0.1N的盐酸和水充分洗净，进行筛分级，得到粒径40~90Um的粒状凝胶。将该凝胶作为亲水化基材7。依照制备例i所述的方法测定亲水化基材7的物性。结果含水率为78%，残留的环氧量，每lg干燥基材为0.3mmo1以下，分子量排除极限为150万，孔隙率为75%。进而，依照制备例l所述的方法，向亲水化基材7导入氨基。将通过该反应得到的填充剂作为M化填充剂7。制备例8将分子量36万的聚乙烯基吡咯烷酮(悬浮稳定剂)50g和1升水加入带有搅拌器的反应器中，进行充分搅拌，使聚乙烯基吡咯烷酮在水中溶解。然后，使水溶液成为60匸那样进行调节。接着调制由200g曱基丙烯酸缩水甘油酯、50g乙二醇二甲基丙烯酸酯、l.Og偶氮二异丁腈形成的混合液，一边搅拌，一边将该混合溶液滴入到6ox:的上述水溶液中。向上述水溶液中以10ml/分钟的流速通入氮气，继续进行剧烈地搅拌，将该悬浮物在60x:下聚合8小时。将反应液冷至室温，过滤生成的凝胶状聚合物，多次用温水进行洗净，然后用二巧悉烷洗净，得到粒状的凝胶(交联聚合物粒子)。将200g该粒状凝胶(含有二恩烷)M在300ml的二巧悉烷中，向其中加入150g的乙二醇和5g的固体氢氧化钠，将其在水浴上加热至70"C，进行16小时反应，从而进行乙二醇对环氧基的开环加成反应。接着，先用水，然后用丙酮充分洗净生成物。然后，使用丙酮浆液，进行倾析(decantation)分级，得到粒径3~5pm的粒状凝胶。将该凝胶作为亲水化基材8。进而依照制备例l所述的方法，向亲7JC化基材8导入氨基。将通过该反应得到的填充剂作为氨基化填充剂8。制备例9将分子量36万的聚乙烯基吡咯烷酮(悬浮稳定剂)50g和1升水加入带有搅拌器的反应器中，进行充分搅拌，使聚乙烯基p比咯烷酮在水中溶解。然后，使水溶液成为60"C那样进行调节。接着调制由276g甲基丙烯酸3，4-环氧环己基甲酯、50g乙二醇二甲基丙烯酸酯、和l.Og偶氮二异丁腈形成的混合液，一边搅拌，一边将该混合液滴入到60'C的上述水溶液中。向上述水溶液中以10ml/分钟的流速通入氮气，继续进行剧烈地搅拌，将该悬浮物在60"C下聚合8小时。接着，将反应液冷至室温，过滤生成的凝胶状聚合物，多次用温水洗净，然后用二恩烷洗净，得到粒状的凝胶(交联聚合物粒子)。将200g该粒状凝胶(含有二哺、烷)*在300ml的二恶烷中，在室温下向其中加入150g的乙二醇和1.5ml的三氟化硼乙醚配合物，将其在水浴上加热至70X:，进行4小时反应，从而进行乙二醇对环氧基的开环加成反应。接着，先用水，然后用丙酮充分洗净生成物，在丙酮中悬浮，进行倾析分级，得到粒径35iim的粒状皿。将该凝胶作为亲水化基材9。进而依照制备例1所述的方法，向亲7JC化基材9导入氨基。将通过该反应得到的填充剂作为氨基化填充剂9。制备例10将皂化率88%、聚合度2400的聚乙烯醇(悬浮稳定剂)10g溶解在1升水中形成水溶液，使由48g的丙烯酸4-羟基丁酯缩水甘油醚(日本化成社制)、16g甲基丙烯酸3，4-环氧环己基曱酯、16g的乙二醇二甲基丙烯酸酯、220g氯苯、和1.4g的偶氮二异丁腈形成的混合物悬浮在上述水溶液中。一边搅拌，一边将该混合物在65'C下加热6小时，进行聚合。然后将反应物冷至室温，用玻璃过滤器过滤所生成的粒状的凝胶态聚合物，多次用温水进行洗净，然后用1，4-二噍烷洗净，得到粒状凝胶(交联聚合物粒子)。将50g上述粒状凝胶、100g乙二醇、和200g的1，4-二喷'烷进行充分混合，向其中加入2ml三氟化硼乙醚配合物，搅拌下加热至85'C，继续加热4小时。接着，将反应物冷至室温，用水充分洗净，进行筛分级，得到粒径40~卯jum的粒状凝胶。将该;^M作为亲水化基材10。依照制备例1所述的方法测定亲水化基材10的物性。结果含水率为72.5%,残留的环氧量，每^干燥基材为0.311111101以下，分子量排除极限为100万，孔隙率为76%。制备例11将皂化率88%、聚合度2400的聚乙烯醇(悬浮稳定剂)15g溶解在1升水中形成水溶液，使由64g的曱基丙烯酸4-溴丁酯、16g的乙二醇二甲基丙烯酸酯、100g的1，2-二氯丙烷、100g氯苯、和l.2g的偶氮二异丁腈形成的混合物悬浮在上述水溶液中。一边搅拌，一边将该混合物在65X:下加热6小时进行聚合。然后将反应物冷至室温，用玻璃过滤器过滤所生成的粒状的凝胶态聚合物，为了除去表面上附着的悬浮稳定剂，多次用温水洗净聚合物，然后用1，4-二喁烷洗净，从而得到粒状凝胶(交联聚合物粒子)。将50g上述粒状:^交、100g乙二醇、和200gl,4-二巧悉烷进行充分混合，向其中加入25g氬氧化钠，搅拌下加热至75t:,继续加热10小时。接着，将反应物冷至室温，用水充分洗净，进4亍筛分级，得到粒径卯卯iam的粒状凝胶。将该皿作为亲7jC化基材11。依照制备例1所述的方法测定亲水化基材11的物性。结果含水率为70.5%，残留的环氧量，每^干燥基材为0.311111101以下，分子量排除极限为80万，孔隙率为72%。制备例12将分子量36万的聚乙烯基吡咯烷酮(悬浮稳定剂)25g和lml的乙醇胺溶解在1升水中形成水溶液，将32g的1，4-环己烷二曱醇单丙烯酸酯(日本化成社制)、32g的6-氨基己基甲基丙烯酰胺、18g的乙二醇二曱基丙烯酸酯、100g的异戊醇、100g氯苯、和1.5g的过氧化新戊酸叔丁酯形成的混合物悬浮在上述水溶液中。一边搅拌，一边将该混合物在60n下加热6小时，进行聚合。然后将反应液冷至室温，用玻璃过滤器过滤所生成的粒状的凝胶态聚合物，多次用温水进行洗净，然后用丙酮洗净，再用水洗净，得到粒状凝胶(交联聚合物粒子)。将50g上迷粒状凝胶、25g聚甘油聚缩水甘油醚(商品名f于3—EX-512、亍^fir化成工业社制)和80ml纯水进行充分混合，在45X:下向其中滴入30ml的5N氢氧化钠溶液，搅拌混合3小时。接着，将反应物冷至室温，用O.IN盐酸和水充分洗净，进行筛分级，得到粒径^90iLim的粒状凝胶。将该皿作为亲水化基材12。依照制备例l所述的方法测定亲水化基材的物性。结果含水率为78%，分子量排除极限为120万，孔隙率为74%。进而，依照制备例l所迷的方法，向亲7K化基材12导入氨基。将通过该反应得到的填充剂作为M化填充剂12。制备例13将制备例4得到的亲水化基材4用纯水洗净，吸滤，然后，将50ml亲水化基材4转移至300ml的可拆分式烧瓶中，向其中加入30ml纯水、20g的1，3-丙烷磺酸内酯，搅拌混合。一边将反应温度保持在35~45"，一边向其中滴入15g的48o/。的氢氧化钠水溶液，滴入后，进一步在仰'C下继续反应3小时。反应结束后，对反应液进行吸滤，用純水进行充分洗净。将该反应得到的填充剂作为磺化填充剂13。制备例14将制备例4得到的亲7jc化基材4用纯水洗净，吸滤，然后，将50ml亲水化基材4转移至300ml的可拆分式烧瓶中，向其中加入25ml纯水、25g的单氯代乙酸钠，搅拌混合。一边将反应温度保持在4555'C，一边向其中滴入60g的48。/Q的氢氧化钠水溶液，滴入后，进一步在50"C下继续反应4小时。反应结束后，对反应液进行吸滤，用纯水进行充分洗净。将该反应得到的填充剂作为羧曱基化填充剂14。制备例15将制备例4得到的亲水化基材4用纯水洗净，吸滤，然后，将50ml亲水化基材4转移至300ml的可拆分式烧瓶中，向其中加入25ml纯水、40g的70。/。的缩水甘油基三曱基氯化铵水溶液，搅拌混合。一边将反应温度保持在3035C，一边向其中加入2g的48。/。的氢氧化钠水溶液，滴入后，进一步在35匸下继续反应24小时。反应结束后，对反应液进行吸滤，依次用纯水、0.5N的盐酸、纯水进行充分洗净。将该反应得到的填充剂作为季铵化填充剂15。制备例16依照制备例13所述的方法，向制备例2所得的亲水化基材2中导入磺基。将该反应得到的填充剂作为磺化填充剂16。制备例17依照制备例14所述的方法，向制备例2所得的亲水化基材2中导入羧甲基。将该反应得到的填充剂作为羧甲基化填充剂n。制备例18依照制备例15所述的方法，向制备例2所得的亲水化基材2中导入季铵基。将该反应得到的填充剂作为季铵化填充剂18。将以上制备例所调制的粒状凝胶(交联聚合物粒子)、亲水化基材、填充剂一并示于表1表3中。表<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>"GMA2)EHMA3)HAMA4)CHMA5)HBA6)BAGE7)溴丁基MA8)氨基己基酰胺9)EGDMA10)ADMA11)DVB12)MPTA甲基丙烯酸缩水甘油酯甲基丙烯酸3，4一环氧环己基甲酯1.3—羟基金刚烷一1一甲基丙烯酸酯1,4一环己烷二甲醇单丙烯酸酯1，4一羟基丁基丙烯酸酯丙烯酸4一羟基丁酯缩水甘油醚甲基丙烯酸4—溴丁基酯6—氨基己基甲基丙烯酰胺乙二醇二甲基丙烯酸酯1,3—金刚烷二甲基丙烯酸酯二乙烯基苯三羟甲基丙烷三丙烯酸酯表2<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>1)DEAE:二乙氨基乙醇2)1,3-PS:1，3—丙烷磺酸内3)CAC:单氯代乙酸钠4)GTA:缩水甘油基三甲基氯化铵实施例1在调至25X:土2匸的房间内评价制备例4中得到的亲水化基材4的亲水性和耐碱性。亲水性评价用以下方法进行，即将蛋白质溶液注入填充柱和空柱子中，取一定量的溶出液，用测定溶出液的280nm紫外吸光度进行比较的方法测定回收率。也就是说，如果基材具有疏水性，则蛋白质被基材疏水吸附，回收率降低，相反如果基材亲水性高，则回收率变高，利用了这种方法比较各柱子的功能。另外，在本实施例中，作为蛋白质，使用卵清蛋白(ovalbumin)、ot-胰凝乳蛋白酶原A(Chymotrypsinogen，牛)、肌红蛋白(myoglobin,马)、溶菌酶(lysozyme,蛋)(以上蛋白质均为i/^77々Ky、乂于"亇/《y社制)、细胞色素c(马)(和光纯药工业^土制)。具体地讲，将亲水化基材4形成的填充剂，用浆液填充法填充在内径10.7mm、长150mm的不锈钢柱子中制成填充柱。作为洗脱液，使用"^有0.1M的磷酸緩沖液(pH6.8)和0.2M的硫酸钠的溶液，以1.0ml/分钟的流速流出，向柱中加入以2.0mg/ml的浓度溶解在相同的洗脱液中的上述蛋白质O.lml，加AJg^,从第4分钟开始采集20ml溶出液。另一方面作为空柱子，为了防止蛋白质溶液^lt，4吏用内径10.7mm、长75mm的不锈钢柱，与上述同样，从注样后2分钟开始取样溶出液20ml。将从空柱子取的蛋白质的吸光度作为100%,与^M目比较求出^e白质的回收率。结果所有蛋白质均显示出95%以上的回收率，确认了亲水化基材4具有高亲水性。接着，通过比较由氢氧化钠水溶液浸渍所产生的氛基生成量，进行耐碱性评价。即用纯水充分洗净后，使用内径20mm的底部带有玻璃过滤器的色谱管，分别取10ml的亲水化基材4转移至2个80ml的带盖的试样瓶中。在一个试样瓶中加入60ml的5N氢氧化钠水溶液，在另一个试样瓶中加入60ml纯水，加盖密封，分别将浆液都进行混合后，在25C下静置保管4周。每个保管后的亲水化基材4的全部量分别用O.SN的HC1溶液充分洗净，然后用纯水充分洗净，然后通过用0.1N的氢氧化钠溶液滴定来测量氯基量。通过这些亲水化基材的氯基量之差，算出通过5N氢氧化钠溶液浸溃，水解所产生的M量，结果亲水化基材4的羧基生成量为每1升基材为8.3毫当量。实施例2评价制备例5中得到的亲7jc化基材5的亲水性和耐碱性。即，依照实施例1所述的方法进行亲水性评价。结果蛋白质的回收率都是95%,确认了亲水化基材5具有高亲水性。另外，依照实施例l的方法，通过将亲水化基材5浸渍在碱水溶液中4周来进行耐碱性评价。按照实施例1所述的方法评价浸溃后的基材的耐碱性，结果亲水化基材5的氛基生成量是，每l升基材为10.5毫当量。实施例3依照实施例1所述的方法评价制备例6中得到的亲水化基材6的亲水性和耐碱性。结果蛋白质的回收率都是95%,确认了亲水化基材6具有高亲水性。另外，亲水化基材6的羧基生成量是，每1升基材为12.4毫当量。实施例4依照实施例1所述的方法评价制备例7中得到的亲水化基材7的亲水性和耐碱性。结果蛋白质的回收率都是95%,确认了亲水化基材6具有高亲水性。另外，亲水化基材7的M生成量是，每1升基材为10.6毫当量。实施例5用下示方法测定制备例4中得到的M化填充剂4的离子交换容量。即按照实施例1所迷的要领，量取10ml的#^化填充剂4，将其依次用1N的氢氧化钠水溶液、纯水充分洗净，通过用0.1N的盐酸滴定进4亍测定。结果氨基化填充剂4的离子交换容量为，每1升填充剂为45毫当量。接着，用下示方法测定氨基化填充剂4的耐碱性。即对在氢氧化钠水溶液中浸渍后的该氨基化填充剂和没有在氢氧化钠水溶液中浸渍的该M化填充剂，测定牛血清白蛋白(以下筒称BSA)的结合量、和酸性蛋白质在一定溶出条件下的溶出容量。这里，氢氧化钠水溶液中的浸渍^HK除了浸渍时间为12周以外，其他与实施例1中的亲水化基材的耐碱性评价的条件相同。〈BSA结合量的测定〉用纯水充分洗净后，使用内径10mm的底部带有坡璃过滤器的色谱管准确量取3ml#^化填充剂4。然后使用M化填充剂4的10倍容量的50mM三氨基甲烷緩冲液(pH8.5)，将该M化填充剂洗净3次，然后转移至50ml的刻度瓶中。加入BSA含有浓度为20mg/ml的上迷三氨基甲烷緩冲液10ml，混合10分钟，使BSA吸附。然后，用滤纸过滤该悬浮液，除去氨基化填充剂4，得到残留的BSA溶液。接着，用紫外分光光度计测定该残留的BSA溶液的280nm下的吸光度。首先，使用紫外分光光度计，求出已知浓度的BSA溶液与280nm下的吸光度的关系，绘制标准图，根据该标准图求出残留的BSA量。将添加的200mg的BSA的量与残留的BSA的量之差作为BSA结合量。结果,在纯水中浸渍后的M化填充剂4的BSA结合量为29.5mg/ml，在氢氧化钠中浸渍12周后的M化填充剂4的BSA结合量为26.5mg/ml.确认他们之间的差，即碱导致的BSA结合量降低为3.0mg/ml，降低非常小。〈酸性蛋白质溶出容量的测定〉将M化填充剂4填充在内径7.511,长75mm的不锈钢柱子中，初期緩冲液使用50mM的三氨基甲烷緩沖液(pH8.5)，注入lmg/ml浓度的含有蛋白质的试样0.05ml，使蛋白质吸附在柱子上。然后，以最终缓沖液为50mM三氨基曱烷緩沖液(pH8.5)，进而是0.5M的含氯化钠溶液那样，以1.0ml/分钟的流速进行60分钟的线性梯度洗脱。溶出蛋白质的检测，在25±2'C使用紫外线吸收检测器UV8020(东乂一(林)制，检测波长280nm)进行。作为试样，使用卵清蛋白(以下简称OVA)和大豆胰蛋白酶抑制剂(以下简称STI)。然后测定从线性梯度洗脱开始到各种蛋白质的溶出顶峰为止的洗脱液的溶出量，将其作为溶出容量。结果在纯水中浸渍的M化填充剂4的OVA的溶出容量为16.2ml,STI的溶出容量为28.0ml。另一方面，在氢氧化钠溶液中浸渍12周的M化填充剂4的OVA溶出容量为15.3ml，STI的'溶出容量为27.0ml。即可以判断，碱导致的OVA溶出容量减少0.9ml，STI溶出容量减少l.Oml。也就是说，即使将氨基化填充剂浸渍在碱水溶液中，溶出容量的变化也很小，换而言之，可确认蛋白质的保持力几乎不变化。<^J^化填充剂的硬度的评价〉为了测定M化填充剂4的流通特性，将筛分级所得的M化填充剂4(体积平均粒径74|am、标准偏差13.4|im)用浆液填充法填充到内径10.7mm、长150mm的不锈钢柱中。用定流量泵(最大流速10ml/分钟)使纯水流过并使速度从0增至10ml/分钟，使用最大可测定训0kPa的布尔登(Bourdon)管式压力计，测定在各流速下的压力损失。接着，将氨基化填充剂4从柱内抽出，测定空柱和送液系统在同一流速下的压力损失，算出填充剂柱床的纯压力损失。结果显示到最大流速10ml/分钟(线流速667cm/小时)为止的流速和压力损失成直线关系，最大流速的压力损失为78kPa。实施例6依照实施例5所述的方法测定在制备例5中得到的tj^化填充剂5的离子交换容量。结果氨基化填充剂5的离子交换容量为，每1升填充剂为85毫当量。另夕卜，依照实施例5所述的方法进行^J^化填充剂5的耐碱性和石Jtt评价。该结果如下。〈BSA结合量的测定〉在纯水中浸渍后的募J^匕填充剂5的BSA结合量为37.4mg/ml,在氢氧化钠中浸渍12周后的氨基化填充剂的BSA结合量为35.9mg/ml。确认他们之间的差，即碱导致的BSA结合量的降低为1.5mg/ml，非常低。〈酸性蛋白质的溶出容量〉在纯水中浸渍的#^化填充剂5的OVA的溶出容量为17.2ml，STI的溶出容量为25.2ml。另一方面，在氢氧化钠溶液中浸溃12周的M化填充剂5的OVA溶出容量为16.8ml,STI的溶出容量为24.8ml。即可以判断，碱导致OVA溶出容量减少0.4ml，STI溶出容量减少0.4ml。也就是说，即使将M化填充剂5浸渍在碱水溶液中，保持力也几乎不变化。〈^J^化填充剂的^yt〉为了测定M化填充剂5的流通特性，将筛分级所得的M化填充剂5(体积平均粒径72|am、标准偏差141卩m)用浆液填充法填充到内径10.7mm、长150mm的不锈钢柱中。以后进行与实施例5所述的方法全部相同的操作，求出流速和压力损失的关系'结果显示到最大流速10ml/分钟(线流速667cm/小时)为止的流速和压力损失成直线关系，最大流速的压力损失为80kPa。实施例7依照实施例5所述的方法测定在制备例6中得到的^J^化填充剂6的离子交换容量。结果M化填充剂6的离子交换容量为，每l升填充剂为70毫当量。另外，依照实施例5所述的方法进行"iJ^化填充剂6的耐碱性和硬度评价。该结果如下。〈BSA结合量〉在纯水中浸渍后的J^化填充剂6的BSA结合量为26.lmg/ml，在氢氧化钠中浸渍12周后的m匕填充剂6的BSA结合量为24.7mg/ml。确认其差，即碱导致蛋白质结合量降低为1.4mg/ml,非常小。〈酸性蛋白质的溶出容量〉在纯水中浸渍的M化填充剂6的OVA的溶出容量为17.9ml，STI的溶出容量为26.3ml。另一方面，在氢氧化钠溶液中浸渍12周的氨基化填充剂6的OVA溶出容量为17.0ml，STI的溶出容量为24.9ml。即可以判断>在氢氧化钠溶液中浸溃12周的M化填充剂6的OVA溶出容量减少0.9ml，STI的溶出容量减少1.4ml。即使将#^化填充剂6浸渍在碱水溶液中，保持力也几乎不变化。〈M化填充剂的現变〉为了测定M化填充剂6的流通特性，将筛分级所得的氨基化填充剂6(体积平均粒径76|im、标准偏差13.1pm)用浆液填充法填充到内径10,7mm、长150mm的不锈钢柱中。以后进行与实施例5所迷的方法全部相同的操作，求出流速和压力损失的关系。结果显示到最大流速10m1/分钟(线流速667cm/小时)为止的流速和压力损失成直线关系，最大流速的压力损失为75kPa。实施例8依照实施例5所述的方法测定在制备例7中得到的M化填充剂7的离子交换容量。结果J(J^化填充剂7的离子交换容量为，每l升填充剂为125毫当量。另外，依照实施例5所述的方法实施M化填充剂7的耐碱性和硬度评价。该结果如下。〈BSA结合量〉在纯水中浸渍后的M化填充剂7的BSA结合量为26.2mg/ml,在氢氧化钠中浸渍12周后的M化填充剂7的BSA结合量为25.2mg/ml。确认其差，即碱导致的蛋白质结合量的降低为1.0mg/ml，非常小。<酸性蛋白质的溶出容量>在纯水中浸渍的M化填充剂7的OVA的溶出容量为l7.6ml,STI的溶出容量为28.2ml。另一方面，在氢氧化钠溶液中浸渍l2周的M化填充剂7的OVA溶出容量为16.8ml,STI的溶出容量为27.4ml。即可以判断，在氢氧化钠溶液中浸渍12周的氨基化填充剂7的OVA溶出容量减少0,8ml，STI的溶出容量减少0.8ml。也就是说，即使将#^化填充剂7浸渍在碱水溶液中，保持力也几乎不变化。〈M化填充剂的現变〉为了测定氨基化填充剂7的流通特性，将筛分级所得的M化填充剂7(体积平均粒径74|im、标准偏差13.1pm)用浆液填充法填充到内径10.7mm、长150mm的不锈钢柱中。以后进行与实施例5所述的方法全部相同的操作，求出流速和压力损失的关系。结果显示到最大流速10m1/分钟(线流速667cm/小时)为止的流速和压力损失成直线关系，最大流速的压力损失为77kPa。实施例9制备例9中得到的M化填充剂9的耐碱性评价，是通过在酸性蛋白质的一定的溶出条件下，对^皮氢氧化钠水溶液浸渍的该M化填充剂和没有被氢氧化钠浸渍的该M化填充剂测定溶出容量进行的。氢氧化钠水溶液的浸渍M与实施例5的*相同。〈酸性蛋白质溶出容量的测定〉将M化填充剂9填充在内径4.6mm，长35mm的不锈钢柱子中，初期緩冲液使用50mM的三氨基甲烷緩冲液(pH8.5)，注入含有lmg/ml浓度的蛋白质的试样0.02ml，使蛋白质吸附在柱子上。然后，使最终緩沖液为50mM的三氨基甲烷緩冲液(pH8.5)，进而是0.5M的含氯化钠溶液那样，以1.0ml/分钟的流速进行30分钟的线性梯度洗脱。溶出蛋白质的检测，在25土2"C使用紫外线吸收检测器UV8020(东y—社制，检测波长280nm)进行。作为试样，使用OVA和STI。然后测定从线性梯度洗脱开始到各种蛋白质的溶出顶峰为止的洗脱液的溶出量，将其作为溶出容量。结果在纯水中洗净的M化填充剂9的OVA的溶出容量为6.5ml,STI的溶出容量为13.5ml。另一方面，将在氢氧化钠溶液中浸渍l2周的M化填充剂9用纯水充分洗净，—洗净后的该M化填充剂的OVA溶出容量为6.3ml，STI的溶出容量为13.2ml。氢氧化钠溶液浸渍后的^J^匕填充剂9的OVA溶出容量减少0.2ml,STI溶出容量减少0.3ml。该变化量接近误差范围，结果是即使将氨基化填充剂9浸渍在碱水溶液中溶出容量也几乎没有变化。比较例1依照实施例1所述的方法评价制备例1中得到的亲7jC化基材1的耐碱性。亲7JC化基材1的羧基生成量是，每1升基材为125毫当量。比较例2依照实施例1所述的方法评价制备例2中得到的亲7jC化基材2的耐碱性，亲水化基材2的羧基生成量是，每l升填充剂为137毫当量。比较例3依照实施例5所述的方法测定在制备例1中得到的IL^化填充剂1的离子交换容量。结果M化填充剂1的离子交换容量为，每l升填充剂为128毫当量。另外，依照实施例5所述的方法实施M化填充剂1的耐碱性。该结果如下。〈BSA结合量〉在纯水中浸渍后的募J^化填充剂1的BSA结合量为35.6mg/ml，在氢氧化钠中浸渍12周后的M化填充剂1的BSA结合量为0.6mg/ml。确认通过在氢氧化钠中浸渍12周，M化填充剂1的吸附量减少35.0mg/ml，大幅降低。〈酸性蛋白质的溶出容量〉在纯水中浸渍的^J^化填充剂1的OVA的溶出容量为17.8ml,STI的溶出容量为25.9ml。另一方面，在氢氧化钠溶液中浸渍l2周的M化填充剂1的OVA溶出容量为4.6ml，STI的溶出容量为7.8ml。可以判断，在氢氧化钠溶液中浸渍12周的氨基化填充剂1的OVA溶出容量减少13.2ml，STI的溶出容量减少18.1ml,均大幅减少。也就是说，如果将氨基化填充剂l浸渍在碱水溶液中，保持力大幅降低。比较例4依照实施例5所述的方法测定在制备例2中得到的M化填充剂2的离子交换容量。结果氨基化填充剂2的离子交换容量为，每1升填充剂为119毫当量。另外，依照实施例5所述的方法实施g化填充剂2的耐碱性评价。该结果如下。〈BSA结合量〉在纯水中浸渍后的"tJ^化填充剂2的BSA结合量为319mg/ml，在氢氧化钠中浸渍12周后的M化填充剂2的BSA结合量为1.0mg/ml。确认通过在氩氧化钠中浸渍12周，M化填充剂2的吸附量减少32.9mg/ml，大幅降《氐。〈酸性蛋白质的溶出容量〉在纯水中浸渍的^&化填充剂2的OVA的溶出容量为16.6ml，STI的溶出容量为22.3ml。另一方面，在氲氧化钠溶液中浸渍12周的M化填充剂2的OVA溶出容量为4.9ml，STI的溶出容量为8.4ml。可以判断，在氢氧化钠溶液中浸渍12周的氨基化填充剂2的OVA溶出容量减少11.7ml，STI的溶出容量减少13.9ml，均大幅减少。也就是说，如果将氨基化填充剂2浸渍在碱水溶液中，保持力大幅降低。比较例5依照实施例5所述的方法测定在制备例3中得到的M化填充剂3的离子交换容量。结果M化填充剂3的离子交换容量为，每l升填充剂为106毫当量。另外，依照实施例5所述的方法评价M化填充剂3的耐碱性和硬度。该结果如下。〈BSA结合量>在纯水中浸溃后的M化填充剂3的BSA结合量为30，7mg/ml，在氢氧化钠中浸渍12周后的M化填充剂3的BSA结合量为0.7mg/ml。确认通过在氢氧化钠中浸渍12周，M化填充剂3的吸附量减少30.0mg/ml，大幅降低。〈M化填充剂的現复〉为了测定M化填充剂3的流通特性，将筛分级所得的M化填充剂3(体积平均粒径76Mm、标准偏差12.1pm)用浆液填充法填充到内径10.7mm、长150mm的不锈钢柱中。以后进行与实施例5所述的方法全部相同的IMt,求出流速和压力损失的关系。结果如果流速大于6ml/分钟(线流速400cm/小时)，则流速与压力损失的关系开始从直线偏离，压力急剧上升。10ml/分钟的流速对压力损失影响大，呈不能流淌的状态。比较例6依照实施例9所述的酸性蛋白质的溶出容量测定法，对制备例8中得到的氨基化填充剂8进行耐碱性评价。结果如下。〈酸性蛋白质的溶出容量〉用纯水洗净的M化填充剂8的OVA的溶出容量为7.5ml，STI的溶出容量为15.8ml。另一方面，在氢氧化钠溶液中浸渍12周的M化填充剂8的OVA溶出容量为2.5ml，STI的溶出容量为4.4ml。可以判断，在氢氧化钠溶液中浸渍的氨基化填充剂8的OVA溶出容量减少5.0ml，STI的溶出容量减少ll，4ml，几乎不能保持原溶出容量。实施例10依照实施例1所述的方法测定在制备例10中得到的亲水化基材10的亲水性和耐碱性。结果蛋白质的回收率均为95%以上，可确认亲水化基材10的亲水性高。另夕卜，亲水化基材10的羧基生成量是，每1升基材为25.5毫当量。实施例11依照实施例1所述的方法测定在制备例11中得到的亲水化基材11的亲水性和耐碱性。结果确认，蛋白质的回收率均为95%以上，亲水化基材11的亲水性高。另外，亲水化基材11的羧基生成量是，每1升基材为28.0毫当量。实施例12依照实施例5所述的方法测定在制备例12中得到的亲水化基材l2的离子交换容量。结果g化填充剂12的离子交换容量是，每1升填充剂为75毫当量。另外，依照实施例5所述的方法评价耐碱性。该结果如下。〈BSA结合量〉在纯水中浸渍后的M化填充剂12的BSA结合量为34.8mg/ml，在氢氧化钠中浸渍12周后的M化填充剂l2的BSA结合量为29.0mg/ml。它们之间的差，即碱导致的蛋白质结合量的降低为5.8mg/ml,较小。〈酸性蛋白质的溶出容量〉在纯水中浸渍的M化填充剂12的OVA的溶出容量为18.2ml，STI的溶出容量为27.2ml。另一方面，在氢氧化钠溶液中浸渍l2周的M化填充剂12的OVA溶出容量为16.4ml,STI的溶出容量为24.8ml。即可以判断，碱导致OVA溶出容量减少1.8ml，STI的溶出容量减少2.6ml。也就是说，即4吏将#^化填充剂12浸渍在碱水溶液中，保持力也几乎不变化。实施例13依照实施例5所述的方法测定在制备例15中得到的季铵化填充剂15的离子交换容量。结果季^K1填充剂15的离子交换容量是，每1升填充剂为95毫当量。另外，依照实施例5所述的方法评价季铵化填充剂15的耐碱性。该结果如下。〈BSA结合量〉在纯水中浸渍后的季铵化填充剂15的BSA结合量为43.5mg/ml，在氢氧化钠中浸渍12周后的季铵化填充剂15的BSA结合量为37.4mg/ml。它们之间的差，即碱导致的蛋白质结合量的降低为6.1mg/ml，较小。〈酸性蛋白质的溶出容量〉在纯水中浸渍的季铵化填充剂15的OVA的溶出容量为20.4ml，STI的溶出容量为31.0ml。另一方面，在氢氧化钠溶液中浸渍12周的季铵化填充剂15的OVA溶出容量为18.4ml，STI的溶出容量为28.1ml。即可以判断，碱导致OVA溶出容量减少1.8ml，STI的溶出容量减少2.6ml。也就是说，即使将季铵化填充剂15浸渍在碱水溶液中，保持力也几乎不变化。实施例14依照下述方法测定制备例13中得到的磺化填充剂13的离子交换容量。即按照实施例1所述的要领，量取10ml的磺化填充剂13，依次将其用1N盐酸、纯水洗净，通过用0.1N氢氧化钠水溶液滴定进行测定。结果，磺化填充剂13的离子交换容量为，每1升填充剂为90.0毫当量(pH7.0)。接着，按照下述方法评价磺化填充剂13的耐碱性。即分别对在氢氧化钠水溶液中浸溃过的和没有浸渍的磺化填充剂13，测定在pH3.5和pH8.5下的离子交换容量，通过卩113.5和？118.5之间的离子交换容量之差，评价耐碱性。即对于由(曱基)丙烯酰类单体聚合物形成的填充剂而言，磺酸基在pH3.5以下时基本离子化，但羧^在不是pH3.5以上时不离子化，从口113.5以上开始离子化至？118.5为止基本完全离子化。因此，从pH3.5和8.5间的离子交换容量差的变化可以测定使酯水解产生的羧酸量。另夕卜，根据卩113.5时离子交换容量变化可以测定磺酸基的释放量。另外，氢氧化钠水溶液浸渍的条件，除了浸渍时间为12周以外，其他与实施例1的亲水化基材中的耐碱性评价方法中的条件相同。其结杲是在纯水中浸渍后的磺化填充剂13,在pH3.5和8.5时的每1升填充剂的离子交换容量分别是86.2毫当量和卯.5毫当量。另一方面，在氢氧化钠溶液中浸渍12周后的磺化填充剂13，在pH3.5和8.5时的每1升填充剂1的离子交换容量分别是85.8毫当量和90.8亳当量。因此，磺酸基的释放量和羧酸的生成量分别为0.4毫当量和5.0毫当量，非常少，确认了磺化填充剂13稳定。实施例15依照实施例14所述的方法测定制备例14中得到的羧甲基化填充剂14的离子交换容量。结果，羧甲基化填充剂14的离子交换容量为，每l升填充剂为64.5毫当量(pH8.5)。接着，按照下述方法评价羧曱基化填充剂的耐碱性。即分别对在氢氧化钠水溶液中浸渍的和未经浸渍的羧曱基化填充剂测定在pH8.5时的离子交换容量的变化。但在该方法中，由于含有羧甲基的酯基水解，生成羧基，所以我们认为不能正确测定填充剂的耐碱性，但由于没有其他合适的方法，所以采用这种方法评价。另外，氢氧化钠水溶液的浸渍条件，除了浸渍时间为12周以外，其他采用与实施例1的亲水化基材中的耐碱性评价相同的条件。结果浸渍在纯水中的羧甲基化填充剂14在pH8.5时的每1升填充剂的离子交换容量为64.5毫当量。另一方面，在氢氧化钠溶液中浸渍了12周的羧甲基化填充剂14为64.5毫当量。即离子交换容量几乎没有变化。比较例7依照实施例5所述的方法测定在制备例18中得到的季铵化填充剂18的离子交换容量。结果季铵化填充剂18的离子交换容量是，每l升填充剂为129毫当量。另夕卜，依照实施例5所述的方法评价季铵化填充剂18的耐碱性。该结果如下。〈BSA结合量〉在纯水中浸渍后的季铵化填充剂18的BSA结合量为38.8mg/ml,在氲氧化钠中浸渍12周后的季^(匕填充剂18的BSA结合量为"mg/ml。可以确认它们之间的差，在氢氧化钠中浸渍U周后的季铵化填充剂18的吸附量大幅降低了37.4mg/ml.〈酸性蛋白质的溶出容量〉在纯水中浸渍的季铵化填充剂18的OVA的溶出容量为21.8ml,STI的溶出容量为33.2ml。另一方面，在氢氧化钠溶液中浸渍12周的季铵化填充剂18的OVA溶出容量为5.6ml,STI的溶出容量为10.2ml。即可以判断，碱使OVA溶出容量减少16.2ml，STI的溶出容量减少23.0ml，溶出容量大幅减少。也就是说可以确认，如果将季铵化填充剂18浸渍在碱水溶液中，则保持力大幅降低.比较例8依照实施例14所述的方法测定在制备例16中得到的磺化填充剂16的离子交换容量。结果磺化填充剂16的离子交换容量是，每l升填充剂为95.4毫当量(pH7.0)。接着，依照实施例14所述的方法评价磺化填充剂16的耐碱性。结果在纯水中浸溃后的磺化填充剂16，在pH3.5和8.5时，每1升填充剂的离子交换容量分别是91.2毫当量和96.4毫当量。另一方面，在氢氧化钠溶液中浸渍12周后的磺化填充剂16,在pH3.5和8.5时，每1升填充剂的离子交换容量分别是58.6毫当量和102.8毫当量。因此，磺^的释放量和羧酸的生成量分别为32.6毫当量和44.2毫当量，确认了大量酯发生水解，释放出含有磺g的醇。比较例9依照实施例14所述的方法测定在制备例17中得到的羧甲基化填充剂17的离子交换容量。结果羧甲基化填充剂17的离子交换容量是，每l升填充剂为68.8毫当量(pH8.5)。接着，依照实施例15所述的方法评价羧曱基化填充剂17的耐碱性。另外，氢氧化钠水溶液的浸渍条件，除了浸渍时间为12周以外，其他采用与实施例1的亲水化基材中的耐碱性评价相同的*。结果浸渍在纯水中的羧曱基化填充剂17在pH8.5时,每1升填充剂的离子交换容量为68.8毫当量。另一方面，在氢氧化钠溶液中浸渍了12周的羧曱基化填充剂17在pH8.5时，每1升填充剂的离子交换容量为96.4毫当量。即离子交换容量增加了27.6毫当量。该增加是由于不含有羧曱基的酯基水解，产生了新的羧酸的缘故，表明进行了酯基的水解。将以上的实施例、比较例的结果一并示于表4表7中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表6<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表7<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>产业可利用性由于本发明的填充剂具有可适用于高速高分离的枳械强度，并且不会对蛋白质引起非特异吸附，所以本发明可以提供具有充分亲水性，进而即使在高浓度的碱水溶液中浸渍，蛋白质的吸附量、保持力等变化小的新型填充剂。上述填充剂显示了对溶于水溶液的物质(特别是蛋白质)的吸附.脱离作用，可在目标物质的捕集、液相色谱法中应用。另外，本申请公开的内容引用了在2005年6月9日提出申请的日本专利申请2005-169111号的说明书、权利要求书、和摘要的全部内容。权利要求1、一种填充剂，其特征在于由交联聚合物粒子形成，所述交联聚合物粒子含有20～95mol％的从下式(1)所示的(甲基)丙烯酰类单体衍生出的重复单元，式(1)中，R2表示氢原子或碳数1～4的烷基，R1表示-NR3-R4-R5或-O-R4-R5，R3表示氢原子或碳数1～4的烷基，R4表示含有脂肪族环的碳数为6～15的亚烷基、或碳数为4～8的直链亚烷基，R5表示卤素原子、醇性OH基、氨基、缩水甘油基、或环氧基，当R5是环氧基时，该环氧基可以是向R4中所含的脂肪族环的一部分直接导入的环氧基，也可以以侧链形式附加到脂肪族环上的环氧基，另外，当R5是缩水甘油基时，以缩水甘油醚的形式与R4结合。2、如权利要求l所述的填充剂，由交联聚合物粒子形成，所述交联聚合物粒子含有2095mol。/。的从上式(1)所示的(甲基)丙烯酰类单体矛汴生出的重复单元、和805mol。/。的从多官能性单体衍生出的重复单元。3、如权利要求1或2所述的填充剂，由上式(1)所示的(甲基)丙烯酰类单体和多官能性单体聚合得到的交联聚合物粒子形成。4、一种填充剂，其特征在于，由交联聚合物粒子形成，所述交联聚合物粒子含有2095mol。/。的下式(2)所示的重复单元、和805mol。/。的下式(3)所示的重复单元，<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(2)式(2)中，R2表示氢原子或碳数1~4的烷基，Ri表示-NR3-R4-RS或-0-R4-R5，113表示氢原子或碳数14的烷基，W表示含有脂肪族环的碳数为615的亚烷基、或碳数为4~8的直链亚烷基，R5表示卣素原子、醇性OH基、M、缩7jc甘油基、或环氧基，当R5是环氧基时，该环氧基可以是向R4中所含有的脂肪族环的一部分直接导入的环氧基，也可以以侧链形式附加在脂肪族环上的环氧基，另外，当RS是缩7JC甘油基时，以缩水甘油醚的形式与R"结合，<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(3)式(3)中，R6、R各自独立J^示氢原子或碳数为1~3的烷基，R8表示具有芳基、氧a^或氨基甲酰基的2官能性有机基团。5、如权利要求1~4任一项所述的填充剂，交联聚合物粒子是平均粒径为5300|im的多孔性粒子。6、权利要求1~5任一项所迷的填充剂的制备方法，使含有2095mol%的上式(1)所示的(甲基)丙烯酰类单体和交联剂的单体混合物，以及悬浮稳定剂在水相中悬浮、进行聚合。7、权利要求1~5任一项所述的填充剂的制备方法，使含有2095mol%的上式(1)所示的(曱基)丙烯酰类单体和805mol。/o的多官能性单体的单体混合物，以及悬浮稳定剂在水相中悬浮、进行聚合，8、如权利要求6或7所述的填充剂的制备方法，上式(1)所示的(曱基)丙烯酰类单体是选自曱基丙烯酸3,4-环氧环己基曱酯、1，3-羟基金刚烷-l-甲基丙烯酸酯、1，4-环己烷二曱醇单丙烯酸酯、1，4-羟基丁基丙烯酸酯、4-羟基丁基丙烯酸酯缩水甘油基醚、甲基丙烯酸4-溴丁基酯、和6-氨基己基曱基丙烯酰胺中的l种或2种以上。9、如权利要求7所述的填充剂的制备方法，多官能性单体是选自乙二醇二甲基丙烯酸酯、1,3-金刚烷二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯、和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯中的l种或2种以上。10、如权利要求1~5任一项所述的填充剂，在其粒子表面具有亲水性基团。11、如权利要求10所述的填充剂，是通过将权利要求15任一项所述的填充剂与亲7jc化剂作用而得到的。12、如权利要求10或11所述的填充剂，在使用普鲁兰作为标准物质，使用纯水作为洗脱液的情况下，分子量排除极限为50万~200万。13、如权利要求1~5、10~12任一项所迷的填充剂，其粒子表面具有离子交换基团。14、如权利要求13所述的填充剂，是使形成权利要求1~5任一项所述的填充剂的交联聚合物粒子中含有的环氧基团开环，导入离子交换基团而形成的。15、如权利要求13所述的填充剂，是使形成权利要求10~12任一项所述的填充剂的交联聚合物粒子环氧化，然后使环氧基团开环，导入离子交换基团而形成的。16、如权利要求13~15任一项所述的填充剂，离子交换基团是选自磺睃基、氣基、伯氮基、仲氨基、叔氨基、和季铵基中的至少l种。17、一种蛋白质的分离方法，作为色谱用填充剂使用权利要求1316的任一项所述的填充剂。全文摘要本发明提供适于高速·高分离，富有亲水性，并且对高浓度的碱水溶液具有耐性的填充剂。本发明的填充剂，由交联聚合物粒子形成，所述交联聚合物粒子的特征在于，含有20～95mol％的从式(1)所示的(甲基)丙烯酰类单体衍生出的重复单元，上式1中，R²表示氢原子或碳数1～4的烷基，R¹表示-NR³-R⁴-R⁵或-O-R⁴-R⁵，R³表示氢原子或碳数1～4的烷基，R⁴表示含有脂肪族环的碳数为6～15的亚烷基、或碳数为4～8的直链亚烷基，R⁵表示卤素原子、醇性OH基、氨基、缩水甘油基、或环氧基。文档编号C08F220/52GK101193928SQ200680020269公开日2008年6月4日申请日期2006年6月8日优先权日2005年6月9日发明者久保雄二,小宫克夫,长谷川正积申请人:东曹株式会社