基于磁性纳米粒子-pamam纳米复合材料的金花茶中黄酮类物质分离方法
【专利摘要】本发明公开了基于磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料的金花茶中黄酮类物质分离方法，步骤包括：制备PAMAM树状大分子，再利用PAMAM树状大分子制备磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料，将制备得到的磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料加入到金花茶叶萃取液中，在超声或微波条件下萃取、磁分离金花茶中黄酮类物质。本发明利用磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料由金花茶、白花蛇舌草等植物浓缩液中萃取吸附具有弱酸性的黄酮类物质，并通过磁分离、微波辅助萃取等技术实现黄酮类物质的高效分离。
【专利说明】基于磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料的金花茶中黄酮类物质分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体是一种基于磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料的金花茶中黄酮类物质分离方法。
【背景技术】
[0002]金花茶是世界上稀有的珍贵植物。与银杉、桫椤、珙桐等珍贵“植物活化石”齐名，是我国八种国家一级保护植物之一，属《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录II中的植物种，最早于1993年为我国植物学家左景烈在广西防城发现。目前世界上己知金花茶组物40个品种和5个变种，主要分布在越南及我国广西境内的亚热带南缘和热带北缘地区。
[0003]卫生部2010年第9号文件，批准金花茶、显脉旋覆花(小黑药)、诺丽果浆、酵母β -葡聚糖、雪莲培养物等5种物品为新资源食品。研究发现，金花茶叶和花中富含总黄酮(异黄酮、双黄酮、花色苷及新黄酮类等)、茶多酚，多种氨基酸及微量元素等。
[0004]黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物，是色原烷的衍生物，其特点是具有C6-C3-C6的基本骨架。黄酮类化合物可以分为10多个类别:黄酮、黄烷醇、异黄酮、双氢黄酮、双氢黄酮醇、噢弄、黄烷酮、花色素、查耳酮、色原酮等，现已发现约4000余种黄酮类化合物，主要存在于植物的叶、果实、根、皮中，实验证明其具有广泛的生理和药理活性(包括抗氧化，清除氧自由基、抗病毒、抗癌、抗炎、抗衰老等)，因此对该化合物的研究已成为国内外医药界研究的热门话题。传统提取方法主要包括超滤法、酶解法、大孔树脂吸附法、超临界流体萃取法、超声波法、微波场提取法等(张睿，徐雅琴，时阳.黄酮类化合物提取工艺研究.食品与机械，2003，01，21-22)，但往往制约于提取效率或成本。
[0005]目前关于金花茶中黄酮类物质活性成分研究大多局限在传统紫外、色谱检测或溶剂浸提、膜分离等，如:湛志华对金花茶叶中的化学成分进行了定性分析。通过定性分析，发现金花茶叶中黄酮类化合物约占2.33%(湛志华.金花茶叶中黄酮成分的提取与分离[D].广西师范大学，2006);彭晓等采用反复硅胶柱色谱法、Sephadex LH-20柱色谱法、ODS柱色谱法、反复重结晶等方法对金花茶花的化学成分进行分离纯化，并通过理化常数测定和波谱分析等方法进行结构鉴定。从金花茶花的乙醇提取物中分离得到包括黄酮类物质在内的13个化合物(彭晓，于大永，冯宝民，唐玲，王永奇，史丽颖.金花茶花化学成分的研究.广西植物，2011,31 (04)，550-553 )。唐前等采用紫外分光光度法测定金花茶、毛瓣金花茶、凹脉金花茶、四季金花茶、薄叶金花茶不同植物部位中总皂苷、总多酚(鞣质)、总黄酮的含量。如金花茶花蕾醇提物中总皂苷、总多酚(鞣质)、总黄酮的含量依次为:21.30%、6.56%,21.76% (唐前，罗燕英，王永奇等.金花茶组植物化学成分的定量分析，时珍国医国药，2009，20 (4)，769-771);陈全斌等以金花茶叶为原料提取黄酮，黄酮经水解，溶剂萃取、柱层析等手段，得到高纯度甙元；经熔点、TLC、液相色谱、红外光谱、核磁共振法等分析手段进行结构表征，首次证实金花茶叶含有黄酮甙，其甙元为槲皮素和山奈酚(陈全斌，湛志华，张巧云，廖娜.金花茶叶中黄酮甙元的分离提纯及其表征.广西热带农业，2005，6，10-11)。
[0006]张彩霞等采用微波辅助提取白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)中的黄酮类化合物，并优化其提取工艺，对提取物的化学结构进行鉴定，发现影响黄酮提取率的因素主次顺序为:提取温度乙醇浓度提取时间料液比；最佳提取工艺为:乙醇浓度为80%，提取时间为40 min,料液比为1: 40，提取温度为80°C，在此条件下白花蛇舌草中黄酮的提取率达2.86% (张彩霞，蔡定建，方文英.白花蛇舌草中黄酮提取工艺的优化及其结构鉴定.安徽农业科学，2011，39 (01)，131-133);李加林等通过正交实验探讨了提取温度、提取时间、料液比及乙醇浓度对盐肤木总黄酮提取率的影响。提取时间为10 min,温度为60°C，料液比为1: 60，乙醇浓度为70%时提取效率最佳。研究结果显示在最佳条件下总黄酮提取率达到6.65%。李加林，吴素珍，卑占宇.盐肤木总黄酮提取工艺研究.时珍国医国药，2009， 20,1116-1117)。
[0007]树形分子(Dendrimer)是最近几年出现的一类三维的、高度有序的新型大分子。聚酰胺-胺(PAMAM)是目前研究最广泛、最深入的树状大分子之一，由于其具有高度支化、高度对称及表面含有大量官能团等独特的结构特点，广泛应用于药物载体、表面活性剂、催化剂、纳米材料、膜材料等领域。树状大分子中结构单元每重复一次成为一次繁衍，得到的产物的代数就增加1，目前聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子已合成到10.0代发散合成法是目前合成PAMAM树状大分子采用最多、最成熟的一种合成方法，具有反应条件温和、反应迅速、选择性高等优点(谭惠民，罗运军.树枝形聚合物[M].北京:化学工业出版社，2001)。
[0008]聚酰胺-胺型树状大分子具有丰富的端氨基结构及内部仲、季胺结构，使整体聚酰胺-胺型树状大分子呈弱碱性。黄酮类化合物大多具有酚羟基，整体呈弱酸性，易溶于碱水，酸化后又可沉淀析出。其原因一是由于黄酮酚羟基的酸性，二是由于黄酮母核在碱性条件下开环，形成2'-羟基查耳酮，极性增大而溶解(郭雪峰，岳永德.黄酮类化合物的提取分离纯化和含量测定方法的研究进展.安徽农业科学，2007，35 (26)，8083-8086)。本发明拟利用呈弱碱性的PAMAM树状大分子材料与呈弱酸性的黄酮类物质的萃取吸附作用，实现金花茶中黄酮类物质的高效分离。
[0009]为更好地对PAMAM吸附后的黄酮类物质进行分离，本发明将PAMAM与磁性纳米粒子如铁氧体类(四氧化三铁、Y -三氧化铁、MeFe204 (Me=Co, Ni, Mn)), Fe, Co, Ni及其合金颗粒类、氮化铁类(FeN，Fe2N, ε -Fe3N, Fe 16N2)等粒子复合制备磁性粒子-PAMAM纳米复合材料，通过磁性作用将萃取吸附有弱酸性黄酮物质的磁性粒子-PAMAM纳米复合材料从萃取液中分离；最后通过超声辅助萃取技术将吸附的黄酮物质与磁性粒子-PAMAM纳米复合材料进行分离。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种萃取率高的基于磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料的金花茶中黄酮类物质分离方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0011]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
基于磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料的金花茶中黄酮类物质分离方法，步骤包括:
I)PAMAM树状大分子的制备 PAMAM树状大分子以乙二胺为中心核进行准备，第一步将乙二胺与丙烯酸甲酯进行Michael加成反应，得到0.5代聚酰胺胺树状大分子，记作PAMAM G0.5，该反应在25°C下选择性高；第二步是将得到的0.5代聚酰胺-胺型树状大分子与过量的乙二胺在25°C下反应，得到1.0代聚酰胺-胺型树状大分子，记作PAMAM Gl.0 ;每重复以上两步反应，分子代数增长I代，在适当条件下，不断重复以上两个步骤得到不同代数的聚酰胺-胺型树状大分子;
2)磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料的制备
磁分离把磁性纳米粒子分散于甲醇之中，获得浓度为0.0128mol/L ;将上述制备的25mL的磁性纳米粒子的甲醇溶液,用甲醇稀释至150mL,并超声处理30min ;然后加入1mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，强烈搅拌并超声处理7h ;所得溶液用甲醇洗涤5次后进行磁分离，分散于甲醇获得5wt%的溶液备用；
取50mL的5wt%的磁性纳米粒子甲醇溶液为起始溶液，加入200mL含有丙烯酸甲酯的甲醇溶液，丙烯酸甲酯的体积浓度为20%，把此混合液在室温水浴中超声7h ;然后用磁铁收集磁性纳米粒子，随后用甲醇洗涤5次，并磁分离；在洗涤之后，向该磁性纳米粒子的甲醇溶液中加入40mL含有乙二胺的甲醇溶液，乙二胺的体积浓度为50%，室温下超声处理3h ;然后用甲醇洗涤该磁性纳米粒子5次，并进行磁分离；重复地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，每循环一次就获得更高代数的树形分子修饰的磁性纳米粒子；循环后的溶液用25mL甲醇洗涤3次，并用25mL水洗涤5次，磁分离收集获得PAMAM树形分子修饰的磁性纳米粒子；
3)金花茶中黄酮类物质萃取分离
将制备得到的磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料加入到金花茶叶萃取液中，在超声或微波条件下萃取0.5-3h，萃取结束后通过磁分离手段将吸附萃取有黄酮类物质的磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料分离，分离后的磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料采用有机溶剂萃取分离被磁性纳米材料吸附的黄酮类物质，磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料洗净活化后能重新循环使用。
[0012]作为本发明进一步的方案:磁性纳米粒子包括Fe、Co、Ni及其合金颗粒类、铁氧体类与氮化铁类；铁氧体类包括四氧化三铁、Y -三氧化铁与MeFe2O4,其中Me=Co、N1、Mn ;氮化铁类包括 FeN、Fe2N, ε -Fe3N 与 Fe16N2。
[0013]作为本发明进一步的方案:有机溶剂包括乙醇、甲醇、DMS0、丙酮。
[0014]作为本发明进一步的方案:该方法还适用于富含黄酮类物质的植物叶、花朵、果实与根莖。
[0015]与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明利用磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料由金花茶、白花蛇舌草等植物浓缩液中萃取吸附具有弱酸性的黄酮类物质，并通过磁分离、微波辅助萃取等技术实现黄酮类物质的高效分离。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为PAMAM树状大分子的典型合成路线。
[0017]图2所示为四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料合成及分离金花茶等植物中黄酮类物质示意图。
【具体实施方式】
[0018]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0019]本发明的黄酮物质分离步骤，为更好地对PAMAM吸附后的黄酮类物质进行高效分离，本发明将PAMAM树状大分子与磁性纳米粒子如铁氧体类(四氧化三铁、Y-三氧化铁、MeFe2O4 (Me=Co, Ni, Mn) )、Fe，Co，Ni 及其合金颗粒类、氮化铁类(FeN, Fe2N, ε-Fe3N,Fe16N2)等粒子和1.0-10.0代的PAMAM树状大分子复合制备磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料。该类复合材料因其球状结构末端具有丰富的伯胺官能团，中间则有大量仲、叔、季胺等，整体呈弱碱性，在水中溶解度在每100克水10-30克，对呈弱酸性的黄酮类物质有较强吸附效应，利于黄酮类物质的分离。本发明通过磁分离作用将萃取吸附有弱酸性黄酮类物质的磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料从萃取液中分离，随后通过溶剂萃取技术将被萃取吸附的黄酮类物质与磁性纳米粒子-PAMAM纳米复合材料分离。
[0020]实施例1
金花茶叶浓缩液制备:采摘春季新鲜的金花茶原叶；采用电子秤称重；对采摘的春季新鲜金花茶原叶按《中华人民共和国药典》(2010年版)标准进行筛选，将优选出金花茶原叶洗净后，粉碎；将粉碎后的金花茶原叶20公斤；加入丙酮(95%以上)50L，利用索氏提取器提取5-6小时，得提取液A ;提取后残渣加入40L左右丙酮(95%以上)，在40-60摄氏度条件下超声波处理约1.5小时，得提取液B，合并提取液A和B，利用旋转蒸发仪旋转蒸发除去大部分丙酮溶剂，得到有机相的金花茶浓缩液约2.0L。
[0021]四氧化三铁磁粒子-4.0GPAMAM复合材料制备过程:在氮气保护下，ρΗ=1.7时，配制0.085mol/L的三氯化铁溶液和0.05mol/L的硫酸亚铁的混合物。然后，往此混合物中滴加1.5mol/L的氨水溶液，并剧烈搅拌，直至pH=9。所获得的四氧化三铁磁性纳米粒子立即用水洗涤5次，然后用甲醇洗涤3次，磁分离把四氧化三铁磁性纳米粒子分散于甲醇之中，获得浓度为0.0128mol/L。上述制备的25mL的四氧化三铁磁性纳米粒子的甲醇溶液，用甲醇稀释至150mL，并超声处理30min。然后加入1mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，强烈搅拌并超声处理7h。所得溶液用甲醇洗涤5次后进行磁分离，产物分散于甲醇获得5wt%的溶液备用。50mL的5wt%的四氧化三铁磁性纳米粒子甲醇溶液为起始溶液。然后加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液在室温水浴下超声处理7h。然后用磁铁收集这些纳米颗粒，随后甲醇洗涤5次，并磁分离。在洗涤之后，往此磁性纳米颗粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室温下超声处理3h。然后用甲醇洗涤此纳米粒子5次，并进行磁分离。不断重复地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循环四次得到四代(4.0G)树形分子修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子。此溶液用25mL甲醇洗涤3次，并用25mL水洗涤5次，磁分离收集获得4.0G PAMAM树形分子修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子。
[0022]金花茶中黄酮物质萃取分离:将制备得到的四氧化三铁磁粒子-4.0G PAMAM复合材料1g加入到第一步制备好的2.0L金花茶叶萃取液中，在400W条件下超声萃取0.5h，萃取结束后通过磁分离手段将吸附萃取有黄酮类物质的Fe3O4-PAMAM纳米复合材料分离。分离后吸附有黄酮物质的磁性复合材料采用乙醇萃取多次，以萃取出被吸附的黄酮类物质。合并萃取液，旋转蒸发除去乙醇、无水硫酸钠干燥过夜即得到金花茶中的黄酮类物质。按保健食品检验与评价技术规范(2003版)中“保健食品中总黄酮的测定方法”，本发明所述黄酮物质分离纯化方法，黄酮物质含量在85%以上。四氧化三铁磁粒子-4.0G PAMAM磁性纳米复合材料用水、乙醇洗涤多次后干燥活化重新循环使用。
[0023]实施例2
金花茶花朵浓缩液制备:采摘秋季新鲜的金花茶花朵；采用电子秤称重；对采摘的秋季新鲜金花茶花朵按《中华人民共和国药典》(2010年版)标准进行筛选，将优选出金花茶花朵洗净后，粉碎；将粉碎后的金花茶花朵10公斤；加入丙酮(95%以上)20-30L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ;提取后残渣加入20L左右丙酮(95%以上)，在40-60°C条件下超声约1.5h，得提取液B，合并提取液A和B，利用旋转蒸发仪旋转蒸发除去大部分丙酮溶齐U，得到有机相的金花茶浓缩液约1.0L。
[0024]Y-Fe2O3磁粒子_5.0G PAMAM复合材料制备:将2mol/L氢氧化钠溶液加入到lmol/L硫酸亚铁溶液中，反应有白色絮状沉淀Fe (OH)2生成，并迅速变成灰绿色沉淀:Fe6 (SO4) 2 (OH) 403。用胶头滴管向上述含沉淀的溶液中滴加适量双氧水，沉淀由绿色变为黑色后停止再加入。将上述含沉淀的溶液利用真空抽滤机分离沉淀，然后将其放入80°C干燥箱中干燥lh。将干燥后的沉淀在马弗炉中100-240°C焙烧半小时，得Y-Fe2O3红色粉末。把制备好的磁性纳米粒子分散于甲醇之中，获得浓度为0.0128mol/L。上述制备的25mL的
Y-Fe2O3磁性纳米粒子的甲醇溶液,用甲醇稀释至150mL,并超声处理30min。然后加入1mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，强烈搅拌并超声处理7h。所得溶液用甲醇洗涤5次后进行磁分离，分散于甲醇获得5wt %的溶液备用。50mL的5wt %的Y -Fe2O3磁性纳米粒子甲醇溶液为起始溶液。然后加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液浸入到室温水浴下超声处理7h。然后用磁铁收集这些纳米颗粒，用甲醇洗涤5次，并磁分离。洗涤之后,往此磁性纳米颗粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室温下超声处理3h。然后用甲醇洗涤此纳米粒子5次，并进行磁分离。不断重复地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循环五次获得五代(5.0G)树形分子修饰的磁性纳米粒子。此溶液用25mL甲醇洗涤3次，并用25mL水洗涤5次，磁分离收集获得5.0G PAMAM树形分子修饰的Y-Fe2O3磁性纳米粒子。
[0025]金花茶中花朵中黄酮物质萃取分离:将制备得到的Y -Fe2O3磁粒子_5.0G PAMAM复合材料5g加入到第一步制备好的1.0L金花茶花朵萃取液中，在400W条件下超声萃取一定时间lh，萃取结束后通过磁分离手段将吸附萃取有黄酮类物质的Y-Fe203-5.0G PAMAM纳米复合材料分离，分离后的吸附有黄酮物质的Y-Fe203-5.0G PAMAM纳米复合材料采用有机溶剂甲醇萃取多次，合并萃取液，旋转蒸发除去甲醇溶剂，无水硫酸镁干燥得到金花茶中的黄酮类物质，按保健食品检验与评价技术规范(2003版)中“保健食品中总黄酮的测定方法”，本发明所述金花茶花朵中黄酮物质分离纯化方法，黄酮物质含量在85%以上。
Y-Fe2O3磁粒子-5.0G PAMAM复合材料则洗涤多次干燥活化后循环使用。
[0026]实施例3
金花茶果实浓缩液制备:采摘11-12月新鲜的金花茶果实；采用电子秤称重；对采摘的金花茶果实按《中华人民共和国药典》(2010年版)标准进行筛选，将优选出金花茶果实洗净后，粉碎，50°C真空干燥8h除去水分，取粉碎后真空干燥的金花茶果实15公斤；加入95%以上的乙醇45L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ;提取后残渣加入30L左右95%以上的乙醇，在40-60°C条件下超声约1.5h，得提取液B，合并提取液A和B，利用旋转蒸发仪旋转蒸发除去大部分乙醇溶剂，得到有机相的金花茶浓缩液约1.5L。
[0027]CoxNihFe2O4纳米钴镍铁氧体磁性颗粒_3.0G PAMAM复合材料制备:x可以为0.1、0.3,0.5,0.7,0.9等，按化学计量比称量硝酸钴，硝酸镍，硝酸铁，柠檬酸；用蒸馏水溶解为透明的有色溶液。滴入氨水，使溶液PH值在7?8之间。90°C水浴中加热4?5h至粘稠的胶体状；在120°C下烘干为干燥凝胶。将干燥凝胶在马弗炉中以120°C /h加温至850°C后，保温lh，关掉电源，自然冷却。将制得的磁性纳米颗粒超声分散于甲醇之中，获得浓度为
0.0128mol/L。上述制备的25mL的CoxNihFe2O4磁性纳米粒子的甲醇溶液，用甲醇稀释至150mL，并超声处理30min。然后加入1mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，强烈搅拌并超声处理7h。所得溶液用甲醇洗涤5次后进行磁分离，分散于甲醇获得5wt%的溶液备用。50mL的5 wt%的C0xNi^Fe2O4磁性纳米粒子甲醇溶液为起始溶液。然后加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液浸入室温水浴中超声处理7h。然后用磁铁收集这些纳米颗粒，用甲醇洗涤5次，并磁分离。在洗涤之后，往此磁性纳米颗粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室温下超声处理3h。然后用甲醇洗涤此纳米粒子5次，并进行磁分离。然后重复地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循环三次获得三代(3.0G)树形分子修饰的磁性纳米粒子。此溶液用25mL甲醇洗涤3次，并用25mL水洗涤5次，磁分离收集获得3.0G PAMAM树形分子修饰的CoxNi^xFe2O4磁性纳米粒子。
[0028]金花茶果实中黄酮物质萃取:将制备得到的CoxNi^xFe2O4磁粒子-PAMAM复合材料(弱碱性)适量7.5g加入到第一步制备好的金花茶果实萃取液1.5L中，在400W条件下超声萃取一定时间1.5h，萃取结束后通过磁分离手段将吸附萃取黄酮类物质(弱酸性)的CoxNi1^xFe2O4-S.0G PAMAM纳米复合材料分离，分离后的磁性复合材料(附有黄酮物质)采用有机溶剂乙醇萃取多次，合并萃取液，旋转蒸发除去乙醇，室温真空干燥2h，得到金花茶中的黄酮类物质，按保健食品检验与评价技术规范(2003版)中“保健食品中总黄酮的测定方法”，本发明所述该黄酮物质分离纯化方法，黄酮物质含量在85%以上。CoxNi^xFe2O4磁粒子-3.0G PAMAM复合材料则洗涤多次干燥活化后重新循环使用。
[0029]实施例4
金花茶叶浓缩液制备:采摘春季新鲜的金花原叶；采用电子秤称重；对采摘的春季新鲜金花茶原叶按《中华人民共和国药典》(2010年版)标准进行筛选，将优选出金花茶原叶洗净后，粉碎；将粉碎后的金花茶原叶5公斤；加入95%以上的甲醇15L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ;提取后残渣加入1L左右95%以上的甲醇，在40_60°C条件下超声约
1.5h，得提取液B，合并提取液A和B，利用旋转蒸发仪旋转蒸发除去大部分甲醇溶剂，得到有机相的金花茶浓缩液约0.5L。
[0030]y -Fe4N-6.0G PAMAM复合材料制备过程:铁粉10克，铁粉粒度为0.1微米，氢气还原后，按氨/氢气比例3:4的比例通入氨气及氢气的混合气体，在550摄氏度条件下氮化3h，将产物在氩气氛下球墨1h后于240°C下进行4h退后得到Y -Fe4N,把Y -Fe4N纳米粒子分散于甲醇之中，获得浓度为0.0128mol/L。上述制备的25mL的Y-Fe4N磁性纳米粒子的甲醇溶液，用甲醇稀释至150mL,并超声处理30min。然后加入1mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，强烈搅拌并超声处理7h。所得溶液用甲醇洗涤5次后进行磁分离，分散于甲醇获得5wt%的溶液备用。50mL的5wt%的Y-Fe4N磁性纳米粒子甲醇溶液为起始溶液。然后加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液浸入到室温水浴中超声处理7h。然后用磁铁收集这些纳米颗粒，用甲醇洗涤5次，并磁分离。在洗涤之后，往此磁性纳米颗粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室温下超声处理3h。然后用甲醇洗涤此纳米粒子5次，并进行磁分离。不断重复地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循环六次得到六代(6.0G)树形分子修饰的Y_Fe4N磁性纳米粒子。此溶液用25mL甲醇洗涤3次，并用25mL水洗涤5次，磁分离收集获得6.0G PAMAM树形分子修饰的Y -Fe4N磁性纳米粒子。
[0031]金花茶中黄酮物质的萃取分离:将制备得到的Y -Fe4N磁粒子-PAMAM复合材料(弱碱性)适量2.5 g加入到第一步制备好的0.5L金花茶叶萃取液中，在400W条件下超声萃取一定时间2 h，萃取结束后通过磁分离手段将吸附萃取黄酮类物质的Fe304-6.0G PAMAM纳米复合材料分离，分离后吸附有黄酮物质的Fe304-6.0G PAMAM纳米复合材料采用有机溶剂乙醇萃取多次，合并萃取液，旋转蒸发除去溶剂，室温这空干燥2h，得到金花茶中的黄酮类物质，按保健食品检验与评价技术规范(2003版)中“保健食品中总黄酮的测定方法”，本发明所述该黄酮物质分离纯化方法，黄酮物质含量在85%以上。四氧化三铁磁粒子-6.0GPAMAM复合材料则洗涤多次干燥活化后循环使用。
[0032]实施例5
白花蛇舌草浓缩液制备:采摘秋季新鲜的白花蛇舌草，除去根，采用电子秤称重；对采摘的秋季新鲜的白花蛇舌草按《中华人民共和国药典》(2010年版)标准进行筛选，将优选出白花蛇舌草洗净后，粉碎；将粉碎后的白花蛇舌草20公斤；加入95%以上的丙酮50L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ;提取后残渣加入40L左右95%以上的丙酮，在40_60°C条件下超声波处理约1.5h，得提取液B，合并提取液A和B，利用旋转蒸发仪旋转蒸发除去大部分丙酮溶剂，得到有机相的白花蛇舌草浓缩液约2.0L。
[0033]四氧化三铁磁粒子-4.0GPAMAM复合材料制备过程:在氮气保护下，pH= 1.7时，配制0.085mol/L的三氯化铁溶液和0.05mol/L的硫酸亚铁的混合物。然后，往此混合物中滴加1.5mol/L的氨水溶液，并剧烈搅拌，直至pH=9。所获得的四氧化三铁磁性纳米粒子立即用水洗涤5次，然后用甲醇洗涤3次，磁分离把四氧化三铁磁性纳米粒子分散于甲醇之中，获得浓度为0.0128mol/L。上述制备的25mL的四氧化三铁磁性纳米粒子的甲醇溶液，用甲醇稀释至150mL，并超声处理30min。然后加入1mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，强烈搅拌并超声处理7h。所得溶液用甲醇洗涤5次后进行磁分离，产物分散于甲醇获得5wt%的溶液备用。50mL的5 wt%的四氧化三铁磁性纳米粒子甲醇溶液为起始溶液。然后加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液在室温水浴下超声处理7h。然后用磁铁收集这些纳米颗粒，随后甲醇洗涤5次，并磁分离。在洗涤之后，往此磁性纳米颗粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室温下超声处理3h。然后用甲醇洗涤此纳米粒子5次，并进行磁分离。不断重复地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循环四次得到四代(4.0G)树形分子修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子。此溶液用25mL甲醇洗涤3次，并用25mL水洗涤5次，磁分离收集获得4.0G PAMAM树形分子修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子。
[0034]白花蛇舌草中黄酮物质萃取分离:将制备得到的四氧化三铁磁粒子-4.0G PAMAM复合材料(弱碱性)1g加入到第一步制备好的2.0L金花茶叶萃取液中，在400W条件下超声萃取0.5h，萃取结束后通过磁分离手段将吸附萃取有黄酮类物质(弱酸性)的Fe3O4-PAMAM纳米复合材料分离。分离后吸附有黄酮物质的Fe3O4- PAMAM纳米复合材料采用乙醇萃取多次，以萃取出被吸附的黄酮类物质。合并萃取液，旋转蒸发除去乙醇、无水硫酸钠干燥过夜即得到白花蛇舌草中的黄酮类物质。按保健食品检验与评价技术规范(2003版)中“保健食品中总黄酮的测定方法”，本发明所述黄酮物质分离纯化方法，黄酮物质含量在85%以上。四氧化三铁磁粒子-4.0G PAMAM磁性纳米复合材料用水、乙醇洗涤多次后干燥活化重新循环使用。
[0035]实施例6
盐肤木叶浓缩液制备:采摘新鲜的盐肤木叶；采用电子秤称重；对采摘的新鲜盐肤木叶按《中华人民共和国药典》(2010年版)标准进行筛选，将优选出盐肤木叶洗净后，粉碎；将粉碎后的盐肤木叶10公斤；加入95%以上的乙醇20-30L，利用索氏提取器提取5_6h，得提取液A ;提取后残渣加入20L左右95%以上的乙醇，在40-60°C条件下超声约1.5h，得提取液B，合并提取液A和B，利用旋转蒸发仪旋转蒸发除去大部分乙醇溶剂，得到有机相的盐肤木叶浓缩液约1.0L。
[0036]Y-Fe2O3磁粒子_5.0G PAMAM复合材料制备:将2mol/L氢氧化钠溶液加入到lmol/L的硫酸亚铁溶液中，反应有白色絮状沉淀Fe (OH)2生成，并迅速变成灰绿色沉淀:Fe6 (SO4) 2 (OH) 403。用胶头滴管向上述含沉淀的溶液中滴加适量双氧水，沉淀由绿色变为黑色后停止再加入。将上述含沉淀的溶液利用真空抽滤机分离沉淀，然后将其放入80°C干燥箱中干燥lh。将干燥后的沉淀在马弗炉中100-240°C焙烧半小时，得Y-Fe2O3红色粉末。把制备好的磁性纳米粒子分散于甲醇之中，获得浓度为0.0128mol/L。上述制备的25mL的
Y-Fe2O3磁性纳米粒子的甲醇溶液,用甲醇稀释至150mL,并超声处理30min。然后加入1mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，强烈搅拌并超声处理7h。所得溶液用甲醇洗涤5次后进行磁分离，分散于甲醇获得5wt %的溶液备用。50mL的5wt %的Y -Fe2O3磁性纳米粒子甲醇溶液为起始溶液。然后加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液浸入到室温水浴下超声处理7h。然后用磁铁收集这些纳米颗粒，用甲醇洗涤5次，并磁分离。洗涤之后,往此磁性纳米颗粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室温下超声处理3h。然后用甲醇洗涤此纳米粒子5次，并进行磁分离。不断重复地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循环五次获得五代(5.0G)树形分子修饰的磁性纳米粒子。此溶液用25mL甲醇洗涤3次，并用25mL水洗涤5次，磁分离收集获得5.0G PAMAM树形分子修饰的Y-Fe2O3磁性纳米粒子。
[0037]盐肤木叶中花朵中黄酮物质萃取分离:将制备得到的Y-Fe2O3磁粒子-5.0GPAMAM复合材料(弱碱性)5g加入到第一步制备好的1.0L金花茶花朵萃取液中，在400W条件下超声萃取一定时间lh，萃取结束后通过磁分离手段将吸附萃取有黄酮类物质的
Y-Fe203-5.0G PAMAM纳米复合材料分离，分离后的吸附有黄酮物质的Y-Fe203_5.0G PAMAM纳米复合材料采用有机溶剂甲醇萃取多次，合并萃取液，旋转蒸发除去甲醇溶剂，无水硫酸镁干燥得到盐肤木叶中的黄酮类物质，按保健食品检验与评价技术规范(2003版)中“保健食品中总黄酮的测定方法”，本发明所述金花茶花朵中黄酮物质分离纯化方法，黄酮物质含量在85%以上。Y -Fe2O3磁粒子-5.0G PAMAM复合材料则洗涤多次干燥活化后循环使用。
[0038]本发明所述技术同样适用于其它富含黄酮类物质的植物叶、花朵、果实、根茎，如:茶叶、野菊花、银杏、桑叶、艾叶、金银花、柚子、橘子、大豆、生姜、八角、芹菜、菠萝、番石榴、玉米须、败酱、三叶草、鱼腥草、甘草、盐肤木、叶下珠、仙人掌、卷柏、白花蛇舌草、牛蒡、阔叶十大功劳、半边旗、罗布麻、春花胡枝子、锁阳、草珊瑚等，上述植物中黄酮类成分的萃取分离同样采用类似的磁性粒子-PAMAM纳米磁分离技术。
[0039]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0040]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
【权利要求】
1.基于磁性纳米粒子-?八纳米复合材料的金花茶中黄酮类物质分离方法，其特征在于，步骤包括: 1)树状大分子的制备 ？八嫩1树状大分子以乙二胺为中心核进行准备，第一步将乙二胺与丙烯酸甲酯进行110^61加成反应，得到0.5代聚酰胺胺树状大分子，记作？八嫩1 60.5，该反应在251下选择性高；第二步是将得到的0.5代聚酰胺-胺型树状大分子与过量的乙二胺在251下反应，得到1.0代聚酰胺-胺型树状大分子，记作？八嫩1 61.0 ；每重复以上两步反应，分子代数增长1代，在适当条件下，不断重复以上两个步骤得到不同代数的聚酰胺-胺型树状大分子； 2)磁性纳米粒子纳米复合材料的制备 磁分离把磁性纳米粒子分散于甲醇之中，获得浓度为0.0128001/1 ；将上述制备的251111的磁性纳米粒子的甲醇溶液,用甲醇稀释至1501111，并超声处理30111111 ；然后加入101111的3-胺丙基三甲氧基硅烷，强烈搅拌并超声处理71！；所得溶液用甲醇洗涤5次后进行磁分离，分散于甲醇获得50%的溶液备用； 取50此的5被％的磁性纳米粒子甲醇溶液为起始溶液，加入2001含有丙烯酸甲酯的甲醇溶液，丙烯酸甲酯的体积浓度为20%，把此混合液在室温水浴中超声7卜；然后用磁铁收集磁性纳米粒子，随后用甲醇洗涤5次，并磁分离；在洗涤之后，向该磁性纳米粒子的甲醇溶液中加入40此含有乙二胺的甲醇溶液，乙二胺的体积浓度为50%，室温下超声处理311 ；然后用甲醇洗涤该磁性纳米粒子5次，并进行磁分离；重复地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，每循环一次就获得更高代数的树形分子修饰的磁性纳米粒子；循环后的溶液用25此甲醇洗涤3次，并用25此水洗涤5次，磁分离收集获得？八嫩1树形分子修饰的磁性纳米粒子； 3)金花茶中黄酮类物质萃取分离 将制备得到的磁性纳米粒子-?八纳米复合材料加入到金花茶叶萃取液中，在超声或微波条件下萃取0.5-31！，萃取结束后通过磁分离手段将吸附萃取有黄酮类物质的磁性纳米粒子-?八心\1纳米复合材料分离，分离后的磁性纳米粒子-?八纳米复合材料采用有机溶剂萃取分离被磁性纳米材料吸附的黄酮类物质，磁性纳米粒子-?八嫩1纳米复合材料洗净活化后能重新循环使用。
2.根据权利要求1所述的基于磁性纳米粒子-?八纳米复合材料的金花茶中黄酮类物质分离方法，其特征在于，磁性纳米粒子包括？6、00? ^1及其合金颗粒类、铁氧体类与氮化铁类；铁氧体类包括四氧化三铁、V -三氧化铁与16？6204，其中16二?:0、附、III ；氮化铁类包括？6队琴、2 与？6』2。
3.根据权利要求1所述的基于磁性纳米粒子-?八纳米复合材料的金花茶中黄酮类物质分离方法，其特征在于，所述有机溶剂包括乙醇、甲醇、0180与丙酮。
4.根据权利要求1所述的基于磁性纳米粒子-?八纳米复合材料的金花茶中黄酮类物质分离方法，其特征在于，该方法还适用于富含黄酮类物质的植物叶、花朵、果实与根茎。
【文档编号】C08G83/00GK104492393SQ201410639271
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】程金生 申请人:程金生