一种用于减肥降脂的转化体及其构建方法与应用与流程

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用于减肥降脂的转化体及其构建方法与应用。

背景技术：

肥胖是当今世界倍受关注的一个健康问题。欧美发达国家，超过半数的人体重超标，其中的20～30％是肥胖患者。肥胖不仅影响行动和生活质量，并且可引发心血管疾病、2型糠尿病和肾脏疾病等一系列疾病，对人体健康危害极大。调查统计表明，体重指数(body mass index，BMI)每增加1个单位，高血压病的发病风险就增加10％。

虽然肥胖的发病原因有多种，遗传、内分泌失调、饮食结构和生活方式等因素都可以诱发肥胖。但是绝大多数肥胖患者属于不良的饮食结构和生活习惯所致的单纯性肥胖。目前，肥胖症的治疗方法主要有饮食行为疗法、药物治疗和手术治疗等。节食和增加运动量等饮食行为疗法减肥效果不好，容易反复，一般人难于长期坚持。手术治疗创伤大，风险高，不易被患者接受。因此，多数肥胖患者倾向于接受药物治疗。

目前的减肥药物有化学药物和中草药。其中化学药物一般是通过作用于神经中枢抑制食欲来达到减肥的目的，如芬特明(Phentermine)、芬氟拉明(Dexfenfluramine)和盐酸西布曲明(Sibntramine)等，但是这些药物有导致5-羟色胺综合征，出现精神状态改变(如焦虑不安、躁狂等)副作用，甚至会引发高血压和心绞痛。胰脂肪酶抑制剂奥利司他(orlistat，商品名xenical，赛尼可)也是一种化学减肥药物，可阻断脂肪酶对三酰甘油的水解，抑制脂肪吸收，但有引起脂肪腹泻和导致脂溶性维生素缺乏的副作用。减肥中草药多以植物提取物和膳食纤维为主，主要通过润肠通便、限食促排来达到减肥目的，长期服用会引起营养失衡、水电解质紊乱和乏力等症状。

胃泌酸调节素(Oxyntomodulin,OXM)是肠上皮L－细胞分泌的一种短肽肠激素。它由胰高血糖素原(proglucagon)基因编码，转录产物经过多种不同的剪接，可以形成OXM、肠高血糖素(licentin)、胰高血糖素样肽－1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)和GLP-2等多种活性肠肽激素。人OXM含37个氨基酸残基，具有抑制食物吸收和食欲、动员脂肪的作用。OXM的表达与肥胖发病有密切的关系。肥胖患者OXM分泌下降，而厌食症(如热带腹泻，空肠切除术后)OXM的分泌则增加。OXM可以通过三条途径调节 食欲和能量摄取：一是直接作用于胃肠道粘膜上皮细胞GLP-1受体，抑制糖和脂肪的吸收；二是作用于迷走神经，下调胃生长素的分泌，抑制食欲；研究显示，皮下注射OXM可使啮齿动物血液中的胃生长素下降20％，而人类可下降到44％；三是通过甲状腺途径刺激甲状腺素的合成分泌，增加能量消耗，动员脂肪。啮齿动物脑室注射或皮下注射OXM可降低食物吸收和体重，减少脂肪。在英国对26名肥胖患者进行双盲试验，受试者餐前30分钟皮下注射OXM，为期4周。结果显示，治疗组体重减轻了2.3kg，而对照组只减轻了0.5kg，对受试者食性和味觉没有影响。英国的菲亚克斯(Thiakis)公司化学合成了OXM类似肽TKS1225，已进入到临床Ⅲ期研究阶段，美国的惠氏(Wyeth)医药公司出资购买了TKS1225的独占使用权，有望近年内将TKS1225开发成减肥新药。但是，TKS1225等OXM类似肽一般通过化学合成或生物工程生产，产品多为粉针剂，通过注射途径给药。这种生产和给药方式存在生产成本高、体内半衰期短和用药不便的缺点，不易被肥胖患者接受。

已授权的中国专利(200910041386.X)—表达人胃泌酸调节素基因的双歧杆菌，虽然在减肥降脂方面已取得很好的效果。但是，此表达系统存在不能成药的重大缺陷。所用质粒载体pBBADs携带氨苄青霉素抗性基因，会在人体内引入氨苄蛋白过敏原。如果长期服用，可能会造成宿主肠道菌群紊乱，也会引起宿主产生耐药性。而本专利使用的乳酸乳球菌株不含有抗生素基因，是一个全新的药物构成，不会引入外来过敏原，生物安全性高。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种用于减肥降脂的转化体，该转化体具有更高的人胃泌酸调节素表达量，且不含抗生素，对人体更加安全。

本发明还要解决的技术问题是提供上述转化体的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述转化体的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种用于减肥降脂的转化体，该转化体是通过将经密码子优化的人胃泌酸调节素基因通过同源重组替换乳酸乳球菌胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，thyA)基因得到。

其中，所述的人OXM基因，其核酸序列可在不改变其编码的氨基酸序列的前提下，根据所选宿主的偏好密码子对其核酸序列进行优化调整，使人胃泌酸调节素基因在转化体中提高人胃泌酸调节素表达量，优选的其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

其中，所述的乳酸乳球菌为L.lactis NZ9000、L.lactis NZ3900或L.lactis MG1363

上述用于减肥降脂的转化体的构建方法，该方法包括如下步骤：

(1)将乳酸乳球菌thyA基因上游序列、经密码子优化的人胃泌酸调节素基因、乳酸乳球菌thyA基因下游序列依次拼接，人工化学合成整个基因片段；

(2)将新构建的重组基因片段用电转化进入乳酸乳球菌进行同源重组，筛选出thyA^-OXM⁺菌株。

本发明是利用人OXM基因与乳酸乳球菌thyA基因同源重组，从而替换掉乳酸乳球菌基因组中的thyA基因，使人胃泌酸调节素可以在乳酸乳球菌中组成型表达。

上述用于减肥降脂的转化体在制备减肥降脂药品和食品中的应用也在本发明的保护范围之内。其中，所述的药品为口服液、活菌粉剂、片剂或胶囊口服药，所述的食品为固体食品或者饮料。

上述用于减肥降脂的转化体在制备肥胖病人降血糖药物中的应用也在本发明的保护范围之内。其中，所述的药品为口服液、活菌粉剂、片剂或胶囊口服药。

上述用于减肥降脂的转化体在制备脂肪肝病人降脂药物中的应用也在本发明的保护范围之内。其中，所述的药品为口服液、活菌粉剂、片剂或胶囊口服药。

本发明的突出特点是利用乳酸乳球菌能在肠道内长期生长、定植的特性，通过基因同源重组，筛选获得组成型表达胃泌酸调节素的乳酸菌，发挥胃泌酸调节素调节食欲和能量吸收、减肥降脂的生物学作用。此法不需要进行胃泌酸调节素多肽的分离和纯化，生产工艺简单、成本低，可以口服，用药方便，克服了化学合成或基因工程生产胃泌酸调节素类似肽生产成本高、用药不便的缺点。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：

1、本发明制备了组成型表达人OXM的乳酸乳球菌，而且是胸腺嘧啶营养缺陷型菌株。因为胸腺嘧啶(thymidine)是乳酸乳球菌生长所必须的营养成份，当基因组中缺失thyA基因，将不能提供胸腺嘧啶。所以，改造后的乳酸菌不能在外界环境中繁殖生长，对环境不存在任何污染，也不会对环境中的其他微生物产生影响。

2、本发明构建的菌株不涉及任何对人体和环境有害的元素，包括抗生素、质粒以及可能产生毒性蛋白的基因等，因此可以安全用于人体。中国专利200910041386.X发明的表达OXM的转基因双歧杆菌含有氨苄青霉素抗性基因，人长期服用会导致耐药性， 而且这种菌株随粪便排出体外后，会与环境中的其他菌株发生重组，导致产生“超级菌”的可能性增大；而且现在有很多人对氨苄青霉素过敏，使适用人群受限。

3、该菌对肥胖小鼠的减重效果优于中国专利200910041386.X报道表达OXM的转基因双歧杆菌。在相同的时间内，使用相同的剂量，双歧杆菌使体重减少21.4％，而乳酸乳球菌使体重减少了31.1％。而且，血液、肝脏中的胆固醇含量明显降低，接近正常水平。动物实验显示，小鼠体重在喂食OXM转基因乳酸乳球菌1个月之后，不仅体重降至正常值，而且空腹血糖含量也趋于正常。

4、该菌对糖尿病小鼠同样具有减肥降脂的效果，受益人群将扩展至肥胖患者、糖尿病患者、脂代谢紊乱的代谢综合征患者。

附图说明

图1是PCR鉴定基因型结果图。

图2是乳酸乳球菌表达OXM的免疫印迹检测结果。

图3是乳酸乳球菌喂食肥胖小鼠后5小时后，检测血清中OXM的含量。

图4是乳酸乳球菌喂食肥胖小鼠后体重变化曲线图。

图5是乳酸乳球菌喂食肥胖小鼠6周后摄食量曲线。

图6是与双歧杆菌效果对比图。

图7是乳酸乳球菌喂食肥胖小鼠6周后腹部CT扫描图。A是正常小鼠；B是肥胖小鼠喂食NZ9000；C是肥胖小鼠喂食NZ9000-OXM(白线内浅色区域为脂肪分布区)。

图8是乳酸乳球菌喂食肥胖小鼠6周后小鼠全身体脂肪重量示意图。

图9是乳酸乳球菌喂食肥胖小鼠6周后小鼠空腹血糖含量。

图10是乳酸乳球菌喂食肥胖小鼠6周后小鼠血清里胆固醇的含量。

图11是乳酸乳球菌喂食糖尿病小鼠5周后体重变化曲线图

图12是乳酸乳球菌喂食糖尿病小鼠5周后小鼠血清里胆固醇的含量。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：OXM基因转化乳酸乳球菌的制备。

(1)、同源重组片段的构建：

根据已发表的乳酸菌L.lactis全基因组中thyA基因序列，分别找出起始密码子上游1000bp和终止密码子下游1000bp的序列。

根据人OXM氨基酸及核酸序列，参考乳酸乳球菌密码子使用频率，优化OXM核酸序列，得到的序列如SEQ ID NO:1所示。

人工化学合成基因片段OXM-M：乳酸乳球菌thyA基因起始密码子上游1000bp+人OXM基因序列+乳酸菌thyA终止密码子下游1000bp的序列。

(2)、OXM转基因乳酸乳球菌的制备和筛选：

将人胃泌酸调节素片段OXM-M电转化至菌株L.lactis NZ9000，命名为L.lactis OXM。

取2ul OXM-M，加入到40μl乳酸乳球菌感受态细菌悬液中混匀，置冰上5分钟，然后转移到0.4cm电击杯中。

将电击杯置电穿孔仪的电击盒中，启动电源进行电转化。电击条件：电压2000V，电容25μF，电阻200Ω，电击时间约4毫秒。

电击完成后，迅速取出菌液，加入1ml M17培养基，冰上5min后，30℃培养1h，然后涂布于含有胸腺嘧啶脱氧核苷的固体培养基上过夜培养。次日，挑取单克隆分别接种缺乏以及添加胸腺嘧啶脱氧核苷的固体培养基，若在含有胸腺嘧啶脱氧核苷的固体培养基生长，在不含胸腺嘧啶脱氧核苷的固体培养基上不能生长的的菌株为阳性菌。

(3).OXM基因转化菌的基因型鉴定。

设计3对基因型鉴定的PCR引物。

引物1：1F(SEQ ID No：2)5’-GGTTTTATTGTTTCATTAGT-3’，位于thyA上游序列；

1R(SEQ ID No：3)5’-GAGATAATCTTTTTTTTCAT-3’，位于OXM基因序列起始。

引物2：2F(SEQ ID No：4)5’-GGAATAACATTGCCTAATGA-3’，位于OXM基因序列末尾；

2R(SEQ ID No：5)5’-TTTATTATTAGGGAAAGCAA-3’，位于thyA下游序列。

引物3：3F(SEQ ID No：6)5’-ATGACTTACGCAGATCAAGT-3’，位于thyA基因序列起始；

3R(SEQ ID No：7)5’-TTAAATTGCTAAATCAAATT-3’，位于thyA基因序列末尾。

吸取2ul过夜培养的菌液，进行标准PCR反应。

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，菌株NZ9000未实施基因重组，仅能用引物3扩增出thyA的序列。重组菌株NZ9000-OXM缺失thyA基因，因此用引物3进行PCR就没有产物，引物1和2分别都能扩增出含有OXM基因序列的片段。

(4).OXM表达鉴定

接种5ml培养基，30℃培养过夜。

次日离心菌液，上清样品中加入1/3体积的100三氯醋酸(TCA)混匀，冰上静置20-30分钟，12000转/分钟离心10分钟沉淀蛋白，弃上清；加原样品三倍体积的丙酮，室温静置10分钟溶解TCA，12000转/分钟离心10分钟沉淀蛋白，弃上清；加1×SDS上样缓冲液溶解蛋白。细菌沉淀加入溶菌酶于37℃温育30分钟，混匀后加入500ul RIPA裂解液于冰上超声，离心12000转/分钟离心10分钟弃上清，加入1×SDS上样缓冲液溶解蛋白。

所有样品于95℃煮5分钟后，进行18％SDS-PAGE电泳，再稳压冰浴电转至PVDF膜，BSA室温封闭1h后，TBST漂洗3×5min，加入兔抗OXM抗体(1：500)，4℃孵育过夜。TBST漂洗3次，每次5min再加HRP标记的抗兔二抗(1：5000)，室温孵育1h，TBST漂洗3次，每次5min，ECL化学发光法显影。

结果如图2所示，L.lactis NZ9000未检测到OXM表达，而L.lactis NZ9000-OXM的菌体和培养基上清都能检测到OXM的表达，说明L.lactis NZ9000-OXM成功表达了OXM，并且能分泌到细胞外。

实施例2：OXM转化乳酸菌减肥降脂药效学实验。

(1)准备刚断乳B6小鼠若干只，高脂喂食直至肥胖小鼠造模成功。肥胖标准为：(实验组体重-正常小鼠平均体重)/正常小鼠平均体重>20％。将肥胖小鼠分成2组，每组10只，继续高脂饮食喂饲。一组为对照组，喂食乳酸乳球菌L.lactis NZ9000。另一组为实验组，喂食乳酸乳球菌L.lactis NZ9000-OXM。同时设立正常对照组，即正常饮 食B6小鼠不喂食乳酸乳球菌。

(2)每只小鼠以灌胃的方式给予5*10⁹CFU乳酸乳球菌，每2天灌胃1次。跟踪观测小鼠体重、进食量及其他生命体征。首次灌胃5小时后，取小鼠血清，用质谱检测OXM含量。结果如图3，灌胃NZ9000-OXM之后，小鼠血清中OXM含量显著上升了近2.5倍，达到约497ng/ml。这结果进一步说明L.lactis NZ9000-OXM在小鼠体内也能分泌表达OXM。对比实验发现喂食等量OXM重组双岐杆菌(专利授权200910041386.X)，小鼠血清中OXM含量约380ng/ml，低于OXM重组乳酸乳球菌。体重监测数据如图4所示，L.lactis NZ9000-OXM喂食肥胖小鼠4周后，其体重显著性下降。到5周时，体重接近于正常小鼠。直到9周实验结束，体重仍维持在24g左右。而L.lactis NZ9000小鼠到实验结束时，体重只是略有减少。与已获得专利授权(200910041386.X)的OXM重组双歧杆菌对比后发现，相同时间内乳酸乳球菌L.lactis OXM能使肥胖小鼠体重下降31.1％，而OXM重组双岐杆菌只能使小鼠体重下降21.4％(图6)。由此可见，L.lactis NZ9000-OXM具有更好的减重效果。

(3)持续喂食乳酸乳球菌6周后，用代谢笼实验检测小鼠24小时进食量。结果显示(图5)，喂食L.lactis NZ9000-OXM的小鼠进食量显著降低，约为L.lactis NZ9000对照组的1/2。NZ3900-OXM使小鼠进食量比对照组下降42.1％，与中国专利200910041386.X报道的OXM转基因双歧杆菌对比后发现，而OXM转基因双歧杆菌只能使小鼠进食量比对照组下降28.2％(图6)。由此可见，L.lactis NZ9000-OXM能更好的抑制食欲，减少进食量，从而控制体重。

(4)持续喂食乳酸乳球菌6周后，用小动物CT扫描分析小鼠腹部脂肪分布情况。图7是腹腔横断面扫描图，白线圈出的浅灰色区域为脂肪组织。A图为普通饮食对照组小鼠，B图为喂食L.lactis NZ9000组小鼠，C图为喂食L.lactis NZ9000-OXM组小鼠。可以看出NZ9000-OXM组小鼠的体内脂肪含量明显下降。用CT分析软件计算出脂肪占总体积的比例，然后换算成每只小鼠所含脂肪重量，数据统计分析后如图8所示。结果显示，喂食乳酸乳球菌L.lactis NZ9000的小鼠仍存在大量腹部脂肪，而L.lactis OXM小鼠腹部脂肪明显减少，降至正常小鼠水平。说明L.lactis NZ9000-OXM具有降低体内脂肪的作用。

(5)用高脂饮食诱导小鼠肥胖之后，其空腹血糖升高至7mmol/L左右(图9)，明显高于正常小鼠。但是喂食乳酸乳球菌6周后，L.lactis NZ9000组小鼠空腹血糖含量为 6.5mmol/L左右，L.lactis OXM组小鼠空腹血糖含量恢复到正常水平，约5mmol/L左右。对比实验表明，申请号为200910041386.X的中国专利报道的OXM转基因双歧杆菌不能调节小鼠空腹血糖。因此，OXM重组乳酸乳球菌优于OXM重组双歧杆菌，具有降低空腹血糖的作用。

(6)用高脂饮食诱导小鼠肥胖之后，其血清中胆固醇的含量为2.42mol/l。实验结束小鼠处死后，取血检测血清胆固醇含量。如图10所示，正常小鼠血清胆固醇含量为2.167mol/l，喂食L.lactis NZ9000的小鼠血清胆固醇含量为3.478mol/l，喂食L.lactis NZ9000-OXM之后小鼠的血清胆固醇含量下降至1.83mol/l，显著低于喂食L.lactis NZ9000的小鼠。而在相同时间里申请号为200910041386.X的中国专利报道的OXM重组双歧杆菌仅能使胆固醇含量降至2.4mol/l左右。因此，本发明提供的乳酸乳球菌L.lactis NZ9000-OXM能明显降低血清中的胆固醇。

实施例3：OXM转化乳酸菌对基因缺陷型糖尿病小鼠的减肥降脂药效学实验。

1.准备8周大小db/db小鼠20只，将肥胖小鼠分成2组，每组10只。一组为对照组，喂食乳酸乳球菌L.lactis NZ9000。另一组为实验组，喂食乳酸乳球菌L.lactis NZ9000-OXM。同时设立正常对照组，即正常饮食B6小鼠不喂食乳酸乳球菌。

2.每只小鼠以灌胃的方式给予5*10⁹CFU乳酸乳球菌，每天灌胃。体重监测数据如图11所示，喂食OXM组的小鼠的体重与给药之前自身体重相比，能够维持不变。而NZ9000组小鼠体重仍持续增加，5周约增加了8％。通过本实验可以发现，L.lactis NZ9000-OXM能够有效控制糖尿病小鼠的体重增长。

3.同时，取血检测血清胆固醇含量(图12)，喂食OXM组的小鼠血清胆固醇含量显著下降至5.58mol/l，显著低于对照组。这一结果提示，L.lactis NZ9000-OXM能够显著降低糖尿病小鼠的血脂。

上述结果表明，OXM转化乳酸菌可在小鼠肠道内表达分泌OXM，表达的OXM可通过作用于体内相应的受体，抑制食欲和能量吸收。说明OXM重组乳酸乳球菌有显著的减肥、降脂、降糖生物学作用。