一种合成DNA的方法与流程

文档序号:11808912阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种合成DNA的方法,其特征在于,所述合成DNA的方法的步骤包括:

提供寡核苷酸池,所述寡核苷酸池中含有至少两种寡核苷酸;

采用PCR方法,从寡核苷酸池中取出所需寡核苷酸序列组,并将所取出的寡核苷酸序列生成双链DNA;

将双链DNA进行酶切,在所述双链DNA末端形成互补的粘性末端;

将切割后的DNA片段进行连接;

高通量DNA测序,筛选出正确的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的DNA的方法,其特征在于,所述合成DNA的方法的步骤包括:

提供寡核苷酸,所述寡核苷酸两端分别连接有标签DNA序列,得到寡核苷酸池;其中,所述寡核苷酸序列结构如下:

TagF-E1-S-E2-TagR

其中,TagF和TagR分别为两端的标签DNA序列,其特异性标记靶标DNA;E1和E2为酶切位点,S为靶标DNA序列;

利用TagF和TagR,通过PCR方法,从寡核苷酸池中取出所需寡核苷酸序列组,并将所取出的寡核苷酸序列生成双链DNA;

将双链DNA进行E1和E2酶切,在所述双链DNA末端形成互补的粘性末端;将切割后的DNA片段进行连接;

高通量DNA测序,筛选出正确的DNA序列。

3.根据权利要求2所述的DNA的方法,其特征在于,所述合成DNA的方法的步骤包括:

提供寡核苷酸,所述寡核苷酸两端分别连接有标签DNA序列,得到寡核苷酸池;其中,所述寡核苷酸序列结构如下:

TagF-E1-S-E2-TagR

其中,TagF和TagR分别为两端的标签DNA序列,其特异性标记靶标DNA;E1和E2为酶切位点,S为靶标DNA序列;

通过PCR方法,从寡核苷酸池中取出所需寡核苷酸序列组,并将所取出的寡核苷酸序列生成双链DNA;其中,每组寡核苷酸序列中,有至少两条序列结构如 下:

TagF-E1x-S-E2x-TagR

TagF-E1y-S-E2y-TagR

将双链DNA进行E1和E2酶切,在所述双链DNA末端形成互补的粘性末端;保留TagF-E1x-S和S-E2y-TagR

将切割后的DNA片段进行连接;

并通过PCR方法在连接后的DNA片段两端引入一段末端核苷酸序列;

高通量DNA测序,筛选出正确的DNA序列。

4.根据权利要求2所述的DNA的方法,其特征在于,所述合成DNA的方法的步骤包括:

提供寡核苷酸,所述寡核苷酸两端分别连接有标签DNA序列,得到寡核苷酸池;其中,所述寡核苷酸序列结构如下:

TagF-E1-S-E2-TagR

其中,TagF和TagR分别为两端的标签DNA序列,其特异性标记靶标DNA;E1和E2为酶切位点,S为靶标DNA序列;

通过PCR方法,从寡核苷酸池中取出所需寡核苷酸序列组,并将所取出的寡核苷酸序列生成双链DNA;

将双链DNA进行E1和E2酶切,在所述双链DNA末端形成互补的粘性末端;将切割后的DNA片段进行连接;

并通过DNA连接方法在连接后的DNA片段两端引入一段接头序列,其中接头序列含有一段末端核苷酸序列和酶切位点E;

高通量DNA测序,筛选出正确的DNA序列。

5.根据权利要求3或4所述的合成DNA的方法,其特征在于,所述合成DNA的方法的步骤还包括:

筛选出正确的DNA序列后,采用根据所述末端核苷酸序列设计的引物,对所筛选出的正确的DNA序列进行PCR扩增,并将扩增产物进行E2x和E1y酶切或E酶切,得到目标序列。

6.根据权利要求1-4中任意一项所述的合成DNA的方法,其特征在于,所述酶切使用双链DNA限制性内切酶进行实施。

7.根据权利要求6所述的合成DNA的方法,其特征在于,所述双链DNA限制性内切酶的识别位点在切割位点之外,并产生非回文性粘性末端。

8.根据权利要求2-4中任意一项所述的合成DNA的方法,其特征在于,E1、E2、E1x、E2x、E1y、E2y和E分别独立地选自Type I、Type II、Type III型酶切位点中的任意一种或几种。

9.根据权利要求8所述的合成DNA的方法,其特征在于,E1、E2、E1x、E2x、E1y、E2y和E分别独立地选自Type IIS酶切位点中的任意一种或几种。

10.根据权利要求9所述的合成DNA的方法,其特征在于,所述Type IIS酶切位点分别选自AlwI、BbsI、BbvI、BfuAI、BsaI、BsmBI、BspMI、BspQI、FokI、HgaI、MmeI、SapI、SfaNI中的任意一种或几种。

11.根据权利要求3或4所述的合成DNA的方法,其特征在于,所述末端核苷酸序列长度为5-50nt。

12.根据权利要求11所述的合成DNA的方法,其特征在于,所述末端核苷酸序列至少包括PCR引物序列。

13.根据权利要求1所述的合成DNA的方法,其特征在于,所述寡核苷酸序列长度为≤500nt。

14.根据权利要求1所述的合成DNA的方法,其特征在于,所述寡核苷酸池中的寡核苷酸序列由芯片合成技术制备。

15.一种权利要求1中所述合成DNA方法的应用,其特征在于,所述应用选自:制备自然界中已经存在DNA序列;

人工设计或人工预测的、自然界中不存在的DNA序列。

16.根据权利要求15所述的应用,其特征在于,所述应用选自:

在基因修饰中的应用;

制备基因突变株中的应用;

制备克隆抗体和/或重组抗体中的应用;

制备cDNA中的应用;

制备核酸疫苗中的应用;

制备核酸药物中的应用;

制备基因改造生物中的应用;

制备蛋白和/或重组蛋白中的应用;

制备抗体药中的应用。

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