预测II型糖尿病心血管并发症风险的生物标记物及其用途的制作方法

本发明属于生物及诊断学技术领域，具体涉及II型糖尿病心血管并发症风险的预测和治疗技术领域。尤其涉及用于诊断和预测II型糖尿病患者心血管并发症风险的生物标记物；以及用于诊断和预测受试者心血管并发症的风险的方法。本发明进一步涉及用于治疗II型糖尿病患者心血管并发症(患此病风险增大)的药物，以及此类药物的筛选方法。

背景技术：

近年来,随着我国居民生活水平的提高及人口老龄化,II型糖尿病的发病率和死亡率也逐年升高。据统计，目前我国成人II型糖尿病患病率约为11.6％,II型糖尿病人数世界第一,II型糖尿病已成为威胁我国人民生命健康的大敌。现有技术公开了糖尿病根据病因和临床表现的不同主要分为I型和II型糖尿病(T2DM),其中90％以上的患者是T2DM；半数以上的II型糖尿病病人有动脉粥样硬化,病人的血小板反应性增高,易发冠心病、中风等心血管并发症。资料显示，在中国，心脑血管并发症加倍增加II型糖尿病人的直接医疗费用，此也是构成患者死亡的主要原因。研究显示，II型糖尿病病人易发心脑血管并发症的主要原因是血小板反应性增高，但血小板反应性增加的原因目前尚不清楚。如前所述，心血管并发症是糖尿病的主要死亡原因，抗血小板药是防治糖尿病心血管并发症的主要手段，但因为糖尿病病人血小板反应性增加的原因尚不清楚，所以临床实践中尚无法选择具有针对性的治疗方案和药物，以及无法进行精准化治疗，导致目前II型糖尿病人心脑血管并发症治疗效果欠佳，死亡率高。

有研究公开了P2Y12受体是一种经典的G蛋白偶联受体。G蛋白偶联受体至少存在两种构型，即非活性态的受体R和活性状态的受体R*，所述受体处于动态平衡中：R←→R*。依据对R*和R结合的选择性不同,配体可分为激动剂,中性拮抗剂,和反向激动剂。激动剂对R*比对R具有更高的亲和力,即选择性与R*结合,使平衡转向受体的激活状态以产生效应。拮抗剂对活性受体R*和非活性受体R具有相同的亲和力,并与R*和R的结合保持动态平衡。拮抗剂可将信号减至基础水平,但不能使信号降低至基础水平以下。反向激动剂选择性与非活性受体R结合,产生与内源性激动剂相反的效应。与中性拮抗剂不同,反向激动剂可降低信号至基础水平以下。当 G蛋白偶联受体水平升高时，可以造成受体处于一种自发激活状态，使得信号基础水平异常升高。反向激动剂可抑制自发活性受体的活性，降低已经升高的基础水平,而中性拮抗剂不能抑制自发活性受体的活性，不能降低已经升高的基础水平。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种生物标记物，进一步该生物标记物用于诊断和预测II型糖尿病患者心血管并发症风险；以及用于诊断和预测受试者心血管并发症的风险的方法和用于筛选治疗II型糖尿病患者心血管并发症的药物

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种预测II型糖尿病患者心血管并发症风险的生物标记物，并进一步用于诊断和预测II型糖尿病患者心血管并发症风险；以及用于诊断和预测受试者心血管并发症的风险的方法和用于筛选治疗II型糖尿病患者心血管并发症的药物。

本发明进行了P2Y12表达水平试验研究，结果显示，II型糖尿病人血小板P2Y12受体水平明显升高，受体自发激活，受体升高水平与血小板反应性明显正相关，表明P2Y12受体水平升高是糖尿病病人血小板反应性增加的原因，因此，P2Y12受体可作为预测II型糖尿病患者心血管并发症风险的生物标记物，用以预测糖尿病病人心血管并发症发生的风险，并进一步根据患者P2Y12受体水平，进行个性化，精准化的干预治疗。

基于上述研究结果：II型糖尿病人血小板P2Y12受体水平明显升高，受体自发激活，联合“反向激动剂可抑制自发活性受体的活性，降低已经升高的基础水平,而中性拮抗剂不能抑制自发活性受体的活性，不能降低已经升高的基础水平”研究依据，本发明中进一步研究发现，P2Y12反向激动剂AR-C78511比P2Y12受体中性拮抗剂坎格雷洛(AR-C69931MX,cangrelor)，具有更好的抗血小板活性；因此，提出对于糖尿病患者心血管并发症，P2Y12反向激动剂比P2Y12受体中性拮抗剂具备更大的治疗学优势；针对P2Y12受体水平升高的糖尿病患者，可以采用P2Y12反向激动剂疗法，进行个性化和精准化治疗。综上，本发明提出：1)糖尿病时血小板P2Y12受体水平增高、受体自发激活是糖尿病人血小板反应性增高、易发心血管并发症的重要原因；2)糖尿病时血小板P2Y12受体水平增高、受体自发激活是导致抗血小板药疗效降低的重要原因；3)“氯吡格雷抵抗”与其反向激动剂活性有关，即对于血小板P2Y12受体表达增高的病人，氯吡格雷因其反向激动剂活性低，抗血小板作用不佳，导致治疗效 果差；4)对于血小板P2Y12受体表达增高的糖尿病人，P2Y12受体反向激动剂具有更好的抗血小板优势；5)建议临床实践中根据病人血小板P2Y12受体表达水平，指导II型糖尿病人抗血小板药物的选用，即对血小板P2Y12受体表达增高的糖尿病人，采用P2Y12反向激动剂疗法。

本发明中，实验数据显示，II型糖尿病患者血小板P2Y12受体表达水平明显升高，且与血小板反应性增加正相关，解释了II型糖尿病患者心血管并发症风险增高的原因；进一步提出“通过检测血小板P2Y12受体表达水平，预测II型糖尿病人受试者中血小板反应性水平、心血管疾病并发症风险的方法”；本申请中还发现：对P2Y12受体表达水平高的糖尿病人血小板反应性，P2Y12反向激动剂AR-C78511具有比P2Y12受体中性拮抗剂坎格雷洛更好的抑制作用，具有更好的防治II型糖尿病患者心血管并发症的作用；因而，本发明提出“采用P2Y12反向激动剂疗法，对P2Y12受体表达水平高的糖尿病人，进行精准化治疗的方法”。

本发明提供了利用生物标志物P2Y12受体预测和诊断II型糖尿病人心血管并发症风险的方法，以及用于针对P2Y12受体高表达的II型糖尿病人，利用P2Y12受体反向激动剂进行个体化、精准化抗血小板治疗的方法。所述方法包括检测受试者血小板样品中P2Y12受体表达水平变化的方法，以及将血小板P2Y12受体作为一种生物标记物用于预测II型糖尿病心血管并发症的风险，并根据血小板P2Y12受体表达水平，进行个性化、精准化治疗；对血小板P2Y12表达水平增高的病人(包括II型糖尿病和其它动脉血栓性疾病如中风、冠心病、外周血管病等)，选择P2Y12反向激动剂进行抗血小板治疗；本发明的实施例中，优选P2Y12反向激动剂AR-C78511作为种强效的反向激动剂，其对II型糖尿病人心血管并发症具有更好的治疗学优势。

更具体的，本发明的利用生物标志物P2Y12受体预测和诊断II型糖尿病人心血管并发症风险的方法，以及用于针对P2Y12受体高表达的II型糖尿病人，利用P2Y12 受体反向激动剂进行个体化、精准化抗血小板治疗的方法，包括：确定P2Y12受体在来自所述II型糖尿病人受试者的血小板样品中的mRNA表达水平；P2Y12受体在来自所述II型糖尿病人受试者的血小板样品中的蛋白表达水平；来自于所述II型糖尿病人受试者的血小板样品的血小板聚集率水平；并且比较P2Y12受体在来自于所述受试者的血小板样品中的蛋白表达水平与P2Y12在对照组健康人的血小板样品中的表达水平；以及确定P2Y12受体在来自于所述受试者的血小板样品中的蛋白表达水平与其对应样本的血小板聚集率水平的关系；同时确定和比较相同浓度的AR-C78511和坎格雷洛对受试者血小板样品的血小板聚集率的抑制效果；以及确定AR-C78511和坎格雷洛的血小板聚集率抑制效果与受试者血小板样品中的P2Y12受体蛋白表达水平的关系；经检测测定，结果显示：与P2Y12受体在所述健康人受试者血小板样品中的表达水平相比，P2Y12受体在来自II型糖尿病人受试者的血小板样品中的mRNA和蛋白表达水平显著增加，血小板聚集显著增强，并且P2Y12受体在来自于受试者的血小板样品中的表达量与对应样本的血小板反应性成正相关性；AR-C78511和坎格雷洛对健康人血小板样品的血小板聚集率的抑制效果相似，但是AR-C78511对II型糖尿病人的血小板聚集率抑制作用显著强于坎格雷洛，并且P2Y12受体蛋白表达水平越高，AR-C78511的血小板聚集率抑制效果越强于坎格雷洛。

本发明的实施例中，

(1)采用实时荧光定量PCR方法对所述受试者II型糖尿病人和健康人血小板样品中的P2Y12受体mRNA表达水平研究，结果表明：II型糖尿病人血小板样品中的P2Y12受体mRNA表达水平(6.6±4.6)显著高于健康人血小板样品中的P2Y12表达水平(1.5±0.9)；正常参考值为小于3.3，高于此值为P2Y12表达异常增高；

(2)采用Western Blot蛋白质印记方法对所述受试者II型糖尿病人和健康人血小板样品中的P2Y12受体蛋白表达水平研究，结果表明：II型糖尿病人血小板样品中的P2Y12受体蛋白表达量(0.68±0.26)显著高于健康人血小板样品中的P2Y12表达水平(0.34±0.16)；正常参考值为小于0.65，高于此值为P2Y12表达异常增高；

(3)对所述受试者II型糖尿病人和健康人血小板样品的血小板聚集率研究结果表明：低浓度ADP(1μM)诱导II型糖尿病人血小板样品的血小板聚集率(7.0±1.6％)显著高于健康人血小板样品的血小板聚集率(1.2±0.9％)；并且高浓度ADP(10μM)诱导II型糖尿病人血小板样品的血小板聚集率(47±13％)同样显著高于健康人血小板样品的血小板聚集率(38±8％)；

(4)对所述受试者血小板样品的P2Y12受体蛋白表达水平和血小板聚集率进行相 关性分析，结果表明：在所述受试者血小板样品中，P2Y12受体蛋白表达水平越高，血小板聚集率越高，并且血小板P2Y12受体蛋白表达水平与血小板聚集率呈正相关性(P(two-tailed)<0.01|r|＝0.89)；说明P2Y12受体增高是糖尿病患者血小板反应性增加，心血管并发症风险增高的原因；

(5)对AR-C78511和坎格雷洛对ADP(10μM)诱导的受试者血小板样品血小板聚集率的抑制效果进行分析，结果表明：相同浓度(1nM)的AR-C78511和坎格雷洛对健康人血小板样品的血小板聚集率抑制效果相当(P>0.05)；但是同样浓度的AR-C78511对II型糖尿病人血小板样品的血小板聚集率抑制效果(17±9％)显著强于坎格雷洛(23±11％)；结果说明反向激动剂AR-C78511比中性拮抗剂坎格雷洛具有更好的抑制血小板反应性、降低心血管并发症风险的治疗优势；

(6)对AR-C78511和坎格雷洛对ADP(10μM)诱导的受试者血小板样品血小板聚集率的抑制效果和受试者血小板样品中P2Y12受体蛋白表达水平相比较，结果表明：在所述受试者血小板样品中，AR-C78511和坎格雷洛对受试者血小板样品中血小板聚集率的抑制效果与受试者血小板样品中P2Y12受体表达水平存在正相关性(|r|＝0.72P(two-tailed)<0.01；|r|＝0.46P(two-tailed)<0.01)；并且P2Y12受体蛋白表达水平越高，AR-C78511的血小板聚集率抑制效果越强于坎格雷洛。

实验结果显示，在II型糖尿病人受试者血小板样品中，P2Y12的mRNA和蛋白表达水平以及血小板聚集率都显著高于健康人受试者；并且随着P2Y12表达水平增加，II型糖尿病人血小板聚集率越高，存在正相关性关系；另外，AR-C78511对II型糖尿病人受试者的血小板聚集率抑制效果显著强于坎格雷洛，并且P2Y12蛋白表达水平越高，AR-C78511对血小板聚集率的抑制效果越强于坎格雷洛。

本发明提供了一种生物标记物P2Y12受体，其表达水平可以作为一种明确、有效、直观的血小板反应性生物标志物，进一步用于诊断和预测II型糖尿病人心血管并发症风险；所述P2Y12受体作为血小板反应性生物标志物可以通过任何有效途径包括，荧光定量PCR、蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附(ELISA)、流式细胞术、紫外分光光度法-近红外光谱法、高效液相色谱法、比色法、质谱鉴定法等进行检测，所述方法可以检测血小板的表达水平，也可检测全血中的P2Y12含量。

本发明进一步提供利用P2Y12反向激动剂进行个体化，精准化治疗：用于治疗血小板P2Y12受体表达水平增加的II型糖尿病患者的心血管并发症，对高表达、自发激活P2Y12受体的血小板具有更好的抑制作用；其中P2Y12反向激动剂包括但不局限于AR-C78511。

本发明中，利用P2Y12反向激动剂可以通过任何有效途径给药，包括口服、静脉内、腹膜内、局部、透皮、经眼、经鼻、局部、吸入、皮下、肌内、口含、舌下、直肠等，所述P2Y12反向激动剂可以单独给药，或者与其它活性或非活性的成分联合给药。

本发明中，所述P2Y12反向激动剂可以制备成任何适当的剂型，例如片剂、胶囊、丸剂、颗粒制剂、注射液等。

另外，本发明还提供了作为筛选针对高表达、自发激活P2Y12受体的抗血小板药物的方法，并指导临床上该类抗血小板药物在II型糖尿病患者心血管并发症、其它P2Y12受体突变或高表达引起P2Y12受体自发激活的血栓性疾病中的选用。

下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。需要强调的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Alan D.Michelson主编的“Platelets”第二版(New York:Elsevier Press,2007)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，文中所使用试剂来自国药试剂有限公司,百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

附图说明

图1.II型糖尿病人血小板中P2Y12受体mRNA表达水平显著高于健康人，数据用平均值±标准误表示。

图2.II型糖尿病人受试者血小板中P2Y12受体蛋白表达水平显著高于健康人，数据用平均值±标准误表示。

图3.ADP诱导II型糖尿病人受试者血小板样品中血小板聚集率显著提高，其中显示，低浓度ADP(1μM)诱导II型糖尿病人受试者血小板样品的血小板聚集率显著高于健康人；高浓度ADP(10μM)诱导II型糖尿病人受试者血小板样品的血小板聚集率也显著高于健康人，数据用平均值±标准误表示。

图4.受试者血小板样品中P2Y12受体蛋白表达水平与其血小板聚集率成正相关线性关系，其中显示，受试者血小板样品中P2Y12受体表达水平越高，其血小板聚集率越高，血小板P2Y12的表达水平可以预测血小板的聚集率。

图5.AR-C78511对II型糖尿病人血小板样品的血小板聚集率抑制效果显著强于坎格雷洛，

其中，A)相同浓度(1nM)的AR-C78511和坎格雷洛都能够明显抑制健康人血小板样品(n＝12)的血小板聚集率，并且抑制效果类似(P>0.05)；B)相同浓度(1nM)的AR-C78511对II型糖尿病人血小板样品(n＝20)的血小板聚集率抑制效果显著强于坎格雷洛(P<0.05)。

图6.受试者血小板样品P2Y12受体蛋白表达水平越高，AR-C78511对血小板聚集率抑制效果越强于坎格雷洛，其中显示，随着P2Y12受体蛋白表达水平升高，AR-C78511和坎格雷洛的抗血小板血小板聚集作用均减弱，但当P2Y12受体水平增高时，AR-C78511的抗血小板聚集作用明显优于坎格雷洛。

具体实施方式

实施例1.用实时荧光定量PCR方法检测II型糖尿病人受试者血小板中P2Y12受体mRNA表达水平

本实施例的目的是证明II型糖尿病人受试者血小板中P2Y12受体mRNA表达水平显著高于健康受试者血小板中的P2Y12受体表达水平。本实施例中，II型糖尿病人和健康人受试者血小板的制备：血小板来自于签订了知情同意书的志愿者，志愿者在取血前20天内未服用阿司匹林、氯吡格雷等任何抗血小板药物。抗凝剂采用ACD(85mmol L-1 sodium citrate,71.38 mmol L-1 citric acid,and 27.78mmol L-1 glucose)。300g离心20分钟得到富血小板血浆，取上清后900g进一步离心10分钟得到血小板。Trizol法提取总mRNA，逆转录获得cDNA，实时荧光定量PCR方法相对定量检测确定P2Y12受体mRNA表达水平。P2Y12引物正向序列为TCACCCAGGTCCTCTTCCC，反向序列为TGTTCCCAGTTTGGCATCAC，内参GAPDH引物正向序列为GTCCACTGGCGTCTTCACCA，反向序列为GTGGCAGTGATGGCATGGAC。计算公式为：

P2Y12受体mRNA表达水平＝2^-ΔΔCt

受试者血小板样品中P2Y12受体mRNA表达水平结果如图1所示，II型糖尿病人受试者(n＝28)血小板中P2Y12受体mRNA表达水平(6.6±4.6)显著高于健康人受试者(n＝32)血小板中的P2Y12受体mRNA表达水平(1.5±0.9，P<0.01)，正常受试者血小板中P2Y12受体mRNA表达水平参考值小于3.3，高于此参考值可定义为P2Y12受体mRNA表达水平异常增高。

实施例2.用Western Blot蛋白质印记方法检测II型糖尿病人受试者血小板中P2Y12受体表达水平

本实施例的目的是证明II型糖尿病人受试者血小板中P2Y12受体蛋白表达水平显著高于健康人受试者血小板中的P2Y12受体蛋白表达水平。

本实施例中，II型糖尿病人和健康人受试者血小板的制备方法同实施例1。血小板中加入SDS裂解缓冲液裂解重悬后煮沸备用。WesternBlot蛋白质印记方法检测确定P2Y12受体蛋白表达水平，公式为：

P2Y12受体蛋白表达水平＝P2Y12受体蛋白条带密度/GAPDH蛋白蛋白条带密度

受试者血小板样品中P2Y12受体蛋白表达水平结果如图2所示，II型糖尿病人受试者(n＝20)血小板中P2Y12受体蛋白表达水平(0.68±0.26)显著高于健康人受试者(n＝12)血小板中的P2Y12受体蛋白表达水平(0.34±0.16，P<0.01)。正常受试者血小板中P2Y12受体表达水平参考值低于0.65，高于此参考值可定义为P2Y12受体表达水平异常增高。

实施例3.ADP诱导的II型糖尿病人受试者血小板样品的血小板聚集率

本实施例的目的是证明II型糖尿病人受试者血小板聚集率显著高于健康人。

本实施例中，II型糖尿病人和健康人受试者血小板的制备方法同实施例1。血小板用Tyrode buffer重悬(138mmol L^-1NaCl,2.7mmol L^-1KCl,2mmol L^-1MgCl₂,0.42mmol L^-1NaH₂PO₄,5mmol L^-1glucose,10mmol L^-1HEPES,0.2％bovine serum albumin,and 0.02 unit mL^-1apyrase,pH7.4)，计数血小板，将血小板数目调整为2.5×10⁸个血小板/mL；

血小板聚集测定：血小板的聚集在血小板聚集仪(Model 400VS,Chrono-Log,Haverston,PA)，参数设定：搅拌速度900rpm，温度37℃，在加入不同浓度激动剂ADP(1μM，10μM)之前，血小板用溶剂或药物预处理3分钟，血小板聚集曲线监测时间为5分钟，以血小板最大聚集率作为最终血小板聚集率数据；

血小板聚集率结果如图3所示，低浓度ADP(1μM)诱导II型糖尿病人受试者(n＝20)血小板样品的血小板聚集率(7.0±1.6％)显著高于健康人受试者(n＝12)血小板样品的血小板聚集率(1.2±0.9％，P<0.05)；并且高浓度ADP(10μM)诱导II型糖尿病人受试者(n＝20)血小板样品的血小板聚集率(47±13％)同样显著高于健康人受试者(n＝12)血小板样品的血小板聚集率(38±8％，P<0.01)。

实施例4.受试者血小板样品中P2Y12受体蛋白表达水平与其血小板聚集率的相关性

本实施例的目的是证明随着受试者血小板中P2Y12受体蛋白表达水平增高，血小板样品的血小板聚集率越高，两者具有正相关性。

在本实施例中，通过分析实施例2的受试者(n＝32)血小板样品中P2Y12受体蛋白表达水平数据与实施例3的对应受试者(n＝32)血小板样品的血小板聚集率数据关系，进行线性回归分析，计算相关系数；

结果如图4所示，在一定范围内，受试者血小板样品的P2Y12受体蛋白表达水平越高，其对应的血小板聚集率越高，统计分析显示，两组数据存在正相关线性方程关系Y＝36.74X+23.54(P(two-tailed)<0.01)，相关系数|r|＝0.89，受试者血小板样品的P2Y12受体蛋白表达水平与血小板聚集率存在高度正相关性。

实施例5.P2Y12反向激动剂AR-C78511和P2Y12中性拮抗剂坎格雷洛对II型糖尿病人血小板样品血小板聚集率的抑制效果

本实施例的目的是为了证明相同浓度下，P2Y12反向激动剂AR-C78511对II型糖尿病人血小板样品的血小板聚集率抑制效果显著强于P2Y12中性拮抗剂坎格雷洛。

在本实施例中，血小板的制备和血小板聚集测定方法同实施例3，结果如图5所示，相同浓度(1nM)的AR-C78511和坎格雷洛对健康人血小板样品的血小板聚集率抑制效果相当(P>0.05)；但是同样浓度的AR-C78511对II型糖尿病人血小板样品的血小板聚集率抑制效果显著强于坎格雷洛(10μM ADP诱导的血小板聚集率分别为17±9％和23±11％，P<0.01，图5B)。

实施例6.P2Y12反向激动剂AR-C78511和P2Y12中性拮抗剂坎格雷洛的血小板聚集率抑制效果与受试者血小板样品P2Y12受体蛋白表达水平的关系

本实施例的目的是证明受试者血小板样品P2Y12受体蛋白表达水平越高，AR-C78511对血小板聚集率的抑制效果越强于坎格雷洛。

在本实施例中，通过分析实施例2的受试者血小板(n＝32)样品中P2Y12受体蛋白表达水平数据与对应的实施例5中AR-C78511和坎格雷洛对受试者血小板样品(n＝32)的血小板聚集率的抑制效果数据相关性，得出线性回归方程，计算直线相关系数，并检验直线间显著性；

结果如图6所示，AR-C78511和坎格雷洛对受试者血小板样品(n＝32)的血小板聚集率的抑制效果分别与P2Y12受体蛋白表达水平存在正相关线性关系，直线方 程分别为Y＝12.58X+9.218，(P(two-tailed)<0.01)；Y＝25.52X+7.076，(P(two-tailed)<0.01)；相关系数分别为(|r|＝0.46；|r|＝0.72)。二直线存在显著性差异(P<0.01)。并且当受试者血小板样品P2Y12受体蛋白表达水平越高，AR-C78511对血小板聚集率抑制效果越强于坎格雷洛。

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<110> 复旦大学

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