本发明属于兽用疫苗领域，具体涉及一种核苷酸序列、表达的蛋白、含有该核苷酸序列的毒株，以及其制备的疫苗组合物和应用。
背景技术：
：猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,prrsv)引起的以母猪发热、流产，断奶前、后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。该病最早发现于美国的北卡罗来纳州(1987年)，此后相继在加拿大(1998年)、德国(1990年)、英国(1991年)发现此病。1992年国际兽医局(oie)将此病命名为猪繁殖与呼吸综合征(prrs)。我国于1996年也报道了此病的流行，2006年更是爆发了变异的prrsv引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征，给养猪业造成了巨大的经济损失。近一年来，多地区流行病学调查发现，有新的prrsv流行，与以往的流行株相比，其基因序列发生较大改变。而现有的减毒活疫苗在临床上的预防效果不甚理想，灭活疫苗虽然也较早研制出来，其不存在散毒和毒力返强的危险，但对于以细胞免疫为主的新的prrsv预防效果不是很理想，因此，需要研发出针对我国最新流行的毒株的疫苗组合物，以有效防止我国prrsv相关疾病的流行。技术实现要素：本发明涉及一种核苷酸序列，所述核苷酸序列实质上编码序列表seqidno.2所示的gp5蛋白。本发明还涉及一种重组载体，所述重组载体能表达本发明所述的核苷酸序列编码的gp5蛋白。本发明还涉及一种转化子，所述转化子包含有导入的本发明所述的重组载体。本发明还涉及一种gp5蛋白，所述gp5蛋白序列包括如序列表seqidno.2所示的gp5蛋白或其功能性变异体。本发明还涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株为猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株，保藏号为cctccno.v201540。本发明还涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的本发明所述的gp5蛋白或其功能性变异体以及药学上可接受的载体。本发明还涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的本发明所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株或其培养物的灭活全病毒抗原以及药学上可接受的载体。本发明还涉及一种制备所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括：(1)克隆本发明所述猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白基因；(2)转化重组所述步骤(1)中克隆的gp5蛋白基因；(3)表达所述重组的猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白；(4)将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白抗原与佐剂按比例混合，乳化。本发明还涉及一种制备所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括增殖培养所述猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株，灭活，加入佐剂，搅拌均匀。本发明还涉及本发明所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。发明优点本发明采用目前猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株或其主要免疫原性蛋白，制备疫苗组合物。该疫苗组合物具有良好的免疫原性，接种猪只后，能够刺激机体快速地产生免疫力，产生较高的中和抗体水平；且能够有效地保护流行毒株的攻击，可以有效地保护猪群抵抗 猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株的感染，提高猪群的生产力。序列表中序列1为猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株gp5蛋白核苷酸序列；序列2为猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株gp5蛋白氨基酸序列；序列3为猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株gp2蛋白核苷酸序列；序列4为猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株nsp2基因核苷酸序列。具体实施方式以下，对本发明的实施方式进行说明。本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒株具有良好的免疫原性，显示出显著的免疫特性，其针对现有流行野毒株。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒株为猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,strainhnjz15)或其培养物，所述hnjz15株生物保藏号为：cctccno.v201540，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年9月21日。“培养物”是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异。本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒株，其具有序列表seqno.1所示核苷酸序列编码的gp5蛋白。优选地，本发明所述猪繁殖与呼吸综合征病毒株具有序列表seqno.3所示核苷酸序列编码的gp2蛋白。优选地，本发明所述猪繁殖与呼吸综合征病毒株具有序列表seqno.4所示核苷酸序列编码的nsp2基因。本发明涉及一种核苷酸序列，所述核苷酸序列实质上编码序列表seqidno.2所示的gp5蛋白。“核苷酸序列”在本申请中是指一种dna序列，其能够被转录 得到相应的rna序列。prrsv是正链rna病毒，其基因的编码序列为dna，其能够被转录成正链rna,该正链rna与病毒本身的基因组中的序列相同。“实质上编码”指其编码的蛋白可以通过添加、删除、替换一个或多个氨基酸残基同时保持其功能和免疫原性。本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5基因还可以应用于表达载体、活载体、核酸疫苗、诊断试剂开发以及其他预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒相关药物开发。本发明涉及一种重组载体，所述重组载体能表达本发明所述的核苷酸序列编码的gp5蛋白。本发明涉及一种转化子，所述转化子包含有导入的本发明所述的重组载体。本发明涉及一种gp5蛋白，所述gp5蛋白序列包括如序列表seqidno.2所示的gp5蛋白或其功能性变异体。“功能性变异体”指组成蛋白的氨基酸残基可以通过添加、删除、替换一个或多个氨基酸残基同时保持其功能和免疫原性。本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的本发明所述的gp5蛋白或其功能性变异体以及药学上可接受的载体。“疫苗组合物”指含有猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫原性的药物组合物。该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫反应。疫苗组合物包括免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗或合成肽疫苗，以及药学上可接受的载体。“减毒活疫苗”指的是以毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上复制的病毒制备的疫苗。本发明所用的术语“减毒”用于指以使病原丧失致病性、但保持免疫原性的方式对基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过uv辐射、化学处理或体外连续高阶继代培养实现减毒。人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失以使 毒力减弱。“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒灭活疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。“亚单位疫苗”指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。它比全病毒疫苗引起副反应的可能性小。“合成肽疫苗”指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽,即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽,与载体连接后加佐剂所制成的疫苗。本发明涉及的猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白，其有利地激发动物中的保护性反应。具体地，本发明实施方式的蛋白序列包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。“基本上相同”可以理解为本发明的蛋白优选地具有这样的氨基酸序列，其与seqno.2中所示的序列的部分或全部具有至少70％同源性，或具有至少75％同源性，或具有至少80％同源性，或具有至少85％同源性，或具有至少90％同源性，或具有至少95％同源性，或具有至少98％同源性。“同源性”还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简单替换/修饰。可以用blast-p(基本局部排比检索工具)，本领域技术人员公知的程序进行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的blastx和blastn程序。作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物包括免疫量的本发明所述的gp5蛋白，其具有seqno.2所示的氨基酸序列，以及药学上可接受的载体。本发明的gp5蛋白可以通过本领域内任何已知的方法制备，例如可以通过重组表达gp5基因制备gp5蛋白，表达系统可以使用任何已 知的表达系统，例如：真核表达系统、原核表达系统。或者直接合成gp5蛋白序列。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物包括≥25μg/ml的gp5蛋白抗原或其功能性变异体。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物包括≥25μg/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株或其培养物的gp5蛋白抗原，其具有seqno.2所示的氨基酸序列。作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物包括25～100μg/ml的gp5蛋白抗原或其功能性变异体。优选地，所述疫苗组合物包括猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株或其培养物的25～100μg/剂量gp5蛋白抗原，其具有seqno.2所示的氨基酸序列。作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物包括猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株或其培养物的灭活全病毒抗原，所述hnjz15株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前≥106.0tcid50/ml。作为本发明的一种优选实施方式；所述hnjz15株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前106.0～108.0tcid50/ml。作为本发明的一种更优选实施方式，所述hnjz15株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前107.0tcid50/ml。作为本发明的一种实施方式，所述药学上可接受的载体包括佐剂、助悬剂、表面活性剂、灭活剂或防腐剂；其中，所述佐剂选自白油、德雷克油，以及其他动物油、植物油或矿物油；或氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐；或montanidetmgel、卡波姆、角鲨烷或角鲨烯、isa206佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。本发明的疫苗组合物可使用本领域公知技术来调配，优选与药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。作为本发明的一种实施方式，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括油佐剂，其选自白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油 (drakeoil)，以及其他动物油、植物油或矿物油。上述油佐剂既可以是天然来源，也可以是经过人工合成获得的。本发明中，所述疫苗组合物为水包油乳液、油包水乳液或双重乳液，所述双重乳液通常表现为水包油包水乳液。作为本发明的一种实施方式，所述药学上可接受的载体还包括助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂。所述助悬剂可包括，例如，硬脂酸铝，以及所属
技术领域：
可用的其他助悬剂。所述表面活性剂可包括，例如，脱水山犁醇单油酸酯(tween系列)，司本(span)，以及所属
技术领域：
可用的其他表面活性剂。所述抗原灭活剂包括(但不限于)，例如福尔马林、β－丙内酯等等。所述防腐剂包括，例如硫柳汞。上述物质的使用方法及用量均为本领域技术人员所熟知。基于油佐剂会对动物体带来一定的副反应，还可以选择本领域的其它佐剂，包括氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐，来制备混悬液，减少免疫刺激。可将根据本发明的疫苗组合物制备成口服剂型或非口服剂型。优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。本发明涉及一种制备本发明所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括：(1)克隆权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白基因；(2)转化重组所述步骤(1)中克隆的gp5蛋白基因；(3)表达所述重组的猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白；(4)将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白抗原与佐剂按比例混合，乳化。本发明还涉及一种制备所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括增殖培养所述猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株，灭活，加入佐剂，搅拌均匀。本发明涉及本发明所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。“保护性反应”意为在动物中预防猪繁殖与呼吸综合征病毒相关疾病或由猪繁殖与呼吸综合征病毒导致的感染的发作或减轻存在的 这样的疾病的严重性。“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染或推迟疾病发作的所有行为。“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的症状减轻或好转的所有行为。“猪繁殖与呼吸综合征”指天然的prrsv感染猪后引起的一系列生理和病理的症状。这些症状包括，但不限于，发热、嗜睡、食欲不振、倦怠、呼吸困难、咳嗽、母猪繁殖障碍、仔猪生长缓慢等。下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明中的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量。本发明中所述的“tcid50”(50％tissuecultureinfectivedose)是指半数细胞培养物感染量，是表示病毒感染力的一种表示方式。mem液体培养基(液)用购自美国lifetechnologies公司的mem干粉培养基按照其说明书配制。本发明的dmem培养基参照gb/t18641-2002附录a配制方法配制。本发明中所述的“pbs”是指磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline)的英文缩写，本发明中使用的是0.01mm的ph7.4的pbs，按《分子克隆》第三版所述配制。实施例1病毒的采集分离从来自河南的疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的样本中分离，无菌采集猪扁桃体淋巴组织，以1∶10(体积比)加入dmem培养液，研磨，制备组织悬液，经3次反复冻融后，12000r/min离心15min， 收集上清液，再经0.22μm滤膜滤器过滤，在pam细胞上传代，37℃培养1h，换加含2％犊牛血清的dmem培养液，37℃培养5日。收获含毒培养液，经2次冻融后，收毒，换加含2％犊牛血清的dmem培养液。采用猪繁殖与呼吸综合征病毒pcr检测试剂盒(北京世纪元亨动物防疫技术有限公司)检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，结果为阳性；对分离的病毒利用pcr试剂盒进行外源病毒的检测，进行猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒的检测(猪伪狂犬病病毒rt-pcr检测试剂盒、猪细小病毒pcr检测试剂盒、猪瘟病毒rt-pcr检测试剂盒均为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司产品)，pcr检测结果表明均为阴性，表明毒种纯净。将分离到的猪繁殖与呼吸综合征病毒命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒株hnjz15株，提交保藏。实施例2分离病毒的遗传特性通过基因分析来确定实施例1中分离的病毒的遗传特性。利用在pam细胞上分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组做模板，反转录成cdna，使用表1所示的引物进行pcr。分别使用primerpremier5.0来设计用于扩增gp5、gp2、nsp2基因的引物序列。pcr扩增体系如下：模板cdna1μl，primerstarhsdnapolymerase(2.5u/μl)0.5μl，5×primestartmbuffer10μl，上下游引物各1μl(10pmol/μl)，dntpmix(2.5mmeach)4μl，并用ddh2o将体积补足50μl。进行两步pcr反应：在98℃2min；98℃10s，55℃1min，72℃1mim/kb，30cycles；72℃5min。通过在含有溴化乙锭的1％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析所得的pcr产物。pcr产物进行序列测定。猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株gp5核苷酸序列如seqno.1所示，gp2核苷酸序列如seqno.3所示，nsp2核苷酸序列如seqno.4所示。表1pcr引物序列实施例3病毒的致病性试验将43日龄猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性仔猪10头随机分成2组，5头/组，第1组为试验组，第2组为对照组，试验组滴鼻接种猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株(攻毒剂量为105.0tcid50/头)，对照组接种dmem培养基。病毒接种后，每日测定仔猪体温，观察临床情况，具体结果见表2。表2猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株对仔猪的致病性结果显示，猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株对仔猪可导致发病，有明显临床症状，剖检有明显肺病变。实施例4猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活苗的制备将实施例1中分离到的猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株培养物接种于pam细胞，按照病毒培养液量的1％(v/v)接入形成单层的pam细胞培养物中，置37℃培养，当细胞病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒，测定毒价。加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(v/v)，37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活后病毒液用ph7.4的pbs液稀释至表3所示的病毒含量，然后与206佐剂(法国seppic公司产品)按照体积比50:50混合，在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟。具体配比见表3。表3猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株灭活苗的制备组别灭活前病毒含量(tcid50/ml)206佐剂含量(v/v％)疫苗1106.050疫苗2107.050疫苗3108.050实施例5灭活疫苗免疫原性试验将43日龄prrsv抗体阴性仔猪20头随机分成4组，5头/组，3～5组为试验组，第6组为对照组，分别按照表4注射疫苗或dmem培养基。表4免疫原性试验动物分组组别注射疫苗免疫剂量3疫苗12ml/头4疫苗22ml/头5疫苗32ml/头6dmem培养基2ml/头疫苗免疫后，每周参照gb/t18641-2002方法中的血清中和试验的方法测定灭活疫苗组的中和抗体效价，结果见表5。表5猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株灭活苗免疫仔猪后的抗体水平表5结果显示，猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株灭活苗免疫仔猪后，能产生较高的中和抗体，且随免疫时间逐渐升高。免疫后28日攻毒，攻毒剂量为猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株病毒105.0tcid50/头，观察临床症状见表6，攻毒后每日测定仔猪体温见表7。表6猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株灭活疫苗免疫仔猪后的攻毒情况表7猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株灭活疫苗免疫仔猪攻毒后体温变化天数3组4组5组6组攻毒后1天39.539.439.539.5攻毒后2天39.439.439.641.0攻毒后3天39.439.739.641.2攻毒后4天39.739.539.441.4攻毒后5天39.639.439.641.4攻毒后6天39.439.439.741.3攻毒后7天39.639.739.741.2表6和表7的结果显示，猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株灭活疫苗免疫仔猪，能阻断病毒感染(出现临床症状)，为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照仔猪攻毒后全部出现临床症状，因此，猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株灭活疫苗具有很好的保护力。实施例6猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白的制备1.猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5基因克隆载体的构建在生长良好的pam细胞上接种猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株或其不同代次的培养物，收获病毒后用takara公司minibestviralrna/dnaextractionkitver.3.0试剂盒提取prrsv基因组rna，反转录为cdna，取1μlcdna作为模板，利用gp5特异性引物(下划线为酶切位点)：gp5-f(5’-3’):cgcggatccttggggaaatgcttgaccg(bamhi)gp5-r(5’-3’):cccaagcttctatggacgaccccattgttc(hindш)进行pcr扩增，利用takara的高保真酶hsdnapolymerase，扩增条件为：98℃2min；98℃10s，55℃1min，72℃1mim/kb，30cycles；72℃5min。pcr产物命名为gp5。其核苷酸序列见seqno.1，推导其氨基酸序列为seqno.2。pcr扩增gp5基因后，胶回收目的片段后，用bamhi和hindш分别双酶切胶回收产物和pfastbactmhta载体(购自invitrogen公司， 货号10584-027)，37℃反应2h，胶回收酶切片段，将回收的gp5连接到pfastbactmhta载体上。酶切体系：10×fdgreenbuffer5μl，dna/载体1-2μg，fdbamhi2μl，fdhindш2μl，补ddh2o至50μl，37℃反应1h。于1％琼脂糖凝胶电泳回收载体和目的片段。建立10μl连接体系：10×t4dnaligasebuffer1μl，t4dnaligase1μl，载体酶切胶回收产物2μl，目的片段酶切胶回收产物6μl，于22℃连接1h，连接产物转化入dh5α感受态细胞。挑取单克隆进行扩大培养后进行pcr鉴定和测序鉴定，鉴定为阳性的质粒，命名为pfastbacht-gp5。2.重组bacmid的获取及鉴定pfastbacht-gp5质粒转化dh10bac感受态细胞(invitrogen，货号：10361-012)，pfastbacht-gp5和感受态细胞中的穿梭质粒bacmid进行转座，用invitrogen的purelinktmhipureplasmiddnaminiprepkit提取获得的重组质粒，并用pucm13forward/pucm13reverse引物鉴定gp5的插入，阳性重组穿梭质粒bacmid命名为bacmid-gp5。3.转染获得重组杆状病毒按照invitrogen公司bac-to-bachbmtoposecretedexpressionsystem的说明书提供的方法进行。6孔板每孔铺8×105个sf9细胞，待细胞贴壁后按照cellfectinⅱ转染试剂的说明书进行转染：分别稀释8μlcellfectinⅱ和1μgbacmid-gp5dna到100μlsf-900ⅱ培养基中，激烈振荡混匀，混合稀释后的dna与稀释后的cellfectinⅱ(总体积～210μl),混合均匀室温孵育15～30min，逐滴滴加到细胞中。转染后72h待出现细胞病变后，收集细胞培养上清，记为p0代重组病毒vbac-gp5。p0代重组病毒vbac-gp5以0.1moi感染sf9细胞，经3代扩大培养后，获得的p3代vbac-gp5用于重组蛋白表达。4.重组杆状病毒感染sf9细胞获得重组蛋白将p3代重组杆状病毒vbac-gp5接种sf9细胞。在500ml三角瓶中悬浮培养sf9细胞，至细胞密度达到7.0×105cell/ml后，按照5moi 的量接种病毒，感染后72h-96h，5000g离心10min，收集细胞沉淀。按5-10ml/克菌体量加入bindbuffer(20mm磷酸钠、500mm氯化钠、20mm咪唑)重悬细胞沉淀，超声裂解细胞，10000g，离心15min，上清按照ge公司his纯化试剂盒(gehealthcare，货号：28-4013-51)说明书进行。sds-page光密度法测定蛋白含量为200μg/ml。实施例7猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5亚单位疫苗的制备将实施例6制备的亚单位抗原，用pbs液(ph7.4)稀释至表8的蛋白含量，与206佐剂(法国seppic公司产品)按照体积比50:50混合，在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟。表8猪繁殖与呼吸综合征病毒亚单位疫苗的制备组别蛋白含量(μg/ml)206佐剂含量(v/v％)疫苗42550疫苗510050实施例8猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5亚单位疫苗的免疫原性试验将43日龄prrsv抗体阴性仔猪15头随机分成3组，5头/组，按照表9注射实施例6制备的疫苗，对照组接种dmem培养基2ml/头。表9亚单位疫苗免疫原性试验动物分组组别注射疫苗免疫剂量7疫苗42ml/头8疫苗52ml/头9dmem培养基2ml/头免疫后28日攻毒，攻毒剂量为猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株病毒105.0tcid50/头，观察临床症状见表10，攻毒后每日测定仔猪体温见表11。表10猪繁殖与呼吸综合征病毒亚单位疫苗免疫仔猪后的攻毒情况表11猪繁殖与呼吸综合征病毒亚单位疫苗免疫仔猪攻毒后体温变化天数7组8组9组攻毒后1天39.439.539.5攻毒后2天39.439.741.4攻毒后3天39.639.641.2攻毒后4天39.739.641.5攻毒后5天39.639.541.4攻毒后6天39.539.341.3攻毒后7天39.539.641.3表10和表11的结果显示，猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株亚单位疫苗免疫仔猪，能阻断病毒感染(出现临床症状)，为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照仔猪攻毒后全部出现临床症状，因此，猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株亚单位疫苗具有很好的保护力。实施例9商品化疫苗对猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株的免疫保护试验将43日龄prrsv抗体阴性仔猪20头随机分成4组，5头/组，10～12组为试验组，第13组为对照组，分别按照表12注射疫苗或dmem培养基。商品化活疫苗由猪繁殖与呼吸综合征病毒jxa1-r株制备，病毒含量为106.0tcid50/ml；商品化灭活疫苗由猪繁殖与呼吸综合 征病毒nvdc-jxa1株制备，病毒含量为灭活前106.0tcid50/ml。表12商品化疫苗的免疫保护试验动物分组组别注射疫苗免疫剂量10疫苗12ml/头11商品化活疫苗2ml/头12商品化灭活疫苗2ml/头13dmem培养基2ml/头免疫后28日攻毒，攻毒剂量为猪繁殖与呼吸综合征病毒hnjz15株病毒105.0tcid50/头，观察临床症状见表13，攻毒后每日测定仔猪体温。表13商品化疫苗免疫仔猪后的攻毒情况表13结果显示，用现有的商品化猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗及灭活疫苗免疫仔猪，均不能完全阻断病毒感染，只能提供部分保护作用，本发明的灭活疫苗能够完全阻断病毒感染，提供完全的保护作用，而对照组仔猪攻毒后全部出现临床症状；进一步通过剖检发现，免疫商品化活疫苗和灭活疫苗组剖检后依然存在不同程度的肺病变， 而本发明灭活疫苗免疫组未发现剖检病变。以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。当前第1页12