1.一种从含有TNFR:Fc融合蛋白和宿主细胞蛋白杂质的蛋白质混合物中纯化TNFR:Fc融合蛋白的方法,包括以下步骤:
(a)从适当的哺乳动物表达系统中获取蛋白质混合物,所述哺乳动物表达系统含有TNFR:Fc融合蛋白和宿主细胞蛋白杂质,所述宿主细胞蛋白杂质含有至少一种蛋白质降解酶;
(b)将所述蛋白质混合物施于亲和层析柱上;
(c)从所述亲和层析柱洗脱TNFR:Fc融合蛋白,其中经洗脱的TNFR:Fc融合蛋白存在于第二蛋白质混合物中,所述第二蛋白质混合物含有的HCP杂质量减少;
(d)将所述第二蛋白质混合物施于混合式层析柱上;
(e)从所述混合式层析柱洗脱TNFR:Fc融合蛋白,其中经洗脱的TNFR:Fc融合蛋白基本上不含有包括至少一种蛋白质降解酶的HCP杂质。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于进一步包括疏水作用柱层析。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于疏水作用柱层析以结合洗脱模式进行。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于疏水作用层析柱选自Toyopearl丁基-650M树脂、Toyopearl苯基-650、丁基琼脂糖凝胶6FF和苯基琼脂糖凝胶6FF。
5.一种从含有TNFR:Fc融合蛋白和包括至少一种蛋白质降解酶的宿主细胞蛋白杂质的蛋白质混合物中纯化TNFR:Fc融合蛋白的方法,包括以下步骤:
(a)从适当的哺乳动物表达系统中获取蛋白质混合物,所述哺乳动物表达系统含有TNFR:Fc融合蛋白和宿主细胞蛋白杂质,所述宿主细胞蛋白杂质包括至少一种蛋白质降解酶;
(b)将所述蛋白质混合物施于亲和层析柱上;
(c)从所述亲和层析柱洗脱TNFR:Fc融合蛋白,其中经洗脱的TNFR:Fc融合蛋白存在于第二蛋白质混合物中,所述第二蛋白质混合物含有的宿主细胞蛋白杂质量减少;
(d)将所述第二蛋白质混合物施于疏水作用层析柱上;
(e)从所述疏水作用层析柱洗脱TNFR:Fc融合蛋白,其中经洗脱的TNFR:Fc融合蛋白存在于第三蛋白质混合物中,所述第三蛋白质混合物含有的宿主细胞蛋白杂质量减少;
(f)将所述第三蛋白质混合物施于混合式层析柱上;
(g)从所述混合式层析柱洗脱TNFR:Fc融合蛋白,其中经洗脱的TNFR:Fc融合蛋白基本上不含有包括至少一种蛋白质降解酶的宿主细胞蛋白杂质。
6.如权利要求1或5所述的方法,其特征在于进一步包括阴离子交换柱层析。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于阴离子交换柱层析以结合洗脱模式进行。
8.如权利要求6所述的方法,其特征在于阴离子交换层析柱选自季铵、磺酸、二乙基氨基乙基和羧甲基。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于阴离子交换层析柱为二乙基氨基乙基。
10.一种从含有TNFR:Fc融合蛋白和包括至少一种蛋白质降解酶的宿主细胞蛋白杂质的蛋白质混合物中纯化TNFR:Fc融合蛋白的方法,包括以下步骤:
(a)从适当的哺乳动物表达系统中获取蛋白质混合物,所述哺乳动物表达系统含有TNFR:Fc融合蛋白和宿主细胞蛋白杂质,所述宿主细胞蛋白杂质包括至少一种蛋白质降解酶;
(b)将所述蛋白质混合物施于亲和层析柱上;
(c)从所述亲和层析柱洗脱TNFR:Fc融合蛋白,其中经洗脱的TNFR:Fc融合蛋白存在于第二蛋白质混合物中,所述第二蛋白质混合物含有的宿主细胞蛋白杂质量减少;
(d)将所述第二蛋白质混合物施于疏水作用层析柱上;
(e)从所述疏水作用层析柱洗脱TNFR:Fc融合蛋白,其中经洗脱的TNFR:Fc融合蛋白存在于第三蛋白质混合物中,所述第三蛋白质混合物含有的宿主细胞蛋白杂质量减少;
(f)将所述第三蛋白质混合物施于阴离子交换层析柱上;
(g)从所述阴离子交换层析柱洗脱TNFR:Fc融合蛋白,其中经洗脱的TNFR:Fc融合蛋白存在于第四蛋白质混合物中,所述第四蛋白质混合物含有的宿主细胞蛋白杂质量减少;
(h)将所述第四蛋白质混合物施于混合式层析柱上;
(i)从所述混合式层析柱洗脱TNFR:Fc融合蛋白,其中洗脱的TNFR:Fc融合蛋白基本上不含有包括至少一种蛋白质降解酶的宿主细胞蛋白杂质。
11.如前述任一项权利要求所述的方法,其特征在于混合式柱层析用于亲和柱层析后的任意步骤中。
12.如权利要求1或5或10所述的方法,其特征在于混合式柱层析包括阴离子交换层析和疏水作用层析。
13.如权利要求12所述的方法,其特征在于混合式柱层析以流动模式进行。
14.如权利要求13所述的方法,其特征在于所述混合式层析柱选自Capto adhere(N-苄基-N-甲基乙醇胺)、Capto MMC(MMC配体)、MEP Hypercel(4-巯甲基吡啶)、HEA Hypercel(己基胺)和PPA Hypercel(苯基丙胺)。
15.如权利要求14所述的方法,其特征在于所述混合式层析柱为Capto adhere(N-苄基-N-甲基乙醇胺)。
16.如权利要求1或5或10所述的方法,其特征在于所述蛋白质混合物施于混合式层析柱上,pH值选自pH 6-pH 6.8。
17.如权利要求1或5或10所述的方法,其特征在于所述蛋白质混合物施于混合式层析柱上,电导率为30-42mS/cm。
18.如权利要求1或5或10所述的方法,其特征在于,权利要求1所述步骤(d)或权利要求5所述步骤(f)或权利要求10所述步骤(h)在使用平衡缓冲液平衡混合式层析柱后进行,所述平衡缓冲液选自10-50mM组氨酸盐酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、180-300mM醋酸钠和180-300mM NaCl。
19.如权利要求18所述的方法,其特征在于所述平衡缓冲液选自20mM组氨酸盐酸盐、240mM醋酸钠和220mM NaCl。
20.一种从含有TNFR:Fc融合蛋白和宿主细胞蛋白杂质的蛋白质混合物中纯化TNFR:Fc融合蛋白的方法,包括以下步骤:
(a)从适当的哺乳动物表达系统中获取蛋白质混合物,所述哺乳动物表达系统含有TNFR:Fc融合蛋白和宿主细胞蛋白杂质,所述宿主细胞蛋白杂质包括至少一种蛋白质降解酶;
(b)将所述蛋白质混合物施于亲和层析柱上;
(c)将亲和层析柱进行多次洗脱;
(d)从所述亲和层析柱洗脱TNFR:Fc融合蛋白,其中经洗脱的TNFR:Fc融合蛋白含有的宿主细胞蛋白杂质量相对于未对亲和层析柱进行多次洗脱的方法更少。
21.如权利要求1或5或10所述的方法,其特征在于亲和层析选自蛋白A或蛋白G层析。
22.如前述任一项权利要求所述的方法,其特征在于TNFR:Fc融合蛋白的纯度≥80%。
23.如前述任一项权利要求所述的方法,其特征在于TNFR:Fc融合蛋白的纯度≥99%。
24.如前述任一项权利要求所述的方法,其特征在于TNFR:Fc融合蛋白为依那西普。
25.如权利要求1或5或10或20所述的方法,其特征在于步骤(b)在使用平衡缓冲液平衡亲和层析柱后进行,所述平衡缓冲液选自30-60mM Tris-Cl,其中pH值为8-9,电导率为10-30mS/cm。
26.如权利要求25所述的方法,其特征在于平衡缓冲液为50mM Tris-Cl,其中pH值为8.5,电导率为18mS/cm。
27.如权利要求1或5或10或20所述的方法,其特征在于步骤(b)进一步包括:
a’)用pH值在8-9范围的缓冲液洗脱结合的TNFR:Fc融合蛋白,和/或
b’)用pH值在4-5范围的缓冲液洗脱结合的TNFR:Fc融合蛋白。
28.如权利要求27所述的方法,其特征在于步骤(a’)包括使用电导率在10-30mS/cm范围的缓冲液。
29.如权利要求27所述的方法,其特征在于步骤(a’)包括使用电导率在50-75mS/cm范围的缓冲液。
30.如权利要求27所述的方法,其特征在于步骤(a’)所述缓冲液选自Tris碱、Tris-Cl、HEPES、三乙醇胺、硼酸盐和甘氨酸-氢氧化钠。
31.如权利要求1或5或10或20所述的方法,其特征在于权利要求1或5或10所述步骤(c)和权利要求20所述步骤(d)包括以线性梯度、分级梯度或两者结合的模式对TNFR:Fc融合蛋白进行洗脱。
32.如权利要求31所述的方法,其特征在于以线性梯度和分级梯度结合的模式对TNFR:Fc融合蛋白进行洗脱。
33.如权利要求32所述的方法,其特征在于所述线性梯度由pH值为2-3.5的洗脱缓冲液和pH值为4-5的洗脱缓冲液通过合适地配比使用来实现。
34.如前述任一项权利要求所述的方法,其特征在于蛋白质降解酶除去至少90%。
35.如前述任一项权利要求所述的方法,其特征在于蛋白质降解酶除去至少99.9%。
36.如前述任一项权利要求所述的方法,其特征在于经洗脱的TNFR:Fc融合蛋白基本上不含至少一种蛋白质降解酶,并在至少两周内保持稳定。
37.如前述任一项权利要求所述的方法,其特征在于经洗脱的TNFR:Fc融合蛋白基本上不含至少一种蛋白质降解酶,并在至少一个月内保持稳定。
38.如前述任一项权利要求所述的方法,其特征在于宿主细胞蛋白杂质选自聚集体、错折叠的蛋白质、片段、内毒素、核酸、病毒和蛋白酶。