本发明涉及重组蛋白，特别是涉及一种新的死亡受体5抗体融合蛋白及其应用。
背景技术：
：据世界卫生组织统计，现阶段全球肝炎患者与健康人群的比例约为1/12，即每12个人当中就可能存在一位肝炎患者，这一比例是艾滋病感染人群的近十倍。目前，世界各国乙肝、丙肝等肝炎患者接近5亿，占全球人口的1/12。中国是肝炎病人最多的国家，每年近30万人因此死于肝脏相关疾病，比如肝硬化、肝癌。全球每年有超过50万人死于原发性肝癌，而其中多达80％的原发性肝癌是由慢性肝炎引起的。在4亿慢性肝炎患者中，有75％生活在亚洲，而中国是全球肝炎和肝癌负担最沉重的国家，我国每年用于乙肝治疗的费用高达1000亿以上。肝炎和心脑血管疾病的发生发展的病症表现不尽相同但却有着共同特点，归根究底，其关键步骤都涉及肝细胞、心肌细胞或脑细胞的快速凋亡。细胞凋亡是由于细胞接受胞外的死亡信号，激活细胞内的凋亡机制引起的细胞主动死亡过程，为维持人体内环境稳定所必需，具有重要的生物学作用。但是当心脑血管疾病或肝炎发生时，多重的紧张性刺激如细胞因子、氧化应激和dna损伤等激活细胞凋亡信号，导致大量的心肌细胞、脑细胞或肝细胞死亡。细胞凋亡是心肌梗死、脑梗死及肝炎致细胞死亡的主要方式，并且被认为是这些疾病发生发展的基本机制，其相关分子也成为治疗心肌梗死、脑梗死及肝炎的关键靶点。抑制细胞凋亡可以有效的阻止肝炎或心脑血管疾病的发展。死亡受体5(deathreceptor,dr5)为肿瘤坏死因子(tnf)受体家族的成员，它是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tnf－relatedapoptosis-inducingligand,trail)的特异性、高亲和力受体，在正常细胞表面低表达，在炎症、缺血或癌变的组织内高表达。全长的dr5含有411个氨基酸，属ⅰ型跨膜糖蛋白。dr5与trail结合后可有效激活胞内信号传导途径，诱导细胞发生凋亡反应。dr5介导的细胞凋亡(图1)与心肌梗死、脑梗死及肝炎诱导的细胞死亡密切相关，其可以作为心脑血管疾病及肝炎的共同药物靶点sdr5(可溶性死亡受体5，solubledr5，简称sdr5)是一种可溶性蛋白，主要由dr5的膜外区组成，大小约26kd。人sdr5蛋白通过与细胞膜表面的dr5竞争结合trail，从而阻断或封闭trail与dr5结合的信号通路，减少功能细胞凋亡，减轻功能细胞损伤，以达到防止器官衰竭和病人死亡的作用。另外，sdr5由于是人体自身蛋白，具有毒性小、无免疫原性的优点，极具作为心肌梗死、脑梗死及肝炎等疾病的“广谱”治疗药物的潜质。现有技术中，r&dsystems公司所售的重组人dr5-fc融合蛋白(科研试剂)在连接之处多了几个不同于已上市的其它融合蛋白药物的氨基酸，活性明显低；稳定性也差，发现有不同比例的n端剪切变异体的存在。这些均给后期的工艺开发和质量标准的制定带来麻烦，不适宜作为生物新药申报。目前，作为药品sdr5-fc蛋白在国内外均未见上市，属于一类新药。世界上还没有任何一家公司能大规模gmp量产sdr5-fc蛋白，只有sigma(货号：d9563,已停产)、enzolifesciences(货号：alx-522-005)、exbioantibodies(货号：exb0007)、abcam(货号：ab83547)和r&dsystems(货号：631-t2)共5家生产sdr5-fc蛋白作为生化试剂，这5种商品所用的dr5基因序列不尽相同，所用的工程细胞种类也有差异，抑制trail蛋白诱导的细胞凋亡能力比较差，而且稳定性差，有不同比例的n端剪切变异体的存在，这些缺点均给后期的工艺开发和质量标准的制定带来麻烦。技术实现要素：基于此，本发明提供一种新的dr5-fc重组蛋白，该dr5-fc重组蛋白生物活性高，稳定性好。本发明提供一种编码dr5-fc重组蛋白的核苷酸序列，其具有：a)seqidno：1所述的碱基序列；或b)与seqidno：1的互补配对序列；或c)与a或b的核苷酸序列编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与a或b的核苷酸序列不同的序列。本发明还提供一种由上述核苷酸序列(seqidno：1)编码的dr5-fc重组蛋白的多肽，其具有seqidno：2所示的氨基酸序列，或氨基酸序列如seqidno：2所示，且氨基酸有一个或多个取代，但生物活性不改变的dr5-fc重组蛋白。本发明的另一目的是提供上述dr5-fc重组蛋白及其编码基因序列的应用。具体技术方案如下。上述dr5-fc重组蛋白在制备治疗自身免疫性肝炎的药物中应用。上述核苷酸序列在制备治疗自身免疫性肝炎的药物中应用。本发明还提供除与seqidno：2属于同一序列的不同碱基组成的dr5-fc重组蛋白及其应用。具体技术方案如下。seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、或seqidno：6所示的氨基酸序列的dr5-fc重组蛋白。上述的dr5-fc重组蛋白在制备治疗自身免疫性肝炎的药物中应用。本发明通过发明人长期的研究，重新选择蛋白基因序列，并实现sdr5-fc蛋白(特别是zj501-5)在cho细胞中的高产(初级细胞克隆筛选产量已达到0.5g～1g/l)，且本发明所述的sdr5-fc重组蛋白(特别是zj501-5)在体外的生物活性比r&dsystems公司的sdr5-fc产品的生物活性高3倍，n端剪切变异体的比例只有1％以下，蛋白药物稳定性高，本发明所述的sdr5-fc重组蛋白(特别是zj501-5)能明显提高cona诱导急性自身免疫性肝炎小鼠的存活率，对治疗人类自身免疫性肝病具有潜在的应用价值。附图说明图1为sdr5-fc的基因琼脂糖凝胶电泳图。图2为dr5-fc重组蛋白(zj501-5)dotblot检测图。图3为8％sds-page非还原电泳图。图4为zj501-5纯化后的sec-hplc分析图。图5为zj501-5经还原后的tic图。图6为zj501-5的数据用biopharmalynx软件处理后的质谱图。图7为商品化trail杀伤活性检测标准曲线。图8为商品化dr5-fc融合蛋白生物检测标准曲线。图9为zj501-5生物活性检测标准曲线。图10为小鼠肝损伤模型实验alt、ast肝功能检测结果示意图。图11为小鼠肝损伤模型实验alt、ast肝功能检测结果示意图。图12为小鼠肝损伤模型实验he染色对照组结果示意图。图13为小鼠肝损伤模型实验he染色sdr5-fc结果示意图。图14为肝组织切片tunel染色结果示意图。其中a为cona模型组小鼠肝组织tunel染色结果；b为dapi染色结果；c为9mg/kgsdr5-fc(501-5)治疗小鼠肝组织tunel染色结果，d为dapi染色结果。图15为肝组织切片trail免疫组化染色结果示意图。其中，a图为cona模型组小鼠肝组织trail免疫组化染色结果，表明大量trail阳性的淋巴细胞被募集到肝脏组织，从而引发trail-dr5介导的肝细胞凋亡；b图为9mg/kgsdr5-fc(501-5)治疗小鼠肝组织trail免疫组化染色结果，表明由于极少trail阳性的淋巴细胞被募集到肝脏组织，因此引发的肝细胞凋亡也少。图16为血清中alt水平的检测结果示意图。图17为血清中ast水平的检测结果示意图。图18为血清中白蛋白水平的检测结果示意图。图19为小鼠的生存曲线示意图。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。一重组dr5-fc表达序列的设计和重组发明人经过长期的经验积累，构建融合蛋白，将人dr5与fc进行多种方式的融合，质谱分析结果显示目的蛋白大多发生了n端11个氨基酸(itqqdlapqqr)的剪切，为了表达出n端较为均一的目的蛋白，最后筛选到融合蛋白常用信号肽基础上去掉中间连接序列和n端18个氨基酸，命名为sdr5-fc(zj501-5)。将质粒进行瞬时转染，表达上清纯化后进行质谱分析和活性分析。zj501-5的dna序列：atgggtgtactgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagcatgtccagcccctcagagggattgtgtccacctggacaccatatctcagaagacggtagagattgcatctcctgcaaatatggacaggactatagcactcactggaatgacctccttttctgcttgcgctgcaccaggtgtgattcaggtgaagtggagctaagtccctgcaccacgaccagaaacacagtgtgtcagtgcgaagaaggcaccttccgggaagaagattctcctgagatgtgccggaagtgccgcacagggtgtcccagagggatggtcaaggtcggtgattgtacaccctggagtgacatcgaatgtgtccacaaagaagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(seqidno.1)zj501-5的氨基酸序列mgvlltqrtllslvlallfpsmasmsspseglcppghhisedgrdcisckygqdysthwndllfclrctrcdsgevelspctttrntvcqceegtfreedspemcrkcrtgcprgmvkvgdctpwsdiecvhkeepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno.2)通过酶切、连接等常规技术手段将sdr5-fc(zj501-5)的基因序列连接到pl101真核表达载体并用hind3和ecor1双酶切进行鉴定。琼脂糖凝胶电泳可见1300bp左右目的片段及9kb左右pl101载体片段，载体构建后双酶切验证结果,结果见图1。二dr5-fc重组蛋白的表达及理化性质的检测将sdr5-fc/pl101质粒用lipofectamine2000进行瞬时转染cho.k1细胞，48小时后收集上清进行dotblot检测，结果为阳性，见图2。复苏cho.k1-s细胞，按5×105/ml10ml重悬后，用freestyletmchoexpressionmedium无血清培养基，并添加终浓度8mmol/l的glutamine培养，置于37℃8％co2振荡培养箱120rpm进行培养。当细胞数>1×106/ml时传代并加液至30ml，维持细胞数2-5×105/ml，后续每次传代并维持密度至2-5×105/ml，cho.k1-s需传代三次以上。转染前一天，摇瓶计数后调整细胞密度至5-6×105/ml100ml，置于37℃8％co2振荡培养箱120rpm进行培养，次日可进行转染。转染当日cho.k1-s计数并计算活率，密度应在1.2-1.5×106/ml，活率>95％。调整密度为1×106/ml，30ml/份加入100ml摇瓶中备用。轻轻颠倒混匀freestyletmmaxreagent四次，取37.5ulfreestyletmmaxreagent加入0.6mloptiprotmsfm稀释液中，同时取37.5ug质粒加入0.6mloptiprotmsfm稀释液中，将两者混合均匀，室温静置10-20min。将孵育后的混合物加入上述准备好的cho.k1-s细胞摇瓶中，37℃8％co2振荡培养箱120rpm培养7天，产物经亲和柱纯化后进行sds-page、sec-hplc和质谱分析。质谱分析步骤：1.先将样品置换缓冲液到50mmnh4fa(ph6.6)中，并检测其浓度。2.各样品用ides进行酶切；3.加入dtt还原二硫键4.质谱进样分析参见sds-page(图3)、zj501-5纯化后的sec-hplc(图4)(蛋白纯度达到99.47％)和zj501-5经还原后的tic(图5)以及zj501-5的数据用biopharmalynx软件处理后的质谱(图6)。根据图5和图6，分析n端剪切体比例，参见下表，其中，m(o)代表相应的蛋白n端多出一个甲硫氨酸并被氧化，s-s代表形成二硫键。o代表第一个氨基酸被氧化。且图5，图6导入数据库后分析得出n端减一个氨基酸和n端减两个氨基酸的结果。n端剪切体比例如下表结果显示，zj501-5的纯度达到99％，仅有微量的n端剪切一个氨基酸和两个氨基酸的变异体出现，比例为1.11％，其中只有约0.11％左右的n端剪切两个氨基酸变异体存在。zj501-5是在zj501-1，zj501-2，zj501-3，zj501-4蛋白的基础上，去除n端不稳定序列，最终获得的n端较为均一的目的蛋白。zj501-1，zj501-2，zj501-3，zj501-4，zj501-5蛋白的n端剪切体比例见下表。样品名称温度n-端剪切体％zj501-137℃31.35zj501-237℃34.72zj501-337℃48.69zj501-437℃51.66zj501-537℃1.11由上可知，zj501-5蛋白药物稳定性最高。zj501-1，zj501-2，zj501-3，zj501-4蛋白的序列如下：zj501-1meqrgqnapaasgarkrhgpgpreargarpgprvpktlvlvvaavlllvsaesalitqqdlapqqraapqqkrsspseglcppghhisedgrdcisckygqdysthwndllfclrctrcdsgevelspctttrntvcqceegtfreedspemcrkcrtgcprgmvkvgdctpwsdiecvhkegssntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno.3)zj501-2meqrgqnapaasgarkrhgpgpreargarpgprvpktlvlvvaavlllvsaesalitqqdlapqqraapqqkrsspseglcppghhisedgrdcisckygqdysthwndllfclrctrcdsgevelspctttrntvcqceegtfreedspemcrkcrtgcprgmvkvgdctpwsdiecvhkeepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno.4)zj501-3mgvlltqrtllslvlallfpsmasmitqqdlapqqraapqqkrsspseglcppghhisedgrdcisckygqdysthwndllfclrctrcdsgevelspctttrntvcqceegtfreedspemcrkcrtgcprgmvkvgdctpwsdiecvhkeepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno.5)zj501-4氨基酸序列(信号肽-目的序列)mgvlltqrtllslvlallfpsmasmaapqqkrsspseglcppghhisedgrdcisckygqdysthwndllfclrctrcdsgevelspctttrntvcqceegtfreedspemcrkcrtgcprgmvkvgdctpwsdiecvhkeepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno.6)。三zj501-5的生物活性鉴定1.建立商品化trail杀伤活性检测方法收集对数生长期的jurkat细胞，计数后用10％fcsrpmi-1640/dmem重悬细胞，调整细胞密度8*104/ml，按100ul/孔加入96孔细胞培养板中，并置于37℃8％二氧化碳培养箱中培养20-24小时。将商品化trail按终浓度500-1000ng/ml重悬于含放线菌素d终浓度0.03ug/ml的上述完全培养液中，用含放线菌素d的完全培养液2倍比商品化trail，共15-20个浓度梯度。将稀释后的样品按100ul/孔加入96孔细胞培养板中，并置于37℃8％二氧化碳培养箱中培养18-22小时。加入新鲜配制的20:1混合的mts/pms显色溶液20ul/孔，37℃8％二氧化碳培养箱中继续孵育培养3-4小时(不需要盖盖子)，用ms酶标仪检测其a490-a630值。采用m5分析软件拟合标准曲线：横坐标为样品的浓度，纵坐标为a490-a630,选用4参数方程回归模型，曲线为反“s”形。1.1商品化trail杀伤活性检测结果采用m5分析软件拟合标准曲线：横坐标为样品的浓度，纵坐标为a490-a630,选用4参数方程回归模型，曲线为反“s”形。软件自动计算ec50为8.382ng/ml，ec90为27.65ng/ml。(参见图7)。2.建立商品化dr5-fc融合蛋白生物活性检测方法收集对数生长期的jurkat细胞，计数后用10％fcsrpmi-1640/dmem重悬细胞，调整细胞密度8*104/ml，按100ul/孔加入96孔细胞培养板中，并置于37℃8％二氧化碳培养箱中培养20-24小时。计算商品化trail杀伤活性的ec90，用含放线菌素d终浓度0.03ug/ml的上述完全培养液中加入终浓度为ec90的trail浓度，用上述含放线菌素d及ec90的trail完全培养液系列倍比商品化dr5-fc(r&dsystems公司)，10ng/ml2倍比15个浓度。将稀释后的样品按100ul/孔加入96孔细胞培养板中，并置于37℃8％二氧化碳培养基中培养18-22小时。加入新鲜配制的20:1混合的mts/pms显色溶液20ul/孔，37℃8％二氧化碳培养箱中继续孵育培养3-4小时(不需要盖盖子)。用ms酶标仪检测其a490-a630值。采用m5分析软件拟合标准曲线：横坐标为样品的浓度，纵坐标为a490-a630,选用4参数方程回归模型，曲线为正“s”形。进行三次不同实验，比较ec50的变异情况。2.1商品化dr5-fc融合蛋白(r&dsystems公司)生物活性检测结果采用m5分析软件拟合标准曲线：横坐标为样品的浓度，纵坐标为a490-a630,选用4参数方程回归模型，曲线为正“s”形。进行三次不同实验，比较ec50的变异情况。ec50为71.82ng/ml。参见图8。3zj501-5生物活性及相对活性检测方法方法同2，样品为zj501-5(seqidno.2)，参比品为商品化dr5-fc(r&dsystems公司)。实验为两个不同操作者分别进行三次实验，计算每次实验zj501-5相对生物活性(％)＝商品化dr5-fcec50/样品dr5-fcec50*100。比较不同操作者及实验批次间的变异情况。3.1本发明zj501-5生物活性检测及相对活性结果zj501-5ec50平均为20.25ng/ml，商品化dr5-fcec50为71.82ng/ml，zj501-5相对生物活性为355％。(参见图9)。四sdr5-fc治疗自身免疫性肝炎、病毒性肝炎。con-a诱导的小鼠肝损伤模型，其病理过程与目前所知的多种急慢性肝病的病理过程相似，特别是其通过活化t淋巴细胞而诱发特异性肝损害的病理特点，可以很好的模拟人类自身免疫性肝病、病毒性肝炎的致病过程。1.36只雄性c57bl/6小鼠，6～8周，随机分成6组，每组6只。模型对照组、sdr5-fc治疗组(27mg/kg、9mg/kg、3mg/kg和1mg/kg)、阳性对照组(silibinin27mg/kg)。2.每只小鼠分别腹腔注射pbs、sdr5-fc(本发明zj501-5)27mg/kg、sdr5-fc9mg/kg、sdr5-fc3mg/kg、sdr5-fc1mg/kg、silibinin27mg/kg，注射体积均为20ml/kg3.1小时后，每只小鼠均尾静脉注射cona17mg/kg，注射体积为10ml/kg，在cona注射后8h、24h分别尾静脉采血，在48hco2处死小鼠并心脏采血，收集肝脏经4％pfa固定后石蜡包埋，切片，he染色。使用deadendfluorometrictunelsystem(promega，g3250)试剂盒，进行肝组织切片tunel染色。使用trail抗体(santacruz,sc-6079)进行肝组织切片免疫组化染色。小鼠血液室温放置1h，3000rpm、4度离心10min，分离上层血清，使用南京建成生物公司alt、ast检测试剂盒进行alt、ast肝功能检测。参见图10-13。图10和图11显示，腹腔注射9mg/kgsdr5-fc能治疗cona诱导的小鼠急性肝炎，主要表现为sdr5-fc能使血清转氨酶水平显著下降。图12和图14(上排2图)显示，小鼠注射cona48h后，肝脏组织出现大面积肝细胞死亡。图13和图14(下排2图)显示，小鼠腹腔注射9mg/kgsdr5-fc，再接受cona诱导48h后，绝大部分肝细胞存活，凋亡肝细胞很少，肝组织结构完整。图15显示小鼠静脉注射cona后，大量trail阳性的淋巴细胞被募集到肝脏组织，从而引发trail-dr5介导的肝细胞大量凋亡；而9mg/kgsdr5-fc(501-5)治疗小鼠后，由于sdr5-fc阻断trail与肝细胞表面的dr5结合，极少trail阳性的淋巴细胞被募集到肝脏组织，因此引发的肝细胞凋亡也很少。实验结论：本发明sdr5-fc能明显抑制急性肝炎小鼠模型中血清转氨酶的升高，抑制肝脏的病理改变，起到明显的保肝效果。在剂量依赖实验中，腹腔注射9mg/kg的sdr5-fc为最佳给药剂量。4.56只雄性c57bl/6小鼠，6～8周，随机分成7组，每组8只。空白对照组、模型对照组、模型给药组(分别给予①～⑤号基因序列sdr5-fc蛋白，依次为seqidno.3-seqidno.6，seqidno.2，10mg/kg)。5.每只小鼠分别尾静脉注射pbs、sdr5-fc①～⑤10mg/kg,，注射体积均为10ml/kg。6.1小时后，每只小鼠均尾静脉注射cona15mg/kg，注射体积为10ml/kg，在cona注射后8h每只小鼠均颌下静脉采血，小鼠血液室温放置1h，3000rpm、4度离心10min，分离上层血清，使用南京建成生物公司alt、ast、白蛋白检测试剂盒进行血清中alt、ast和白蛋白水平的检测。参见图16、图17和图18。实验结论：本发明所述的sdr5-fc(zj501-5)相对其它基因序列的sdr5-fc蛋白能更明显降低cona诱导小鼠肝炎的转氨酶水平(如图16和17)，在相同剂量下，zj501-5序列sdr5-fc蛋白具有更好的疗效，表现为肝功能更好，能合成更多的血清白蛋白分泌到血液中(如图18)。7.21只雄性c57bl/6小鼠，6～8周，随机分成3组，每组7只。模型对照组、②号基因序列sdr5-fc(zj501-2)治疗组32.2mg/kg、⑤号基因序列sdr5-fc(zj501-5)治疗组21.6mg/kg。每只小鼠分别尾静脉注射pbs、sdr5-fc②32.2mg/kg、sdr5-fc⑤21.6mg/kg，注射体积均为20ml/kg。1小时后，每只小鼠均尾静脉注射cona15mg/kg，注射体积为10ml/kg。在cona注射后48h内观察小鼠的存活情况，绘制生存曲线。结果参见图19。实验结论：本发明所述的sdr5-fc(zj501-5)能明显提高cona诱导急性自身免疫性肝炎小鼠的存活率，且zj501-5基因序列的sdr5-fc蛋白在21.6mg/kg的剂量下，疗效要优于剂量为32.2mg/kg的zj501-2基因序列的sdr5-fc蛋白。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12