一种磁性载体固定化脂肪酶制备生物柴油的方法与流程

本发明属于生物工程及能源化工领域，具体涉及一种利用磁性纳米颗粒固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法。

背景技术：

随着经济发展和社会进步，化石能源尤其是石油能源的消费迅速增长，开发新型生物能源作为石化柴油替代产品，能促进新型能源发展、保障能源安全和国家安全。生物柴油不仅具有跟石化柴油相似的燃烧特性，还具有环境友好、较高安全性、良好润滑性及可再生可生物降解等优良特性。

生物柴油各生产工艺中，化学碱催化法已实现工业化生产，虽然其催化剂相对廉价、反应时间短，转化率较高的优点，但仍存在一系列固有的缺陷：(1)对原料品质要求较高，对废油脂、工业下脚料回收利用率低；(2)工艺复杂，能耗高；(3)醇用量大且不易回收利用；(4)副产物甘油难回收利用，催化剂难与产物分离，增大了后续处理的成本，废碱液排放形成新的环境污染源。碱催化法利用精炼油同甲醇合成生物柴油，虽然在一定程度上缓解了能源压力，但是该工艺的固有缺陷决定了它不是最节能环保的，因此更具有环保优势的绿色能源工艺——脂肪酶催化工艺必然是今后发展的趋势。

脂肪酶催化法对原料的选择性低，可利用酸值较高的废油及工业下脚料，且反应条件温和，能耗低；醇用量小，产物及副产物较易分离且无污染排放，克服了碱催化法的严重缺陷，是一种理想的节能环保型工艺。但是，脂肪酶催化的化学反应工艺条件，通常是在各种有机溶剂介质(如生物柴油生产中使用的短链醇)、极端酸碱(如废纸脱墨工业中的强碱性)等条件下，容易导致天然脂肪酶的失活，从而限制了脂肪酶大规模应用，脂肪酶的稳定性差主要体现在游离酶直接暴露在反应体系中，甲醇或乙醇作为酰基受体制备生物柴油时，与油脂的混溶性较差，反应所需量的甲醇或乙醇未溶解的部分将引起酶失活。

脂肪酶的制备方法对生物柴油制备工艺有重要影响。游离酶在有机反应体系内易产生聚集，不利于酶与反应物的接触，反应效率很低，稳定性差。反应物甲醇等短链脂肪醇和副产物甘油对酶有毒性作用，降低了酶的使用寿命和转化率。大量的游离酶无法得到多次的利用，回收困难，加之脂肪酶本身的价格就十分昂贵，使得酶法生产生物柴油的成本很高，无法用于工业的推广使用。通过物理吸附法脂肪酶损失小，且保留了脂肪酶的特异性，但固定化脂肪酶的稳定性差，不易储藏；交联法脂肪酶损失较大，但固定化脂肪酶的稳定性较好，3个月后保留62.5％的活力。

技术实现要素：

针对以上酶法制备生物柴油存在的问题，本发明旨在于克服现有技术的不足，提供一种磁性载体固定化脂肪酶制备生物柴油的方法，通过固定化实现脂肪酶的重复利用，降低酶法催化生产生物柴油的生产成本。

为了解决上述技术问题，本发明通过以下方式来实现：

一种磁性载体固定化脂肪酶制备生物柴油的方法，该方法利用固定化脂肪酶磁性纳米颗粒催化剂对反应进行催化，所述固定化脂肪酶磁性纳米颗粒催化剂由磁性纳米颗粒作为载体采用共价交联的方法对产脂肪酶菌进行固定化制备而成。

所述的磁性纳米颗粒按照下述步骤进行制备：

1)Fe₃O₄@SiO₂磁性复合纳米颗粒的制备：称取Fe₃O₄纳米颗粒放入含有无水乙醇、蒸馏水和氨水混合液的三口烧瓶中，通过超声波处理1h后，保持在30℃恒温下进行机械搅拌30min，滴加正硅酸乙酯(TEOS)，再机械搅拌反应24h，用磁铁进行磁分离，分别再用蒸馏水和无水乙醇进行充分洗涤，磁分离，真空抽滤干燥至质量不变，得松散的粉末状Fe₃O₄@SiO₂磁性复合纳米颗粒；

2)Fe₃O₄@SiO₂-NH₂氨基化磁性纳米颗粒的制备：称取步骤1)中制备的Fe₃O₄@SiO₂磁性复合纳米颗粒放入含有无水乙醇和氨水混合液的三口烧瓶中，通过超声波处理1h后，保持在30℃恒温下滴加γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，机械搅拌反应24h，用磁铁进行磁分离，然后分别用蒸馏水和无水乙醇进行充分洗涤，磁分离，真空抽滤干燥至质量不变，得松散的粉末状Fe₃O₄@SiO₂–NH₂氨基化磁性纳米颗粒；

3)Fe₃O₄@SiO₂-CHO活化磁性纳米颗粒的制备：再称取步骤2)制备的Fe₃O₄@SiO₂-NH₂氨基化磁性纳米颗放入含有戊二醛溶液的三口烧瓶中，通过超声波处理30min后，保持在30℃恒温下机械搅拌12h，用磁铁进行磁分离，再利用磷酸缓冲液充分洗涤，去除多余的戊二醛，真空抽滤干燥至质量不变，得松散的粉末状Fe₃O₄@SiO₂-CHO活化磁性纳米颗粒。

所述的固定化脂肪酶磁性纳米颗粒催化剂的制备，具体包括以下步骤：

1)将产脂肪酶在以下条件进行培养：2.845g/L的葡萄糖，1.2％的橄榄油添加量，初始pH为7.2、1.5％的牛肉膏、0.1％的(NH₄)₂SO₄、接种量2.5％和0.15％的K₂HPO₄.3H₂O，保持在30℃恒温下，发酵48h；

2)将步骤1)中培养好的发酵酶菌液在12000rpm转速下离心10min，收集上清液，将Fe₃O₄@SiO₂-CHO活化磁性纳米颗粒、pH7.0的磷酸缓冲液和发酵酶菌液混合于三角瓶中，通过超声波处理，并在40℃的条件下摇床反应4h进行固定化，然后用磁铁进行磁分离，用磷酸缓冲液充分洗涤，真空抽滤干燥即得到固定化脂肪酶磁性纳米颗粒催化剂。

本发明利用磁性固定化酶催化剂制备生物柴油时，按照摩尔比4:1-12:1加入醇油，加入占油醇和水总体积的10-15％的水和占油、醇、水和催化剂总质量的2-8％的固定化脂肪酶磁性纳米颗粒催化剂，置于反应温度为30-50℃的摇床中进行反应4h。所述油选用橄榄油或者地沟油；所述醇为甲醇。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果：本发明所使用的高产脂肪酶菌株经最优发酵条件发酵后，所产脂肪酶活性较高，固定化工艺与传统的固定化脂肪酶催化转酯化制备生物柴油相比，本发明提供的固定化脂肪酶磁性纳米颗粒催化剂，直接利用微生物发酵液，无需进行脂肪酶的纯化，工艺简单，成本低廉；选用磁性材料便于分离，实现多次重复利用，酯化反应结束后，利用永磁铁将催化剂从反应产物中分离出来，可直接投放于新的反应物中进行反应；具有高的使用寿命、传质效率及转化率：由于催化剂具有磁学效应，因此能够将催化剂放入具有磁场的反应器中进行反应，这样能够使催化剂分布更加均匀，减少沉降碰撞，达到提高传质效率及转化率的效果，转酯反应条件温和，反应时间短，转酯效率高。

附图说明

图1是本发明的固定化脂肪酶磁性纳米颗粒催化剂扫描电镜照片。

图2是实例1使用橄榄油制备生物柴油GC-MS色谱图。

图3是实例2使用地沟油制备生物柴油GC-MS色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明的内容不仅限于实施例所涉及的内容。

称取2g的Fe₃O₄纳米颗粒放入含有200ml无水乙醇、50ml蒸馏水和氨5ml水混合液的三口烧瓶中，通过超声波处理1h后，保持在30℃恒温下进行机械搅拌30min，缓慢加入5ml的正硅酸乙酯，连续搅拌反应24h，磁分离，分别再用蒸馏水和无水乙醇进行充分洗涤，磁分离，真空干燥，得松散的粉末状Fe₃O₄@SiO₂；称取2g的Fe₃O₄@SiO₂放入含有150ml无水乙醇和15ml氨水混合液的三口烧瓶中，超声波分散，保持在30℃恒温下滴加10ml的γ-氨丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌反应24h，磁分离，分别用蒸馏水和无水乙醇进行充分洗涤，磁分离，真空干燥，得松散的粉末状Fe₃O₄@SiO₂–NH₂氨基化磁性纳米颗粒；再称取2g的Fe₃O₄@SiO₂-NH₂氨基化磁性纳米颗放入含有100ml的10％戊二醛溶液的三口烧瓶中，通过超声波处理30min后，保持在30℃恒温下机械搅拌12h，磁分离，再利用磷酸缓冲液充分洗涤，去除多余的戊二醛，真空干燥，得松散的粉末状Fe₃O₄@SiO₂-CHO活化磁性纳米颗粒，密封保存备用。

再称取50mg的Fe3O4@SiO2–CHO活化磁性纳米颗粒，将20ml浓度为1mol/L的pH7.0的磷酸缓冲液和30ml的发酵酶菌液混合于三角瓶中，通过超声波处理，并在40℃的条件下摇床反应4h进行固定化，然后用磁铁进行磁分离，用磷酸缓冲液充分洗涤，真空干燥即得到固定化脂肪酶磁性纳米颗粒催化剂。

实施例1催化橄榄油转酯化制备生物柴油

以橄榄油为原料，以制备的固定化脂肪酶磁性纳米颗粒催化剂进行转酯化试验。将2ml橄榄油和330ml甲醇(醇油摩尔比4:1)混合物装于试管中，加入10％的水(占油醇和水总体积的10％)，再分别加入5％的上述催化剂(占油、醇、水、催化剂总质量的5％)，置于摇床中进行反应，温度40℃，转速160rpm进行反应4h。反应完成后，取出样品在转速为10000rpm离心2min后取上层液体测定甲酯含量，测得转酯效率为98.84％。

实施例2催化地沟油转酯化制备生物柴油

以地沟油为原料，以制备的固定化脂肪酶磁性纳米颗粒催化剂进行转酯化试验。地沟油原料由成都蜀丰有限公司提供，经过机械除杂、膨润土吸附剂吸附过滤、水洗及高速旋转离心除去水分后，用甲醇酯化进行降酸后直接使用。地沟油主要特性如下：酸值28.87mgKOH/g；游离脂肪酸10.27％；平均分子量为885.68。将地沟油和甲醇(醇油摩尔比12:1)混合物装于试管中，加入15％的水(占油醇和水总体积的15％)，再分别加入8％的上述催化剂(占油、醇、水、催化剂总质量的8％)，置于摇床中进行反应，温度50℃，转速160rpm进行反应4h。取出的样品在转速为10000rpm离心2min后取上层液体测定甲酯含量，测得转酯效率为97.19％。

本发明中，以该经活化后的氨基化磁性纳米复合材料为载体，通过共价偶联方式固定高产脂肪酶菌株所产脂肪酶获得的固定化酶催化剂，在催化橄榄油和地沟油作为底物催化制备生物柴油，经4h转酯反应后，转酯效率分别高达98.84％和97.19％。转酯产物主要是棕榈酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、硬脂酸甲酯，均为生物柴油的主要成分。

转酯效率即脂肪酸甲酯得率采用色谱法分析，气相色谱操作条件：FID检测器，毛细管气相色谱柱HP-88，进样量1μl，柱流速1ml/min，升温速度10℃/min，程序升温60℃-230℃。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。