抗CD40抗体的沉默的Fc变体的制作方法与工艺

文档序号:13109046
本申请为2011年11月14日提交的、发明名称为“抗CD40抗体的沉默的Fc变体”的PCT申请PCT\/EP2011\/070058的分案申请,所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2013年5月15日,申请号为201180054907.0。本发明涉及抗CD40抗体的沉默的恒定区片段(Fc)变体和组合物和所述抗体用于治疗病理性病症(例如自身免疫病和炎性病症)和\/或用于预防或降低移植时的移植物排斥风险的用途的方法。虽然一些免疫抑制治疗可用于治疗自身免疫病,但是,在大部分患者群体中,仍然存在对更有效和更安全的药物的大量未满足的需求。例如,尽管已经报道了B细胞耗尽\/抑制疗法如利妥昔单抗(Rituximab)和贝利木单抗(Belimumab)在类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、综合症和多发性硬化中的功效,但这些疗法仅在一部分患病个体中有效,并且利妥昔单抗还伴随有进行性多灶性脑白质病的风险。此外,通常有多种其他的白细胞类型参与这些自身免疫病的病理学,例如巨噬细胞、树突状细胞和T细胞,因此,靶向额外的细胞类型或抑制其功能的关键性免疫学途径的疗法干预具有益处。考虑到CD40-CD154在这些细胞类型的激活和功能中的多种免疫学相关作用,抗CD40抗体可能给予患上述自身免疫病的患者超过现有疗法目前所提供的疗法益处。此外,CD40-CD154相互作用在肠炎性病症(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)中的关键作用,以及CD40途径与多种罕见病症(例如自身免疫性血管炎、寻常型天疱疹和ITP)的病理学的机制关联,都突出了抗CD40抗体在这些适应征中的潜在价值。目前在实体器官移植后使用的现有免疫抑制物提供了优秀的短期功效。在5%–20%的接受者中,在新生期(denovoperiod)中观察到急性排斥(取决于器官、患者群体和方案),而对于任何情况,在新生期内由于急性排斥而失去的移植物的比例都低于5%。目前,尚未满足的关键需求是患者对免疫抑制的耐受性和移植物的长期存活。在肾移植后,33%患者在5年内死亡和\/或失去其移植物;移植接受者的平均死亡年龄是58岁。钙依赖磷酸酶抑制剂(CNI)仍然是绝大部分移植患者的主要免疫抑制疗法。尽管与CNI相关的肾毒性和心血管发病是慢性同种异体移植肾病和具有有功能的移植物的患者死亡的驱动因素之一,备选的原发性免疫抑制尚不能取代CNI。总而言之,长期的移植免疫抑制仍然存在改良的空间。经移植的肾脏的B细胞介导的免疫学破坏可导致低下的长期结果,并且医学界已逐渐认识到对靶向B细胞排斥的新活性剂的需求。Chir12.12是完全人源化的、非激动剂型抗CD40抗体(IgG1,κ),其阻断CD154(也称为CD40配体;CD40L)介导的白细胞活化,并可以在体外介导人白细胞和B细胞淋巴瘤的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)(参见WO2006\/073443)。WO2005\/044306还描述了抗CD40拮抗剂抗体,包括特别是用于治疗自身免疫病症和炎性病症的Chir12.12。此外,当在食蟹猕猴(Macacafascicularis)(食蟹猴(Cynomolgusmonkeys))中作为单一疗法给药时,Chir12.12有效的延迟了肾同种异体移植排斥[Li等人(2008)Transplantation;86(1):10-15]。然而,Chir12.12还可以在非人灵长类(NHP)中介导外周B细胞耗尽。预测具有沉默的ADCC活性的抗CD40mAb相对于亲代抗CD40抗体具有改良的安全性谱,并且特别地更加适合非癌症适应征(例如自身免疫病)和用于移植情况。因此,本发明提供了Fc沉默的抗CD40单克隆抗体,所述抗体保留了亲代抗CD40抗体Chir12.12的非激动性、CD40L阻断特性。特别地,本发明提供了包含针对靶CD40多肽(SEQIDNO:28)的抗体的抗原结合部分的分离的抗体或蛋白质,其特征在于所述抗体或蛋白质a.以10nM或更低的KD结合CD40多肽,和b.包含沉默的IgGFc区。在一个实施方案中,所述抗体或蛋白质以50ng\/ml或更低的IC50抑制CD40L诱导的信号传递。在另一个实施方案中,根据本发明的分离的抗体或蛋白质没有或具有低的关于CD40信号传递的激动剂活性。在另一个实施方案中,根据本发明的抗体或蛋白质包含选自SEQIDNO:17、SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的氨基酸序列的沉默的IgGFc区。在另一个实施方案中,本发明分离的抗体或蛋白质包含分别与Chir12.12的VH(SEQIDNO:9)和Chir12.12抗体的VL(SEQIDNO:10)具有至少60、70、80、90、95、96、97、98、99或100百分比序列同一性的重链(VH)和轻链(VL)可变区。根据本发明的抗体的具体实例是:-包含SEQIDNO:11的重链氨基酸序列和SEQIDNO:12的轻链氨基酸序列的mAb1,-包含SEQIDNO:13的重链氨基酸序列和SEQIDNO:14的轻链氨基酸序列的mAb2,或-包含SEQIDNO:15的重链氨基酸序列和SEQIDNO:16的轻链氨基酸序列的mAb3。根据本发明的分离的抗体或蛋白质可用作药物。特别地,其适合用于治疗自身免疫病症、炎性病症和\/或预防或降低移植中的移植物排斥风险。根据本发明的分离的抗体或蛋白质特别可用于治疗多发性硬化、系统性红斑狼疮、综合症、类风湿关节炎、移植排斥和移植物抗宿主疾病。本发明还涉及药物组合物,所述药物组合物包含与至少一种可药用的赋形剂、稀释剂或载剂组合的根据本发明的上述抗体或蛋白质。所述药物组合物还可以包含其他活性成分。本发明还涉及根据本发明的抗体或蛋白质的冻干物或液体制剂。本发明还涉及编码根据本发明的抗体或蛋白质的分离的核酸,以及包含选自SEQIDNO:22至27的至少一种核酸的相应的克隆或表达载体。本发明还涉及包含一个或多个如上文定义的克隆或表达载体的宿主细胞。本发明还提供了用于生产本发明的抗体或蛋白质的方法,包括培养上文定义的宿主细胞,纯化和回收所述抗体或蛋白质。为了更便于理解本发明,首先定义一些术语。详细的说明书全文还提供了其他定义。术语“免疫应答”指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏生产的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用,所述作用导致选择性破坏、消灭或从人体中清除侵入的病原体、感染了病原体的细胞或组织、癌细胞或,在自身免疫病或病理性炎症的情况下,正常的人细胞或组织。“信号传导途径”或“信号传递活性”指一般由蛋白质-蛋白质相互作用(如生长因子与受体的结合)起始的生物化学的因果关系,导致信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分。一般而言,传递涉及在一系列导致信号传导的反应中的一种或多种蛋白质上的一个或多个酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的特异性磷酸化。倒数第2个过程通常包括细胞核事件,导致基因表达的改变。除非另外提及,术语CD40指人CD40,例如SEQIDNO:28中定义的。术语“抗体”在本文中包括完整的抗体和任何抗原结合片段(即,“抗原结合部分”)或其单链。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域:CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域:CL组成。VH和VL区可以进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区,其中散布被称为框架区(FR)的更保守区域。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成,从氨基端至羧基端按下列顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合,包括免疫系统中的多种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗原部分”)在本文中指保留了与抗原(例如,CD40的一部分)特异性结合能力的抗体的全长或一个或多个片段。已显示可以通过全长抗体的片段实施抗体的抗原结合功能。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;F(ab)2片段,包括通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段;由VH和CH1结构域组成的Fd片段;由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段;由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,1989Nature341:544-546);和分离的互补决定区(CDR),或包含此类抗原结合部分的任何融合蛋白。此外,虽然Fv片段的2个结构域VL和VH由单独的基因编码,可以使用重组方法,通过合成的接头连接它们,使其能够以单链蛋白质的方式制备,其中VL和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv);参见例如,Bird等人,1988Science242:423-426;和Huston等人,1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。术语抗体的“抗原结合部分”也旨在涵盖此类单链抗体。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的,并以与完整抗体相同的方式筛选具有用途的片段。在本文中,术语“IgGFc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域,包括天然序列的Fc区和变体Fc区。人IgG重链Fc区一般定义为包含从IgG抗体的C226位或P230位至羧基端的氨基酸残基。Fc区中的残基编号是Kabat的EU索引。可以在例如抗体生产或纯化过程中去除Fc区的C端赖氨酸(残基K447)。因此,本发明的抗体组合物可以包含去除了所有K447残基的抗体群、没有去除K447残基的抗体群,和具有有和没有K447残基的抗体混合物的抗体群。“分离的抗体”在本文中指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体(例如,特异性结合CD40的分离的抗体基本不含与非CD40的其他抗原特异性结合的抗体)。然而,特异性结合CD40的分离的抗体可以与其他抗原具有交叉反应性,如来自其他(非人)物种的CD40分子。此外,分离的抗体可以基本不含其他细胞材料和\/或化学物。术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”在本文中指单种分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组合物表现出针对特别的表位的单种结合特异性和亲和性。术语“人源化抗体”在本文中旨在包括含有最少的源自非人免疫球蛋白序列的序列的抗体。在大部分情况下,人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体),其中来自受体的高变区(也称为互补决定区或CDR)的残基被具有理想特异性、亲和性和能力的来自非人物种(如小鼠、大鼠、兔,或非人灵长类)的高变区残基(供体抗体)替换。词组“互补决定区”指共同定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和性和特异性的氨基酸序列。参见例如,Chothia等人(1987)J.Mol.Biol.196:901-917:Kabat等人(1991)USDept.ofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)。词组“恒定区”指产生效应功能的抗体分子部分。在之前的工作中,为了生产用于人类疾病疗法的非免疫原性抗体,用人恒定区取代小鼠恒定区。目标人源化抗体的恒定区源自人免疫球蛋白。可以按照Winter及其同事的方法(Jones等人(1986)Nature321:522-525;Riechmann等人(1988)Nature332:323-327:Verhoeyen等人(1988)Science239:1534-1536),通过用相应的人抗体序列取代啮齿类和突变体啮齿类的CDR或CDR序列,实施人源化。在一些情况下,用相应的非人残基替换人免疫球蛋白的一个或多个可变区的框架区中的残基(参见例如,美国专利号5,585,089;5,693,761;5,693,762;和6,180,370)。此外,人源化的抗体可以包含未见于受体抗体或供体抗体中的残基。本发明的人源化抗体还至少包含一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)。通常是人免疫球蛋白的恒定区,并且在本发明的情况下,是沉默的FcIgG区。本发明的抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如,由体外随机或点特异性诱变或体内体细胞突变所导入的突变)。特别地,术语“人源化的抗体”包括包含FcIgG区的沉默的变体的抗体。术语“人源化单克隆抗体”指表现出单种结合特异性的抗体,所述抗体具有从非人序列人源化的可变区。术语“重组抗体”在本文中包括所有通过重组手段制备、表达、生成或分离的人抗体或人源化抗体,如从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的动物(例如,小鼠)或从其制备的杂交瘤中分离的抗体;从经转化以表达人抗体或人源化抗体的宿主细胞中(例如转染瘤)分离的抗体;从重组体,组合的人抗体文库中分离的抗体;和通过涉及将全部或部分人免疫球蛋白基因剪接至其他DNA序列的任何其他手段,制备、表达、生成或分离的抗体。此类重组人抗体或人源化抗体具有这样的可变区,其中框架和CDR区可源自人种系免疫球蛋白序列。然而,在一些实施方案中,可以对此类重组人抗体或人源化抗体进行体外突变(或者,当使用人Ig序列的动物转基因时,进行体内体细胞突变),并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列,所述序列尽管源自并且与人种系VH和VL序列相关,但是可能并非天然存在于体内的人抗体种系库中。在本文中,“同种型”指由重链恒定区基因提供的抗体类别(例如,IgM、IgE、IgG如IgG1或IgG4)。不同的同种型具有不同的效应子功能。例如,野生型人IgG1和IgG3同种型介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。词组“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”和“针对抗原的抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。在本文中,“特异性结合CD40多肽”的抗体或蛋白质意指以100nM或更低、10nM或更低、1nM或更低的KD结合人CD40多肽的抗体或蛋白质。“与非CD40的抗原交叉反应”的抗体意指以1μM或更低,100nM或更低,10nM或更低,1nM或更低的KD结合抗原的抗体。“不与特别的抗原交叉反应”的抗体意指以100nM或更高的KD,或1μM或更高的KD,或10μM或更高的KD结合抗原的抗体。在一些实施方案中,在标准结合测定中,不与抗原交叉反应的此类抗体实质上不表现出与这些蛋白质可检测的结合。术语“K缔合”或“Ka”在本文中意指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率,而术语“K解离”或“Kd”在本文中意指特别的抗体-抗原相互作用的解离速率。术语“KD”在本文中意指解离常数,所述解离常数是从Kd与Ka的比(即,Kd\/Ka)获得的并且表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域普遍确立的方法,确定抗体的KD值。用于确定抗体的KD的方法是通过使用表面等离子体共振,或使用生物传感器系统,如系统。在本文中,术语“亲和性”指在单个抗原性位点上,抗体和抗原之间的相互作用强度。在每个抗原性位点中,抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与抗原在多个位点相互作用;相互作用越多,亲和性越强。在本文中术语“亲合力”指抗体-抗原复合物的整体稳定性或强度的信息化度量。受三种主要因素控制:抗体表位亲和性;抗原和抗体两者的效价;和相互作用部分的结构排列。这些因素最终定义抗体的特异性,即,特别的抗体与精确的抗原表位结合的可能性。在本文中,术语“CD40拮抗剂”意指这样的抗体或蛋白质,所述抗体或蛋白质在人细胞测定(如CD40L介导的PBMC增殖测定)中,在存在CD40L的条件下,抑制CD40诱导的信号传递活性。下文实例中更详细地描述了此类测定。在一些实施方案中,如在CD40L介导的PBMC增殖测定中所测量的,本发明的抗体或蛋白质抑制CD40L诱导的信号传递的IC50为500ng\/ml或更低,优选地IC50为50ng\/ml或更低,例如IC50为20ng\/ml或更低。在本文中,“无激动剂活性”的抗体意指这样的抗体,所述抗体在基于细胞的测定(如CD40L介导的PBMC增殖测定)中,在缺少CD40L的条件下,不显著增加CD40介导的信号传递活性。下文实例中更详细地描述了此类测定。在本文中,术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞的细胞毒性”活性指细胞耗尽活性。可以通过下文实施例中更详细地描述的ADCC测定来测量ADCC活性。在本文中,术语“沉默的”抗体指在实施例中描述的ADCC测定中表现出无或低的ADCC活性的抗体。在一个实施方案中,术语“无或低的ADCC活性”意指如在实施例中所描述的ADCC测定中所测量的,沉默的抗体表现出低于50%特异性细胞裂解,例如低于10%特异性细胞裂解的ADCC活性。无ADCC活性意指沉默的抗体表现出低于1%的ADCC活性(特异性细胞裂解)。在特别的实施方案中,如在实施例中所描述的ADCC测定所测量的,根据本发明的沉默的抗体不表现出任何显著的ADCC活性。可以通过突变抗体的Fc区获得沉默的效应子功能并且已在本领域中描述:LALA和N297A(Strohl,W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.第20卷(6):685-691);和D265A(Baudino等人,2008,J.Immunol.181:6664-69;Strohl,W.,见上文)。沉默的FcIgG1抗体的实例包含所谓的LALA变体,其包含IgG1Fc氨基酸序列中的L234A和L235A突变。沉默的IgG1抗体的另一个实例包含D265A突变。沉默的IgG1抗体的另一个实例包含N297A突变,所述突变导致aglycosylated\/无糖基化的抗体。在本文中,术语本发明的抗体或蛋白质的“选择性”指抗体或蛋白质结合某些靶多肽而不结合密切相关的多肽。在本文中,术语抗体的“高亲和性”指对靶抗原具有1nM或更低的KD的抗体。在本文中,术语“对象”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物,例如,哺乳动物和非哺乳动物,如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。在本文中,术语“优化的”意指使用生产细胞或生物(一般是真核细胞,例如,毕赤酵母的细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、中华仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞)中优选的密码子的经改变以编码氨基酸序列的核苷酸序列。改造优化的核苷酸序列以完全或尽可能多地保留了由起始核苷酸序列最初编码的氨基酸序列,其也称为“亲代”序列。本文中的优化的序列经过改造以具有在CHO哺乳动物细胞中优选的密码子,然而,本文也设想了这些序列在其他真核细胞中的优化表达。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也被称为是优化的。在本文中,两条序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置数的函数(即,%同一性=相同的位置#\/总位置#x100),考虑了两条序列的最佳比对所需要引入的空位数和每个空位的长度。可以使用如下所述的数学算法,实现序列比较和确定两条序列的百分比同一性。可以使用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17,1988),确定两条氨基酸序列之间的百分比同一性,所述算法已经整合到ALIGN程序(2.0版)中,使用PAM120权重残基表,空位长度罚分为12,空位罚分为4。可选的,可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol,Biol.48:444-453,1970)算法,确定两条氨基酸序列之间的百分比同一性,所述算法已经整合到GCG软件包的GAP程序中(可自http:\/\/www.gcg.com获得),使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵,空位权重为16、14、12、10、8、6或4,长度权重为1、2、3、4、5或6。还可以使用例如核酸序列的BLASTN程序算法,确定两条核苷酸氨基酸序列之间的百分比同一性,使用字长度(W)11,期望值(E)10,M=5,N=4作为默认值,比较两条链。重组抗体本发明的抗体包括人源化重组抗体mAb1-mAb3,将其分离并根据其全长重链和轻链氨基酸序列结构性表征,如下表1所述。表1:mAb1-mAb3的全长重链和轻链氨基酸序列抗体全长重链氨基酸序列全长轻链氨基酸序列mAb1SEQIDNO:11SEQIDNO:12mAb2SEQIDNO:13SEQIDNO:14mAb3SEQIDNO:15SEQIDNO:16本发明的此类分离的抗体mAb1-mAb3的相应可变区,VH和VL氨基酸序列都源自相同的抗体Chir12.12,该抗体之前描述在例如WO2006\/073443中并由SEQIDNO:7的VH氨基酸序列和SEQIDNO:8的VL氨基酸序列组成。相比原始的CHIR12.12,本发明的抗体一个重要的差异是具有由沉默的FcIgG区,例如沉默的FcIgG1区组成的Fc区。特别地,表2概括了与原始的CHIR12.12抗体相比较,为获得抗体mAb1-mAb3而对FcIgG1区实施的修饰。表2:为获得mAb1-mAb3的FcIgG1区的修饰抗体FcIgG1区的修饰Fc区氨基酸序列mAb1N297ASEQIDNO:17mAb2D265ASEQIDNO:18mAb3L234A\/L235ASEQIDNO:19本发明的其他抗体包括这样的抗体,所述抗体具有通过氨基酸缺失、插入或替换被突变但与CHIR12.12的VH和VL区,分别地SEQIDNO:7和SEQIDNO:8具有至少60、70、80、90、95、96、97、98、99或100百分比同一性的氨基酸,并且包含沉默的IgGFc区,例如沉默的IgG1Fc区。在一些实施方案中,本发明的抗体是mAb1-mAb3的任一种的突变体变体,其中所述突变体变体抗体包括这样的突变体氨基酸序列,其中较之CHIR12.12的VH和VL区,分别地SEQIDNO:7和SEQIDNO:8,VH和VL区中的不超过1、2、3、4或5个氨基酸被氨基酸缺失、插入或替换所突变,并保留了与mAb1、mAb2或mAb3相同的恒定区。下表3显示了mAb1-mAb3的全长轻链和重链的核苷酸编码序列。表3:全长重链和轻链的DNA编码序列编码本发明抗体的其他核酸包括这样的核酸,所述核酸通过核苷酸缺失、插入或替换被突变,但仍与如例如SEQIDNO:20和SEQIDNO:21中分别描述的序列中所示的CHIR12.12的VH和VL相应的编码区具有至少60、70、80、90、95、96、97、98、99或100百分比同一性,并包含沉默的IgGFc区,例如,沉默的IgG1Fc区的编码序列。在一些实施方案中,其包括变体核酸,其中不超过1、2、3、4或5个核苷酸通过在VH和VL编码区(例如SEQIDNO:20和SEQIDNO:21中分别描述的序列中所示的VH和VL编码区)中的核苷酸缺失、插入或替换被改变,并保留了与mAb1、mAb2或mAb3相应的编码序列相同的恒定区编码序列。同源抗体除本发明的重组抗体mAb1-mAb3外,本发明还涵盖了保留mAb1-mAb3抗体的理想的功能性质的同源抗体或蛋白质。特别地,所述根据本发明的同源抗体或蛋白质是包含针对靶CD40多肽(SEQIDNO:28)的抗体的抗原结合部分的抗体或蛋白质,其特征是所述抗体或蛋白质:a)以10nM或更低的KD结合CD40多肽,和b)包含沉默的IgGFc区并且其中所述同源抗体或蛋白质保留了原始mAb1-mAb3抗体的理想的功能性质。原始mAb1-mAb3抗体的理想的功能性质可以选自一种或多种下列性质:(i)其特异性结合CD40,例如,KD为100nM或更低,10nM或更低,或1nM或更低,如Biacore测定中测量的;(ii)其是CD40拮抗剂,例如,其抑制CD40L诱导的信号传递,如CD40L介导的PBMC增殖测定中测量的;(iii)其表现出无或低的激动剂活性,如CD40L介导的PBMC增殖测定中测量的;(iv)其与食蟹猕猴CD40多肽交叉反应;(v)其具有无或低的ADCC活性;和(vi)其具有适合药物研发的性质。在一个特定的实施方案中,根据本发明的所述同源抗体或蛋白质包含沉默的IgG1Fc区,例如,选自SEQIDNO:17、SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的沉默的IgG1Fc区。在一个特定的实施方案中,本发明涉及这样的抗体或蛋白质,所述抗体或蛋白质具有与上述抗体mAb1-mAb3(特别是在表1中)的相应的氨基酸或核苷酸序列同源的可变区重链和轻链核苷酸序列,或可变区重链和轻链氨基酸序列,或全部6个CDR氨基酸序列或核苷酸编码序列,且所述抗体或蛋白质包含选自mAb1的Fc区(SEQIDNO:17)、mAb2的Fc区(SEQIDNO:18)和mAb3的Fc区(SEQIDNO:19)的沉默的IgGFc区,其中所述同源抗体或蛋白质特异性结合CD40,且抗体或蛋白质表现出下列功能性质:其是CD40拮抗剂、其表现出无或低的激动剂活性,和其具有无或低的ADCC活性。例如,本发明涉及与mAb1-mAb3同源的抗体或蛋白质,所述抗体或蛋白质包含选自mAb1的Fc区(SEQIDNO:17)、mAb2的Fc区(SEQIDNO:18)和mAb3的Fc区(SEQIDNO:19)的沉默的IgGFc区,并包含其中CDR序列与mAb1-mAb3的相应的CDR序列,分别为SEQIDNO:1-6,共享至少60、70、90、95、96、97、98、99或100百分比序列同一性的可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列,其中所述同源抗体或蛋白质特异性结合CD40,且同源抗体或蛋白质表现出下列功能性质:其是CD40拮抗剂,其表现出无或低的激动剂活性,和其具有无或低的ADCC活性。在相关的具体实施方案中,同源抗体或蛋白质a)以1nM或更低的KD结合CD40;b)以50ng\/ml或更低的IC50抑制CD40L诱导的信号传递,如实施例中所描述的CD40L介导的PBMC增殖测定中测量的;c)具有无或低的激动剂活性,如在生物测定(如实施例所述的CD40L介导的PBMC增殖测定)中测量的;和d)具有无或低的ADCC活性。本发明还涉及与mAb1-mAb3同源的抗体或蛋白质,所述抗体或蛋白质包含选自mAb1的Fc区(SEQIDNO:17)、mAb2的Fc区(SEQIDNO:18)和mAb3的Fc区(SEQIDNO:19)的沉默的IgGFc区,并包含与mAb1-mAb3的相应的(VH)和(VL)序列,分别是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8,共享至少80、90、95、96、97、98、99或100百分比序列同一性的可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列,其中所述同源抗体或蛋白质特异性结合CD40,且抗体或蛋白质表现出下列功能性质:其是CD40拮抗剂,其表现出无或低的激动剂活性,和其具有无或低的ADCC活性。在相关的具体实施方案中,所述同源抗体或蛋白质a)以1nM或更低的KD结合CD40;b)以50ng\/ml或更低的IC50抑制CD40L诱导的信号传递,如实施例所述的CD40L介导的PBMC增殖测定中测量的;c)具有无或低的激动剂活性,如在生物测定(例如实施例所述的CD40L介导的PBMC增殖测定)中测量的;和d)具有无或低的ADCC活性。在另一个实例中,本发明涉及与mAb1-mAb3同源的抗体或蛋白质,所述抗体或蛋白质包含选自mAb1的Fc区(SEQIDNO:17)、mAb2的Fc区(SEQIDNO:18)和mAb3的Fc区(SEQIDNO:19)的沉默的IgGFc区,其中:可变重链和轻链是由与mAb1-mAb3的可变重链和轻链的相应编码核苷酸序列至少80%,至少90%,至少95%或100%相同的核苷酸序列编码的,其中所述同源抗体或蛋白质特异性结合CD40,且抗体或蛋白质表现出下列功能性质:其是CD40拮抗剂、其表现出无或低的激动剂活性,和其具有无或低的ADCC活性。在相关的具体实施方案中,所述同源抗体或蛋白质a)以1nM或更低的KD结合CD40;b)以50ng\/ml或更低的IC50抑制CD40L诱导的信号传递,如实施例所述的CD40L介导的PBMC增殖测定)中测量的;c)具有无或低的激动剂活性,如在生物测定,(例如实施例所述的CD40L介导的PBMC增殖测定中测量的;和d)具有无或低的ADCC活性。可以通过编码核酸分子的诱变(例如,定点或PCR-介导的诱变),随后使用下文实施例中所述的功能测定测试编码的改变的抗体所保留的功能(即,以上所示出的功能),来获得具有变体氨基酸序列的抗体。在一些实施方案中,上述与mAb1-mAb3同源的抗体或蛋白质具有保守性序列修饰。在本文中,术语“保守性序列修饰”意指氨基酸取代,其中用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如,天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此,可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换本发明的抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基,并可以使用本文所述的功能测定测试被改变的抗体的保留的功能。可以通过本领域已知的标准技术(如定点诱变和PCR-介导的诱变),向本发明的抗体中引入修饰。编码本发明抗体或蛋白质的核酸分子本发明的另一个方面涉及编码上述本发明的抗体或蛋白质的核酸分子。mAb1至mAb3的任一种的轻链和重链核苷酸序列的实例可源自表3(显示了mAb1至mAb3的重链和轻链的整个核苷酸编码序列)。根据本发明的轻链和重链核苷酸序列的其他实例是编码表1中所述的mAb1、mAb2或mAb3的全长重链和\/或轻链氨基酸序列的任何序列。本发明还涉及源自已经对在哺乳动物细胞(例如CHO细胞系)中蛋白质表达进行了优化的后一序列的核酸分子。核酸可以存在于整个细胞中、细胞裂解液中,或者可以是处于部分纯化或基本纯化形式的核酸。当通过标准技术,包括碱\/SDS处理、CsCl条带化、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和其他本领域普遍已知的技术从其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)中纯化时,核酸是“分离的”或“成为基本纯的”。参见F.Ausubel,等人编著,1987CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA,可以含有或不含内含子序列。在实施方案中,核酸是cDNA分子。核酸可以存在于载体,如噬菌体展示载体中,或在重组质粒载体中。可以使用标准分子生物学技术获得本发明的核酸。一旦获得编码例如VH和VL片段的DNA片段,就可以通过标准的重组DNA技术进一步操作这些DNA片段,例如将可变区基因转化至全长抗体链基因、至Fab片段基因或至scFv基因。在这些操作中,将编码VL或VH的DNA片段与另一DNA分子,或与编码包含如SEQIDNO:17-19中所定义的Fc区的mAb1-mAb3的抗体恒定区的片段有效连接。术语“有效连接的”在上下文中意指以功能性方式连接的2个DNA片段,例如,使得由2个DNA片段所编码的氨基酸序列仍然保持符合读框,或使得蛋白质在理想的启动子的控制下表达。可以通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一种DNA分子有效连接,将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如,Kabat,E.A.等人,1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)并且可以通过标准的PCR扩增获得涵盖这些区域的DNA片段。可以在包含如SEQIDNO:17-19中定义的Fc区的IgG1同种型中选择重链恒定区。可以通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区(CL)的另一种DNA分子有效连接,将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如,Kabat,E.A.,等人,1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)并且可以通过标准的PCR扩增获得涵盖这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。生成生产单克隆抗体的转染瘤可以使用例如本领域普遍已知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如,Morrison,S.(1985)Science229:1202),在宿主细胞转染瘤中生产本发明的抗体或蛋白质。例如,为了表达抗体,可以通过标准的分子生物学或生物化学技术(例如,DNA化学合成、使用表达目标抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA并可以将DNA插入到表达载体中,使基因与转录和翻译控制序列有效连接。在上下文中,术语“有效连接的”意指抗体基因连接到载体中,使载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调控抗体基因转录和翻译的预期功能。选择与所使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入到单独的载体中,或更典型地将两种基因插入到相同的表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入到表达载体中(例如,连接抗体基因片段和载体上的互补的限制性位点,或者当不存在限制性位点时平末端连接)。通过将本文所述抗体的轻链和重链可变区插入到已经编码对应于mAb1、mAb2或mAb3的所述恒定区的理想的序列的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中,使VH区段与载体中的CH区段有效连接,VL区段与载体中的CL区段有效连接,本文所述抗体的轻链和重链可变区可用于生成全长抗体基因。额外地或备选地,重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中,使信号肽与抗体链基因的氨基端符合读框连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即,来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。除抗体链基因外,本发明的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调控序列。术语“调控序列”意在包括启动子、增强子和其他控制抗体链基因转录或翻译的表达控制元件(例如,多聚腺苷酸化信号)。此类调控序列描述在例如Goeddel(GeneExpressionTechnology.MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA1990)中。本领域熟练的技术人员可理解表达载体的设计,包括调控序列的选择取决于此类因素,如转化宿主细胞的选择、理想的蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括指导在哺乳动物细胞中高水平的蛋白质表达的病毒元件,如源自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如,腺病毒主要后期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和\/或增强子。备选地,可以使用非病毒调控序列,如泛素启动子或P-球蛋白启动子。此外,调控元件由不同来源的序列组成,如SRa启动子系统,其含有来自SV40早期启动子的序列和1型人T细胞白血病病毒的长末端重复(Takebe,Y.等人,1988Mol.Cell.Biol.8:466-472)。除抗体链基因和调控序列外,本发明的重组表达载体可以携带其他序列,如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如,复制起点)和可选择的标志物基因。可选择的标志物基因促进对已经导入了载体的宿主细胞的选择(参见例如,美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017,均为Axel等人)。例如,通常可选择的标志物基因赋予导入了载体的宿主细胞对药物的抗性,如G418、潮霉素或氨甲喋呤。可选择的标志物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在dhfr-宿主细胞中的氨甲喋呤选择\/扩增)和neo基因(用于G418选择)。为了表达轻链和重链,通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的多种形式旨在涵盖常用于将外源DNA导入至原核或真核宿主细胞中的多种技术,例如,电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体。讨论抗体在真核细胞(例如哺乳动物宿主细胞、酵母或丝状真菌)中表达,因为此类真核细胞,特别是哺乳动物细胞,比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠且免疫活性的抗体。在一个特别的实施方案中,根据本发明的克隆或表达载体包含与合适的启动子序列有效连接的下列编码序列(a)-(c)中的至少一种:(a)分别编码mAb1的全长重链和轻链的SEQIDNO:22和SEQIDNO:23;(b)分别编码mAb2的全长重链和轻链的SEQIDNO:24和SEQIDNO:25;或(c)分别编码mAb3的全长重链和轻链的SEQIDNO:26和SEQIDNO:27。用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞,描述在Urlaub和Chasin,1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220中,使用DHFR可选择的标志物,例如描述在R.J.Kaufman和P.A.Sharp,1982Mol.Biol.159:601-621中)、CHOK1dhfr+细胞系、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地,用于NSO骨髓瘤细胞的另一种表达系统是GS基因表达系统,所述表达系统显示在PCT公开WO87\/04462、WO89\/01036和EP0338841中。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时,通过培养宿主细胞一段时间来生产抗体,所述时间足以允许抗体在宿主细胞内表达或将抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中。可以使用标准的蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体(参见例如Abhinav等人,2007,JournalofChromatography848:28-37)。在一个特定的实施方案中,本发明的宿主细胞是用表达载体转染的宿主细胞,所述表达载体具有选自与合适的启动子序列有效连接的,分别适合表达mAb1-mAb3的(a)-(c)的编码序列,:(a)SEQIDNO:22和SEQIDNO:23;(b)SEQIDNO:24和SEQIDNO:25;和,(c)SEQIDNO:26和SEQIDNO:27。然后,可以在适合表达和生产本发明的抗体的条件下进一步培养后者宿主细胞,所述抗体分别选自mAb1-mAb3。双特异性分子在另一方面,本发明的特征是包含本发明的抗CD40抗体或蛋白质的双特异性或多特异性分子。可以衍生本发明的抗体或蛋白质或将其与另一功能性分子(例如,另一种肽或蛋白质(例如,受体的另一种抗体或配体))连接,以生成结合至少两种不同的结合位点或靶分子的双特异性分子。实际上,可以衍生本发明的抗体或将其与一种以上的其他功能性分子连接,以生成结合多于两种的不同的结合位点和\/或靶分子的多特异性分子;此类多特异性分子也旨在涵盖在本文使用的术语“双特异性分子”中。为了产生本发明的双特异性分子,本发明的抗体或蛋白质可以与一种或多种其他的结合分子(例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)功能性连接(例如,通过化学偶联、基因融合、非共价缔合等),从而获得双特异性分子。因此,本发明包括双特异性分子,所述双特异性分子包含至少一种对CD40的第一种结合特异性(例如mAb1-mAb3中任一种的一个抗原结合部分),和对第二靶表位的第二种结合特异性。例如,第二靶表位是CD40的不同于第一靶表位的另一个表位。另一个实例是这样的双特异性分子,所述分子包含至少一种对CD40的第一种结合特异性(例如mAb1-mAb3中任一种的一个抗原结合部分),和对CD40内的表位的第二种结合特异性。额外地,对于其中多特异性分子是双特异性的发明,分子还可以包括除第一和第二靶表位以外的第三种结合特异性。可以使用本领域已知的方法,通过缀合组成部分的特异性结合物制备本发明的双特异性分子。例如,可以单独生成双特异性分子的每个特异性结合物,然后彼此缀合。当特异性结合物是蛋白质或肽时,可以使用多种偶联或交联剂用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代乙酸(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺酸琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-l-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如,Karpovsky等人,1984J.Exp.Med.160:1686;Liu,MA等人,1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:8648)。其他方法包括Paulus,1985BehringIns.Mitt.No.78,118-132;Brennan等人,1985Science229:81-83)和Glennie等人,1987J.Immunol.139:2367-2375)中描述的那些。缀合剂是SATA和磺基-SMCC,都获得自PierceChemicalCo.(Rockford,IL)。当特异性结合物是抗体时,可以通过两条重链的C端铰链区的巯基键使它们缀合。在特别的实施方案中,修饰铰链区,使其在缀合前含有奇数个巯基残基,例如1个。备选地,可以在相同载体中编码两种特异性结合物,并在相同宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAbxmAb、mAbxFab、FabxF(ab')2或配体xFab融合蛋白时,该方法是特别有效的。本发明的双特异性分子可以是包含一条单链抗体和结合决定簇的单链分子,或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述在例如美国专利号5,260,203;美国专利号5,455,030;美国专利号4,881,175;美国专利号5,132,405;美国专利号5,091,513;美国专利号5,476,786;美国专利号5,013,653;美国专利号5,258,498;和美国专利号5,482,858中。可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制),或Western印迹测定,验证双特异性分子与其特异性靶的结合。每种此类测定一般通过应用目标复合物特异性的经标记的试剂(例如,抗体),检测特别感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。多价抗体在另一方面,本发明提供了这样的多价抗体,所述多价抗体包含结合CD40的本发明抗体的至少两个相同或不同的抗原结合部分,例如,选自mAb1-mAb3中任一种的抗原结合部分。在一个实施方案中,多价抗体提供了至少2、3或4个抗体的抗原结合部分。抗原结合部分可以通过蛋白质融合,或共价或非共价键连接在一起。备选地,已描述了用于双特异性分子的连接方法。可以通过例如交联本发明的抗体与结合本发明抗体的恒定区(例如Fc或铰链区)的抗体,获得四价化合物。使用本发明的拮抗剂抗CD40抗体的疗法方法本发明的方法涉及使用本发明的抗CD40抗体或蛋白质来治疗患自身免疫病和\/或炎性疾病,或具有出现自身免疫病和\/或炎性疾病的素质(predisposition)的对象(即,患者),其中,疾病和\/或炎症是由表达CD40抗原的细胞上的CD40L介导的CD40信号传递介导的。用于检测细胞中的CD40表达的方法是本领域普遍已知的,包括但不限于PCR技术、免疫组化、流式细胞术、Western印迹、ELISA等。本发明的方法尤其可用于治疗其中涉及CD40L介导的CD40刺激的炎性和\/或自身免疫病。炎性疾病的特征是炎症和组织破坏,或其组合。“炎性疾病”包括任何炎性免疫介导的过程,其中免疫应答的起始事件或靶涉及非自身抗原,包括例如同种抗原、异种抗原、病毒抗原、细菌抗原、未知抗原或过敏原。此外,出于本发明的目的,术语“炎性疾病”包括“自身免疫病”。在本文中,术语“自身免疫”一般理解为涵盖涉及“自身抗原”的炎性免疫介导的的过程。在自身免疫病中,自身抗原触发宿主的免疫应答。本发明也包括治疗与组织移植排斥相关的炎症。“移植排斥”或“移植物排斥”指任何宿主发起的抗移植物免疫应答,包括但不限于HLA抗原、血型抗原等。本发明还可用于治疗移植物抗宿主病,如与骨髓移植相关的那些疾病。在此类移植物抗宿主病中,供体骨髓包括淋巴细胞和成熟为淋巴细胞的细胞。供体的淋巴细胞将受体的抗原识别为非自身的并发起炎性免疫应答。因此,在本文中,“移植物抗宿主病”或“移植物抗宿主反应”指任何T细胞介导免疫应答,其中供体淋巴细胞对宿主抗原反应。可以根据本发明的方法,使用本文描述的拮抗剂抗CD40抗体或蛋白质,例如mAb1、mAb2或mAb3,以治疗自身免疫病和\/或炎性病症,包括但不限于系统性红斑狼疮(SLE)、盘状狼疮、狼疮性肾炎、结节病、炎性关节炎,包括幼年型关节炎、类风湿关节炎、银屑病关节炎、莱特尔氏综合症、强直性脊柱炎和痛风性关节炎、器官或组织移植排斥、超急性、急性或慢性排斥和\/或移植物抗宿主病、多发性硬化、高IgE综合症、结节性多动脉炎、原发性胆汁性肝硬化、炎性肠病、克氏病、乳糜泻(麸质敏感性肠病)、原发性综合症(pSS)、自身免疫性肝炎、恶性贫血、自身免疫性溶血性贫血、银屑病、硬皮病、重症肌无力、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性甲状腺炎、格雷夫症、Hasimoto甲状腺炎、免疫复合物病、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、多肌炎和皮肌炎、冷球蛋白血症、血栓溶解、心肌病、寻常型天疱疮、肺间质纤维化、I型和II型糖尿病、1、2、3和4型延迟型过敏、过敏或过敏性病症、对治疗性蛋白质的不想要\/非预期的免疫应答(参见例如,美国专利申请号US2002\/0119151和Koren,等人(2002)Curr.Pharm.Biotechnol.3:349-60)、哮喘、Churg-Strauss综合症(过敏性肉芽肿病)、异位性皮炎、过敏性和刺激性接触皮炎、荨麻疹、IgE介导的过敏、动脉粥样硬化、ANCA相关性血管炎病、脉管炎、特发性炎性肌病、溶血性疾病、阿尔兹海默病、慢性炎性脱髓鞘性多神经病等。之前已经在SLE、pSS、ITP、MS、克氏病、寻常型天疱疮、自身免疫脉管炎和RA的临床或临床前模型中(LawCL,GrewalIS.(2009).Adv.Exp.Med.Biol.2009;647:8-36)表明了CD40-CD154途径的基因消除或病理学抑制的治疗益处;其医学需求详述如下。在优选的实施方案中,本发明的抗CD40抗体或蛋白质可用于治疗:(i)系统性红斑狼疮(狼疮性肾炎),优选提供用于诱导和维持缓解,和预防晚期肾病的有效的类固醇节制疗法;(ii)原发性综合症,优选预防唾液腺和泪腺(lacrimarygland)破坏,并且诱导和维持腺体外表现的缓解;(iii)自身免疫血小板减少性紫癜,优选治疗标准护理难治的患者;(iv)ANCA相关性血管炎,优选在皮质醇和类固醇节制治疗难治的患者中诱导和维持缓解;(v)寻常型天疱疮,优选在皮质醇和类固醇节制疗法难治的患者中诱导和维持缓解;(vi)多发性硬化,优选提供用于预防复发和残疾发展的更有效的治疗,并实现无病状态;和(vii)克氏病,优选提供用于维持缓解的更有效的疗法,和治疗抗TNF难治的患者。在其他一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或蛋白质可用于治疗肺部炎症,包括但不限于肺移植物排斥、哮喘、结节病、肺气肿、囊性纤维化,特发性肺部纤维化、慢性支气管炎、过敏性鼻炎和过敏性肺病,如由于骨髓和\/或肺移植或其他原因导致的超敏性肺炎、嗜酸细胞性肺炎、闭塞性细支气管炎、移植物动脉粥样硬化\/移植物静脉硬化,以及由胶原、血管,和自身免疫病如类风湿关节炎、硬皮病和红斑狼疮导致的肺部纤维化。“治疗”在本文中定义为向对象应用或施用根据本发明的抗CD40抗体或蛋白质,例如mAb1、mAb2或mAb3抗体,或向来自对象的分离的组织或细胞系应用或施用包含本发明的所述抗CD40抗体或蛋白质的药物组合物,其中对象具有自身免疫病和\/或炎性疾病、与自身免疫病和\/或炎性疾病相关的症状或发展出自身免疫病和\/或炎性疾病的素质,其中目的是治愈、治疗、减轻、缓解、改变、恢复、缓和、改良或影响自身免疫病和\/或炎性疾病、与自身免疫病和\/或炎性疾病相关的任何症状或发展出自身免疫病和\/或炎性疾病的素质。“治疗”还意指向对象应用或施用包含本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体)的药物组合物,或向来自对象的分离的组织或细胞系应用或施用包含本发明的所述抗CD40抗体或蛋白质的药物组合物,其中对象具有自身免疫病和\/或炎性疾病、与自身免疫病和\/或炎性疾病相关的症状或发展出自身免疫病和\/或炎性疾病的素质,其中目的是治愈、治疗、减轻、缓解、改变、恢复、缓和、改良或影响自身免疫病和\/或炎性疾病、与自身免疫病和\/或炎性疾病相关的任何症状或发展出自身免疫病和\/或炎性疾病的素质。“抗炎性活性”意指降低或预防炎症。使用根据本发明的至少一种抗CD40抗体或蛋白质的疗法导致对于治疗自身免疫病和\/或炎性疾病有益的生理学应答,其中疾病涉及表达CD40抗原的细胞。应认识到本发明的方法可用于预防细胞的表型改变,如增殖、活化等。根据本发明的方法,使用上文定义的至少一种本发明的抗CD40抗体或蛋白质以促进对于自身免疫病和\/或炎性疾病的治疗或预防而言正面的治疗应答。对于自身免疫病和\/或炎性疾病而言“正面的治疗应答”意指与这些抗体或蛋白质的抗炎性活性相关的疾病的改善,和\/或与疾病相关症状的改善。即,可以观察到抗增殖效应,预防表达CD40的细胞的进一步增殖,炎性应答的降低,包括但不限于炎性细胞因子、粘附分子、蛋白酶、免疫球蛋白(其中具有CD40的细胞是B细胞的情况)或其组合的降低的分泌等、增加的抗炎性蛋白质的生产、自体反应细胞数的降低、免疫耐受增加、抑制自体反应细胞存活和\/或由刺激表达CD40的细胞介导的一个或多个症状减少。此类正面的治疗应答不限于施药途径,并且可以包括向供体、供体组织(例如器官灌注)、宿主、其任意组合等施用。可以使用筛选技术评估临床应答,如核磁共振成像(MRI)扫描、X射线照相成像、计算断层(CT)扫描、流式细胞术或荧光激活的细胞分选仪(FACS)分析、组织学、大体病理学和血液化学,包括但不限于可以通过ELISA、RIA、层析等检测到的改变。除这些正面的治疗应答外,接受使用本发明的拮抗剂抗CD40抗体或蛋白质的疗法的对象可以体验到改善疾病相关症状的有益效应。“治疗有效剂量或量”或“有效量”意指施用时,本发明的抗CD40抗体或蛋白质的量导致对于具有自身免疫病和\/或炎性疾病的对象的治疗正面的治疗应答。在本发明的一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3)的治疗有效剂量是在从0.01mg\/kg至40mg\/kg、从3mg\/kg至20mg\/kg或从7mg\/kg至12mg\/kg的范围内。应认识到治疗方法可包括单次施用治疗有效剂量的或多次施用治疗有效剂量的本发明的拮抗剂抗CD40抗体或蛋白质。本发明的其他实施方案是本发明的抗CD40抗体或蛋白质用于作为临床测试程序的一部分诊断性监控组织中的蛋白质水平,例如以确定指定的治疗方案的功效的用途。可以通过偶联抗体与可检测的物质来协助检测。可检测的物质的实例包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、P-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶;合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素\/生物素和抗生物素蛋白\/生物素;合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸盐、若丹明、二氯三嗪氨基荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白;发光材料的实例包括鲁米诺;生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白;而合适的放射性材料的实例包括l25I、131I、35S或3H。本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3)可与任何已知的用于自身免疫和炎性疾病的疗法组合使用,所述疗法包括已知有用的、或已用于或正在用于,例如治疗自身免疫和炎性疾病的任何活性剂或活性剂的组合。此类疗法和治疗剂包括但不限于手术或手术程序(例如脾切除术、淋巴结切除术、甲状腺切除术、血浆去除术、白细胞去除术、细胞、组织或器官移植、肠程序、器官灌注等)、放射性疗法、疗法如类固醇疗法和非类固醇疗法、激素疗法、细胞因子疗法、使用皮肤剂的疗法(例如,用于治疗皮肤病况,如过敏症、接触性皮炎和银屑病的局部剂)、免疫抑制疗法和其他的抗炎性单克隆抗体疗法等。在该方式中,本文描述的拮抗剂抗CD40抗体或蛋白质与至少一种其他疗法组合施用,所述疗法包括但不限于手术、器官灌注、放射疗法、类固醇疗法、非类固醇疗法、抗生素疗法、抗真菌疗法、激素疗法、细胞因子疗法、使用皮肤剂的疗法(例如,用于治疗皮肤病况,如过敏症、接触性皮炎和银屑病的局部剂)、免疫抑制疗法和其他抗炎性单克隆抗体疗法,及其组合等。因此,当组合疗法包括组合施用本发明的抗CD40抗体或蛋白质(如mAb1、mAb2或mAb3抗体)与施用另一种治疗剂(以类固醇类作为一个实例)时,本发明的方法涵盖了使用单独的制剂或单种药物制剂的共同施用,和以任一顺序的连续施用。当本发明的方法包括组合的治疗方案时,这些疗法可以同时施用,即,同时或在与其他疗法相同的时间框架内(即,同时进行疗法,但本发明的抗CD40抗体或蛋白质不在与其他疗法精确相同的时间施用)施用本发明的抗CD40抗体或蛋白质。备选地,也可以在其他疗法之前或其后施用本发明的抗CD40抗体或本发明的蛋白质。不论受治疗的对象是否响应于第一疗程,可以实施不同疗法的顺序施用,以减少缓解或复发的可能性。在本发明的一些实施方案中,组合施用本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体)与免疫抑制药物或抗炎性药物,其中抗体或蛋白质和治疗剂可以以任何顺序相继施用,或同时施用(即,同步或在相同的时间框架内)。可以与本发明的拮抗性抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体)组合施用的、合适的免疫抑制药物的实例包括但不限于氨甲喋呤、环磷酰胺、咪唑立宾、苯丁酸氮芥、环孢霉素例如雾化环孢霉素(参见美国专利申请公开号US2002\/0006901)、他克莫司(tacrolimus)(FK506;ProGrafrM)、麦考酚酸吗乙酯(mycophenolatemofetil),和硫唑嘌呤(6-巯基嘌呤)、西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素)、脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)、来氟米特(leflunomide)及其malononitriloamide类似物;和免疫抑制性蛋白质,包括例如抗CTLA4抗体和Ig融合体、抗B淋巴细胞刺激剂抗体(例如,LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合体(BLyS-Ig),抗CD80抗体和依那西普(etanercept)(Enbrel(RTM)),以及抗T细胞抗体如抗CD3(OKT3)、抗CD4等。合适的抗炎性剂的实例包括但不限于皮质类固醇类,例如氯倍他索(clobetasol)、卤倍他索(halobetasol)、氢化可的松(hydrocortisone)、去炎松(triamcinolone)、倍他米松(betamethasone)、氟轻松(fluocinole)、氟轻松醋酸酯(fluocinonide)、泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone);非类固醇类抗炎性药物(NSAID)例如柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、含有美沙拉嗪(mesalamine)(称为5-ASA活性剂)的药物、塞来考昔(celecoxib)、双氯芬酸(diclofenac)、依托度酸(etodolac)、非诺洛芬(fenprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、meclofamate、美洛昔康(meloxicam)、萘普酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、奥沙普秦(oxaprozin)、吡罗昔康(piroxicam)、罗非考昔(rofecoxib)、水杨酸盐、舒林酸(sulindac)和托美汀(tolmetin);磷酸二酯酶-4抑制剂、抗炎性抗体如阿达木单抗(adalimumab)(HUMERA(RTM),一种TNF-α拮抗剂)和英夫利昔单抗(infliximab)(Remicade,一种TNF-α拮抗剂)等。还包括具有目前或潜在用途的治疗自身免疫病的免疫调节剂,如沙利度胺(thalidomide)或其类似物,如来那度胺(lenalidomide)。移植排斥和移植物抗宿主病可以是超急性(体液)、急性(T细胞介导的)或慢性(未知病因学)的,或其组合。因此,在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体)用于预防和\/或减轻排斥和\/或与任何组织的超急性、急性和\/或慢性移植排斥相关的症状,所述组织包括但不限于肝、肾、胰腺、胰岛细胞、小肠、肺、心、角膜、皮肤、血管、骨骼、异源或自体骨髓等。可以从任何供体获得移植物组织,并移植到任何受体宿主中,并且因此移植程序可包括将动物组织移植给人(例如异种移植物)、将一个人的组织移植给另一个人(例如同种异体移植物),和\/或将人体的一部分组织移植给另一部分(例如自体移植物)。使用本发明的抗体或蛋白质的治疗还可以降低移植后遗症,如发烧、厌食症、血液动力学异常、白细胞减少症、白细胞浸润移植的器官\/组织,以及感染机会。在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体)可以单独使用,或与免疫抑制药物组合使用,以治疗和\/或预防移植排斥,如超急性、急性和\/或慢性排斥和\/或移植物抗宿主病。因此,在一些实施方案中,当本发明的抗CD40抗体或蛋白质用于治疗移植物排斥时,抗体(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体)可以与合适的免疫抑制性药物组合使用,所述药物包括但不限于氨甲喋呤;环磷酰胺;咪唑立宾;苯丁酸氮芥;环孢霉素例如雾化环孢霉素(参见美国专利申请公开号US20020006901)、他克莫司(FK506;ProGrafm)、麦考酚酸吗乙酯和硫唑嘌呤(6-巯基嘌呤)、西罗莫司(雷帕霉素)、脱氧精胍菌素、来氟米特及其malononitriloamide类似物;免疫调节剂,包括例如沙利度胺及其类似物;免疫抑制蛋白质,包括例如抗CTLA抗体和Ig融合体、抗B淋巴细胞刺激剂抗体(例如LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合体(BLyS-Ig)、抗CD80抗体和依那西普(Enbrel(RTM)),以及抗T细胞抗体如抗CD3(OKT3)、抗CD4等。因此,具体考虑本发明的组合物和方法与其他药物组合使用,以进一步改善移植受体(如接受肺或肾移植物的受体)的症状和结果。因此,在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体)用于单独治疗或与不经肠道和\/或经肠道施用的环孢霉素(包括例如口服环孢霉素、注射环孢霉素、雾化(例如吸入的)环孢霉素,及其组合)组合治疗移植排斥(例如肺或肾移植受体中的超急性、急性和\/或慢性排斥或移植物抗宿主病)。在一些实施方案中,当疗法的至少一种组分是雾化环孢霉素时,通过使用例如加压的递送装置或雾化器吸入处于气雾喷雾形式的环孢霉素,将环孢霉素递送至受体的肺。环孢霉素可以以干粉或潮湿形式施用。环孢霉素可以作为亚治疗剂量施用。在其他一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体)可以单独使用,或与免疫抑制性药物组合使用,以治疗和\/或预防类风湿关节炎。因此,在一些实施方案中,当本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体)用于治疗类风湿关节炎时,所述抗体或蛋白质可以与合适的免疫抑制药物组合使用,所述药物包括但不限于氨甲喋呤、环磷酰胺、咪唑立宾、苯丁酸氮芥、环孢霉素、他克莫司(FK506;PROGRAFTM)、麦考酚酸吗乙酯和硫唑嘌呤(6-巯基嘌呤)、西罗莫司(雷帕霉素)、脱氧精胍菌素、来氟米特及其malononitriloamide类似物;免疫抑制蛋性白质,包括例如抗CTLA抗体和Ig融合体、抗B淋巴细胞刺激剂抗体(例如LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合体(BLyS-Ig)、抗CD20抗体(例如RITUXAN(g));完全人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗(tositumomab)\/1-131、托西莫单抗(Bexxar(D),ibritumomabtituxetan(Zcvalin(RTM));抗CD80抗体,和依那西普(ENBREL),以及抗T细胞抗体如抗CD3(OKT3)、抗CD4等。如上所述,可以使用任何工具评估治疗效果,包括但不限于通过美国风湿病学会标准、欧洲风湿病联盟标准或任何其他标准所定义的临床应答所测量的效果。参见例如,Felson等人(1995)Arthritis.Rheum.38:727-35和vanGestel等人(1996)ArthritisRheum.39:34-40。在其他实施方案中,本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体)可以单独使用,或与免疫抑制药物组合使用,以治疗和\/或预防多发性硬化。因此,在一些实施方案中,当本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体)用于治疗多发性硬化时,抗体可以与合适的免疫抑制性药物组合使用,所述药物包括但不限于氨甲喋呤、环磷酰胺、咪唑立宾、苯丁酸氮芥、环孢霉素、他克莫司(FK506;PROGRAFTM)、麦考酚酸吗乙酯和硫唑嘌呤(6-巯基嘌呤)、西罗莫司(雷帕霉素)、脱氧精胍菌素、来氟米特及其malononitriloamide类似物;免疫抑制性蛋白质,包括例如抗CTLA抗体和Ig融合体、抗B淋巴细胞刺激剂抗体(例如LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合体(BLyS-Ig)、抗CD20抗体(例如,RITUXAN(D);完全人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗\/1-131、托西莫单抗(Bexxar(RTM)),ibritumomabtituxetan(Zevalin(RTM));抗CD80抗体和依那西普(ENBREL),以及抗T细胞抗体如抗CD3(OKT3)、抗CD4、参与S1P受体调节的活性剂,包括例如芬戈莫德(fingolimod);等。药物制剂和施用方式本发明的抗CD40抗体或蛋白质施用的浓度是这样的浓度,所述浓度在治疗上有效预防或治疗自身免疫病和\/或炎性疾病,和\/或预防或降低与移植中的移植物排斥相关的风险。为了实现这一目标,可以使用本领域已知的多种可用的赋形剂配制抗体。通常,抗体或蛋白质是注射施用的,例如静脉内、腹膜内或皮下。实现该施用的方法是本领域普遍技术人员已知的。还能够获得可以局部或口服施用的组合物,或能够跨粘膜传递的组合物。取决于所施用的抗CD40抗体或蛋白质,优选通过输注约1至约10小时,更优选约1小时至约8小时,甚至更优选约2小时至约7小时,仍然更优选约4小时至约6小时的时间进行静脉内施药。药物组合物的初始输注可以进行约4至约6小时的时间,之后更快地递送输注液。随后的输注液可以在约1至约6小时的时间,包括例如约1至约4小时、约1至约3小时或约1至约2小时施用。将本发明的药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。可能的施用途径的实例包括不经肠道的(例如静脉内(IV)、肌肉内(IM)、皮内、皮下(SC)或输注)、口服和肺部(例如吸入)、经鼻、透皮(局部)、透粘膜和直肠施用。用于不经肠道的、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括下列组分:无菌稀释剂,如注射用水、生理盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂;抗菌剂,如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂,如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂如乙二胺四乙酸;缓冲剂,如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐;和用于调节渗涨度的活性剂,如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱调节pH,如盐酸或氢氧化钠。不经肠道的制品可以封入安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多次剂量小瓶中。通常通过标准技术在可药用的缓冲剂中提供本发明的抗CD40抗体或蛋白质,所述缓冲剂例如无菌生理盐水,无菌缓冲水、丙二醇、上述的组合等。用于制备不经肠道施用的活性剂的方法描述在Remington'sPharmaceuticalSciences(第18版;MackPublishingCompany,Eaton,Pennsylvania,1990)中。还参见例如WO98\/56418,其描述了适用于本发明方法中的稳定的抗体药物制剂。本领域的普通技术人员可以方便地确定待施用的至少一种本发明的拮抗剂抗CD40抗体或蛋白质的量。影响施用方式和至少一种抗CD40抗体或蛋白质拮抗剂的各自的量的因子包括但不限于接受疗法的特别的疾病、疾病的严重程度、疾病史、接受疗法的个体的年龄、身高、体重、健康和生理条件。相似地,待施用的抗CD40抗体或蛋白质拮抗剂的量将取决于施用方式,和对象是否接受该活性剂的单次剂量或多次剂量。一般而言,随着接受疗法的患者体重增加,更高的抗CD40抗体或蛋白质剂量是优选的。待施用的抗CD40抗体或蛋白质的剂量在从约0.003mg\/kg至约50mg\/kg的范围内,优选在0.01mg\/kg至约40mg\/kg的范围内。因此,例如,剂量可以是0.01mg\/kg、0.03mg\/kg、0.1mg\/kg、0.3mg\/kg、0.5mg\/kg、1mg\/kg、1.5mg\/kg、2mg\/kg、2.5mg\/kg、3mg\/kg、5mg\/kg、7mg\/kg、10mg\/kg、15mg\/kg、20mg\/kg、25mg\/kg、30mg\/kg、35mg\/kg、40mg\/kg、45mg\/kg或50mg\/kg。在本发明的另一个实施方案中,方法包括施用多次剂量的拮抗剂抗CD40抗体或其片段。方法可包括施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多次治疗有效剂量的药物组合物,所述组合物包含拮抗剂抗CD40抗体或其片段。本领域技术人员可以方便地确定多次剂量的包含抗CD40抗体或蛋白质的药物组合物的施用频率和持续期。此外,用治疗有效量的抗体或蛋白质治疗对象可以包括单次治疗,或者优选地可以包括一系列的治疗。在优选的实例中,用本发明的拮抗剂抗CD40抗体或蛋白质治疗对象,所述拮抗剂处于约0.1至20mg\/kg体重之间,每周1次,约1至10周之间,优选约2至8周之间,更优选约3至7周之间,并且甚至更优选约4、5或6周的范围内。可以每年进行治疗,以预防复发,或在表现出复发时进行治疗。还可以理解,用于治疗的抗体或其抗原结合片段的有效剂量可以随特别的疗程增加或减少。剂量的改变可以是本文所述诊断测定的结果所导致的并且从所述结果显而易见。因此,在一个实施方案中,给药方案包括在治疗期的第1、7、14和21天第一次施用治疗有效剂量的至少一种本发明的抗CD40抗体或蛋白质。在另一个实施方案中,给药方案包括在治疗期的周中的第1、2、3、4、5、6和7天第一次施用治疗有效剂量的至少一种本发明的抗CD40抗体或蛋白质。其他实施方案包括在治疗期的周中的第1、3、5和7天第一次施用治疗有效剂量的至少一种本发明的抗CD40抗体或蛋白质的给药方案;包括在治疗期的周中的第1和3天第一次施用治疗有效剂量的至少一种本发明的抗CD40抗体或蛋白质的给药方案;和包括在治疗期的周中的第1天第一次施用治疗有效剂量的至少一种本发明的抗CD40抗体或蛋白质的优选的给药方案。治疗期可以包括1周、2周、3周、1个月、3个月、6个月或1年。治疗期可以是相继的,或彼此分开1天、1周、2周、1个月、3个月、6个月或1年。范围从0.003mg\/kg至50mg\/kg,从0.01mg\/kg至40mg\/kg,从0.01mg\/kg至30mg\/kg,从0.1mg\/kg至30mg\/kg,从0.5mg\/kg至30mg\/kg,从1mg\/kg至30mg\/kg,从3mg\/kg至30mg\/kg,从3mg\/kg至25mg\/kg,从3mg\/kg至20mg\/kg,从5mg\/kg至15mg\/kg或from7mg\/kg至12mg\/kg。因此,例如,任一种拮抗剂抗CD40抗体或其抗原结合片段(例如本发明的抗CD40单克隆抗体或蛋白质)的剂量,可以是0.003mg\/kg、0.01mg\/kg、0.03mg\/kg、0.1mg\/kg、0.3mg\/kg、0.5mg\/kg、1mg\/kg、1.5mg\/kg、2mg\/kg、2.5mg\/kg、3mg\/kg、5mg\/kg、7mg\/kg、10mg\/kg、15mg\/kg、20mg\/kg、25mg\/kg、30mg\/kg、35mg\/kg、40mg\/kg、45mg\/kg、50mg\/kg或落入0.003mg\/kg至50mg\/kg范围内的其他此类剂量。可以贯穿抗体给药的每一周中,施用相同治疗有效剂量的本发明的抗CD40抗体或蛋白质。备选地,可以在治疗期的过程中,使用不同治疗有效剂量的本发明的拮抗剂抗CD40抗体或蛋白质在一些实施方案中,本文别处定义的拮抗剂抗CD40抗体或其抗原结合片段的初始治疗有效剂量可以处于较低的剂量范围(即,0.003mg\/kg至20mg\/kg),随后剂量可落入较高的剂量范围(即,从20mg\/kg至50mg\/kg)。在备选的实施方案中,本文别处定义的拮抗剂抗CD40抗体或其抗原结合片段的初始治疗有效剂量可以处于较高的剂量范围(即,20mg\/kg至50mg\/kg),随后剂量可落入较低的剂量范围(即,0.003mg\/kg至20mg\/kg)。因此,在一个实施方案中,拮抗剂抗CD40抗体或其抗原结合片段的初始治疗有效剂量是20mg\/kg至35mg\/kg,包括约20mg\/kg、约25mg\/kg、约30mg\/kg和约35mg\/kg,并且本发明的拮抗剂抗CD40抗体或蛋白质的随后治疗有效剂量是约5mg\/kg至约15mg\/kg,包括约5mg\/kg、8mg\/kg、10mg\/kg、12mg\/kg和约15mg\/kg。在本发明的一些实施方案中,抗CD40疗法是由向需要抗CD40疗法的对象施用“负荷剂量”的本发明的抗体或蛋白质开始的。“负荷剂量”意指向对象施用的本发明的抗CD40抗体或蛋白质的初始剂量,其中施用的本发明的抗体或蛋白质的剂量落入较高的剂量范围(即,从约20mg\/kg至约50mg\/kg)。“负荷剂量”可以作为单次施用来施用,例如单次输注,其中IV施用抗体或其抗原结合片段;或作为多次施用来施用,例如多次灌注,其中IV施用抗体或其抗原结合片段,只要完整的“负荷剂量”是在约24小时时间段内施用的。在施用“负荷剂量”后,再向对象施用本发明的抗CD40抗体或蛋白质的一次或多次额外的治疗有效剂量。可以根据每周给药规划或每2周1次、每3周1次或每4周1次,施用随后的治疗有效剂量。在此类实施方案中,随后的治疗有效剂量一般落入较低的给药范围内(即,0.003mg\/kg至20mg\/kg)。备选地,在一些实施方案中,在“负荷剂量”后,根据“维持计划”施用本发明的抗CD40抗体或蛋白质的随后的治疗有效剂量,其中,每月1次、每6周1次、每2个月1次、每10周1次、每3个月1次、每14周1次、每4个月1次、每18周1次、每5个月1次、每22周1次、每6个月1次、每7个月1次、每8个月1次、每9个月1次、每10个月1次、每11个月1次或每12个月1次施用本发明的抗体或蛋白质的治疗有效剂量。在此类实施方案中,本发明的抗CD40抗体或蛋白质的治疗有效剂量落入较低的给药范围内(即,0.003mg\/kg至约20mg\/kg),特别是当随后的剂量以更频繁的间隔施用时,例如每2周1次至每月1次,或落入较高的给药范围内(即,从20mg\/kg至50mg\/kg),特别是当随后的剂量以更不频繁的间隔施用时,例如当隔1个月至12个月施用随后的剂量时。包含具有本文所述理想的功能性质的本发明的抗CD40抗体或蛋白质作为治疗活性组分的任何药物组合物可用于本发明的方法中。因此,可以将包含一种或多种本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体)的液体、冻干的或喷雾干燥的组合物制备为水性或非水性溶液或悬浮液,用于根据本发明的方法向对象随后施用。这些组合物每种将包含作为治疗或预防的活性组分的本发明的至少一种抗CD40抗体或蛋白质。“治疗或预防的活性组分”意指将本发明的抗CD40抗体或蛋白质特异性地掺入到组合物中,为了当向对象施用药物组合物时,对于对象中的疾病或病况的治疗、预防或诊断,产生理想的治疗或预防应答。优选地药物组合物包含恰当的稳定剂、填充剂或两者,为了使制备和储藏过程中与失去蛋白质稳定性和生物学活性相关的问题最小化。可以向包含本发明的抗CD40抗体或蛋白质的药物组合物中添加助剂(formulant)。这些助剂可以包括但不限于油、聚合物、维生素、碳水化合物、氨基酸、盐、缓冲剂、白蛋白、表面活性剂或填充剂。优选地碳水化合物包括糖或糖醇类,如单糖、二糖或多糖,或水溶性葡聚糖。糖或聚糖可以包括果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、出芽短梗孢糖、糊精、α和β环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素,或其混合物。“糖醇”定义为具有羟基的C4至C8碳氢化合物,包括半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘油和阿拉伯糖醇。这些糖或糖醇可以单独使用或组合使用。糖或糖醇的浓度可以在1.0%至7%w\/v之间,更优选2.0%至6.0%w\/v之间。例如,氨基酸包括肉毒碱、精氨酸和甜菜碱的左旋(L)形式;然而,可以添加其他氨基酸。优选的聚合物包括平均分子量在2000至3000之间的聚乙烯吡咯烷酮(PVP),或平均分子量在3000至5000之间的聚乙二醇(PEG)。可以添加到制剂中的表面活性剂显示在EPNo.270,799和268,110中。额外地,可以通过与聚合物共价缀合化学修饰抗体,例如以增加其循环半寿期。优选的聚合物和将它们附着至肽的方法显示在美国专利号4,766,106;4,179,337;4,495,285和4,609,546中。优选的聚合物是聚氧乙基化的多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下是水溶性的,具有通式:R(O--CH2--CH2)nO—R,其中R可以是氢或保护基,如烷基或烷醇基。优选地,保护基具有1至8个碳原子,更优选地其是甲基。符号n是正整数,优选在1和1,000之间,更优选在2和500之间。PEG具有优选的1,000和40,000之间,更优选2,000和20,000之间,最优选3,000和12,000之间的平均分子量。优选地,PEG具有至少1个羟基,更优选其是末端羟基。此羟基基团是优选地被激活以与抑制剂上的游离氨基基团反应的羟基基团。然而,可以理解,可以改变反应基的类型和量以获得本发明的共价缀合的PEG\/抗体。水溶性聚氧乙基化的多元醇也可用于本发明中。其包括聚氧乙基化的山梨糖醇、聚氧乙基化的葡萄糖、聚氧乙基化的甘油(POG)等。POG是优选的。一个原因是由于聚氧乙基化的甘油的甘油骨架是与例如动物和人中天然存在的甘油一酯、二酯、三酯相同的骨架。因此,该分支在体内并非必然被视为外源活性剂。POG优选具有与PEG相同范围的分子量。POG的结构显示在Knauf等人(1988,J.Bio.Chem.263:15064-15070)中,并且美国专利号4,766,106中可见关于POG\/IL-2缀合物的讨论。另一种用于增加循环半寿期的药物递送系统是脂质体。在Gabizon等人(1982)CancerResearch42:4734;Cafiso(1981)BiochemBiophysActa649:129;和Szoka(1980)Ann.Rev.Bioplays.Eng.9:467中讨论了制备脂质体递送系统的方法。其他药物递送系统是本领域已知的并描述在例如Poznansky等人(1980)DrugDeliverySystems(R.L.Juliano编著,Oxford,N.Y.)第253-315页;Poznansky(1984)PharmRevs36:277中。待掺入到药物组合物中的助剂应该为本发明的拮抗剂抗CD40抗体或蛋白质提供稳定性。即,本发明的抗CD40抗体或蛋白质应该保持其物理的和\/或化学的稳定性,并具有理想的功能性质,即,一种或多种上文定义的理想的功能性质。用于监控蛋白质稳定性的方法是本领域普遍已知的。参见,例如,Jones(1993)Adv.DrugDeliveryRev.10:29-90;Lee编著(1991)PeptideandProteinDrugDelivery(MarcelDekker,Inc.,NewYork,NewYork);和下文公开的稳定性测定。一般而言,在选定的温度下测量蛋白质稳定性一段规定的时间。在优选的实施方案中,稳定的抗体药物制剂为在室温(约25℃)下储藏本发明的拮抗剂抗CD40抗体或蛋白质至少1个月、至少3个月或至少6个月时提供了稳定性,和\/或所述稳定的抗体药物制剂在约2-8C稳定至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月。当在药物组合物中配制蛋白质(如抗体)时,如果该药物组合物中没有表现出沉淀、凝聚和\/或变性的可见的信号(即,褪色或不清澈)或可测量的信号(例如,使用大小排阻层析(SEC)或UV光散射),则认为蛋白质(如抗体)在给定的时间点保持了其物理学稳定性。对于化学稳定性,当在药物组合物中配制蛋白质(如抗体)时,如果该药物组合物中的化学稳定性的测量值指示蛋白质(即,抗体)保留了目标的生物学活性,则认为蛋白质(如抗体)在给定的时间点保持了其化学稳定性。用于监控化学稳定性改变的方法是本领域普遍已知的,包括但不限于检测由如剪切导致的蛋白质化学变形的方法,例如使用SDS-PAGE、SEC和\/或基质辅助激光解吸电离\/飞行时间质谱;和与分子电荷改变相关的降解(例如,与脱酰胺相关),例如使用离子交换层析。参见例如下文公开的方法。当在药物组合物中配制本发明的抗CD40抗体或蛋白质时,认为本发明的抗CD40抗体或蛋白质在给定的时间点保留了理想的生物学活性,如果如在理想的生物学活性的适当的测定中所确定的,在该时间的理想的生物学活性是在制备药物组合物时所表现出的理想的生物学活性的约30%内,优选地约20%内。用于测量本文公开的拮抗剂抗CD40抗体或蛋白质的理想的生物学活性的测定可以按本文实施例中所述来实施。还参见Schutze等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:8200-8204;Denton等人(1998)PediatrTransplant.2:6-15;Evans等人(2000)J:Immunol.164:688-697;Noelle(1998)AgentsActionsSuppl.49:17-22;Lederman等人(1996)CurrOpin.Hematol.3:77-86;Coligan等人(1991)CurrentProtocolsinImmunology13:12;Kwekkeboom等人(1993)Immunology79:439-444;和美国专利号5,674,492和5,847,082中描述的测定。在本发明的一些实施方案中,在液体药物制剂中配制抗CD40抗体(例如选自mAb1-mAb3重组抗体的抗CD40抗体)。可以使用本领域已知的任何方法,包括上文公开的方法,制备本发明的抗CD40抗体或蛋白质。在一个实施方案中,在CHO细胞系中重组生产抗CD40抗体(例如选自mAb1-mAb3抗体的抗CD40抗体)。在制备和纯化后,可以以本文所述的方式,将抗CD40抗体配制为液体药物制剂。当在配制前储藏拮抗剂抗CD40抗体时,可以将其冷冻在例如-20℃,然后在室温解冻用于进一步配制。液体药物制剂包括治疗有效量的本发明的抗CD40抗体或蛋白质,例如mAb1、mAb2或mAb3抗体。制剂中存在的抗体量考虑了施用途径和理想的剂量体积。以该方式,液体药物组合物包含浓度为0.1mg\/ml至300.0mg\/ml、1.0mg\/ml至200mg\/ml、5.0mg\/ml至100.0mg\/ml、7.5mg\/ml至50mg\/ml或15.0mg\/ml至25.0mg\/ml的抗CD40抗体,例如mAb1、mAb2或mAb3抗体。液体药物组合物包含抗CD40抗体,例如mAb1、mAb2或mAb3抗体,和维持制剂的pH在pH5.0至pH7.0范围内的缓冲剂。制剂中可以使用维持液体抗CD40抗体制剂的pH在约pH5.0至约pH7.0范围内的任何合适缓冲剂,只要保留上述抗体的物理化学稳定性和理想的生物学活性。合适的缓冲剂包括但不限于常规的酸及其盐,其中抗衡离子可以是例如钠、钾、铵、钙或镁。可用于缓冲药物液体制剂的常规的酸及其盐的实例包括但不限于琥珀酸或琥珀酸盐、组氨酸或组氨酸盐酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐、醋酸或醋酸盐、酒石酸或酒石酸盐、磷酸或磷酸盐、葡萄糖酸或葡萄糖酸盐、谷氨酸或谷氨酸盐、天冬氨酸或天冬氨酸盐、苹果酸或苹果酸盐,和马来酸或马来酸盐缓冲剂。制剂中的缓冲剂浓度可以是从1mM至50mM,包括约1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM,或在1mM至50mM范围内的其他此类值。在本发明的一些实施方案中,液体药物制剂包含治疗有效量的抗CD40抗体(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体),和处于保持制剂的pH在约pH5.0至pH7.0的范围内的浓度的琥珀酸盐缓冲剂、或柠檬酸盐缓冲剂、或组氨酸缓冲剂、或组氨酸盐酸盐缓冲剂。“琥珀酸盐缓冲剂”或“柠檬酸盐缓冲剂”意指分别包含琥珀酸的盐或柠檬酸的盐的缓冲剂。“组氨酸缓冲剂”意指包含氨基酸组氨酸的盐的缓冲剂。在优选的实施方案中,缓冲剂是组氨酸缓冲剂,例如组氨酸盐酸盐。如上所述,制剂中的组氨酸缓冲剂浓度可以是从1mM至50mM,包括约1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM,或在1mM至50mM范围内的其他此类值。在优选的实施方案中,琥珀酸盐或柠檬酸盐的抗衡离子是钠阳离子,因此缓冲剂分别是琥珀酸钠或柠檬酸钠。然而,预期任何阳离子都是有效的。其他可能的琥珀酸盐或柠檬酸盐阳离子包括但不限于钾、铵、钙和镁。如上所述,制剂中的琥珀酸盐或柠檬酸盐缓冲剂浓度可以是从1mM至50mM,包括约1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM,或在1mM至50mM范围内的其他此类值。在其他实施方案中,液体药物制剂包含浓度为0.1mg\/ml至300.0mg\/ml、或1.0mg\/ml至200mg\/ml、5.0mg\/ml至100.0mg\/ml、7.5mg\/ml至50mg\/ml、或15.0mg\/ml至25.0mg\/ml的拮抗剂抗CD40抗体,例如mAb1、mAb2或mAb3抗体,和组氨酸或琥珀酸盐或柠檬酸盐缓冲剂,例如琥珀酸钠或柠檬酸钠缓冲剂或组氨酸盐酸盐,浓度为1mM至50mM、5mM至40mM、10mM至35mM,优选约30mM。当液体药物制剂理想地接近等渗时,包含治疗有效量的本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体)和维持制剂的pH在约pH5.0至约pH7.0范围内的缓冲剂的液体药物制剂还可以包含足以使制剂接近等渗的一定量的等渗剂。“接近等渗”意指水性制剂具有240mmol\/kg至800mmol\/kg,优选约240至约600mmol\/kg,更优选约240至约440mmol\/kg,更优选约250至约330mmol\/kg,甚至更优选约260至约320mmol\/kg,仍然更优选约270至约310mmol\/kg的渗透压。用于确定溶液等渗性的方法是本领域技术人员已知的。参见例如,Setnikar等人(1959)J.Am.Pharm.Assoc.48:628。本领域技术人员熟知可用于提供药物组合物的渗透压的多种可药用的溶质。等渗剂可以是能够将本发明的液体药物制剂的渗透压调节至几乎等于体液的渗透压的数值的任何试剂。理想地使用生理学可接受的等渗剂。因此,包含治疗有效量的拮抗剂抗CD40抗体(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体)和维持制剂的pH在约pH5.0至约pH7.0范围内的缓冲剂的液体药物制剂,还可以包括用于提供等渗性的组分,例如氯化钠;氨基酸如丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸;糖和糖醇类(多元醇),包括但不限于葡萄糖、右旋糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、海藻糖、甘油、山梨糖醇和木糖醇;醋酸、其他有机酸或其盐,和相对少量的柠檬酸盐或磷酸盐。普通技术人员可了解适于提供液体制剂最佳渗透性的其他活性剂。在一些优选的实施方案中,包含治疗有效量的抗CD40抗体(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体)和维持制剂的pH在约pH5.0至约pH7.0范围内的缓冲剂的液体药物制剂还包含氯化钠作为等渗剂。制剂中的氯化钠浓度取决于其他组分对渗透性的贡献。在一些实施方案中,氯化钠的浓度是50mM至300mM。在一个此类实施方案中,氯化钠的浓度是约150mM。在其他此类实施方案中,氯化钠的浓度是约150mM,缓冲剂是浓度为5mM至15mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠缓冲剂,液体药物制剂包含治疗有效量的本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体),并且制剂具有5.0至pH7.0的pH。在其他实施方案中,液体药物制剂包含浓度为0.1mg\/ml至50.0mg\/ml、或5.0mg\/ml至25.0mg\/ml的本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体),约150mM氯化钠,和约10mM、20mM、30mM、40mM或50mM琥珀酸钠或柠檬酸钠,pH为约pH5.5。可以通过在制剂中掺入表面活性剂降低溶液-空气界面的表面张力,以抑制由于加工本发明的液体药物制剂过程中的冻融或机械剪切造成的蛋白质降解。因此,在一些实施方案中,液体药物制剂包含治疗有效量的本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体),维持制剂的pH在约pH5.0至约pH7.0范围内的缓冲剂,并且还包含表面活性剂。在其他实施方案中,液体药物制剂包含治疗有效量的本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体),维持制剂的pH在约pH5.0至约pH7.0范围内的缓冲剂,浓度为约50mM至约300mM的等渗剂(如氯化钠),并且还包含表面活性剂。所使用的典型的表面活性剂是非离子型表面活性剂,包括聚氧乙烯山梨醇酯,如聚山梨醇酯80(Tween80)和聚山梨醇酯20(Tween20);聚氧丙烯-聚氧乙烯酯,如PluronicF68;聚氧乙烯醇,如Brij35;二甲基硅油(simethicone);聚乙二醇如PEG400;溶血磷脂酰胆碱;和聚氧乙烯-p-t-辛基苯酚,如TritonX-100。表面活性剂或乳化剂对药剂的经典稳定化作用描述在例如Levine等人(1991)J.ParenteralSci.Technol.45(3):160-165中,其通过引用整合到本文中。用于实践本发明的优选的表面活性剂是聚山梨醇酯80。当包括表面活性剂时,其通常以从0.001%至1.0%(w\/v)的量添加。因此,在一些实施方案中,液体药物制剂包含治疗有效量的本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体),缓冲剂是浓度为1mM至50mM,3mM至40mM,或5mM至35mM;或7.5mM至30mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠或组氨酸缓冲剂或组氨酸盐酸盐缓冲剂;制剂具有pH5.0至pH7.0的pH;制剂还包含表面活性剂,例如聚山梨醇酯80,量为从0.001%至1.0%、或0.001%至0.5%。此类制剂可以任选地包含等渗剂,例如浓度为50mM至300mM、50mM至200mM或50mM至150mM的氯化钠。在其他实施方案中,液体药物制剂包含浓度为0.1mg\/ml至200.0mg\/ml、或1mg\/ml至100.0mg\/ml、或2mg\/ml至50.0mg\/ml、或5.0mg\/ml至25.0mg\/ml,包括约20.0mg\/ml的本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1、mAb2或mAb3抗体);50mM至200mM氯化钠,包括约150mM氯化钠;5mM至20mM琥珀酸钠或柠檬酸钠,包括约10mM琥珀酸钠或柠檬酸钠;浓度为50mM至200mM,包括约150mM的氯化钠;5mM至50mM组氨酸或组氨酸盐酸盐,包括约30mM组氨酸或组氨酸盐酸盐;和任选地表面活性剂,例如聚山梨醇酯80,量为0.001%至1.0%,包括0.001%至0.5%;其中液体药物制剂具有约pH5.0至约pH7.0的pH。液体药物制剂可以基本不含任何上文所述的防腐剂和其他载剂、赋形剂或稳定剂。备选地,制剂可以包括一种或多种防腐剂,例如上文所述的抗菌剂、可药用的载剂、赋形剂或稳定剂,前提是它们并非不利地影响拮抗剂抗CD40抗体或其抗原结合片段的物理化学稳定性。可用的载剂、赋形剂或稳定剂的实例包括但不限于额外的缓冲剂、共溶剂、表面活性剂、抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸、螯合剂,如EDTA、金属复合物(例如,Zn-蛋白质复合物),和可生物降解的聚合物,如聚酯。对于可药用的载剂、稳定剂和isomolytes的制剂和选择的全面讨论可见于Remington'sPharmaceuticalSciences(第18版;MackPublishingCompany,Eaton,Pennsylvania,1990)。在制备了本文所述的液体药物制剂或其他药物组合物之后,可以将其冻干以阻止降解。冻干液体组合物的方法是本领域普通技术人员已知的。在使用前,可用可包括其他成分的无菌稀释剂(例如任氏溶液、蒸馏水或无菌生理盐水)重构组合物。在重构后,优选使用本领域技术人员已知的方法向对象施用组合物。拮抗剂抗CD40抗体在生产药物中的用途本发明还提供了本发明的拮抗剂抗CD40抗体或蛋白质用于治疗对象中的自身免疫病和\/或炎性疾病的用途,其中药物与使用至少一种其他疗法的治疗配合。“配合”意指在用至少一种其他疗法治疗对象之前、期间或之后使用药物。其他疗法的实例包括但不限于上文所述的,即,手术或手术程序(例如脾切除术、淋巴结切除术、甲状腺切除术、血浆去除术、白细胞去除术、细胞、组织或器官移植、器官灌注、肠程序等)、放射性疗法、疗法如类固醇疗法和非类固醇疗法、激素疗法、细胞因子疗法、使用皮肤剂的疗法(例如,用于治疗皮肤病况,如过敏症、接触性皮炎和银屑病的局部剂)、免疫抑制疗法和其他抗炎性单克隆抗体疗法等,其中在用包含上文所述的本发明的拮抗剂抗CD40抗体或蛋白质的药物治疗对象之前、期间或之后进行使用其他疗法的治疗。在一种此类实施方案中,本发明提供了mAb1、mAb2或mAb3抗体,其用于治疗对象中的自身免疫病和\/或炎性疾病,其中药物与使用至少一种上文所述的其他疗法的治疗配合。在一些实施方案中,包含拮抗剂抗CD40抗体(例如本文公开的单克隆抗体mAb1、mAb2或mAb3或其抗原结合片段)的药物与使用两种其他疗法的治疗配合。当包含拮抗剂抗CD40抗体的药物与两种其他疗法配合时,可以在使用任一种或两种其他疗法治疗对象之前、期间或之后使用药物。本发明还提供了拮抗剂抗CD40抗体(例如本文公开的抗体mAb1、mAb2或mAb3),其用于治疗对象中的自身免疫病和\/或炎性疾病,其中在已经用至少一种其他疗法预治疗的对象中使用药物。“预治疗”意指对象在接受包含本发明的拮抗剂抗CD40抗体或蛋白质的药物之前,已经用一种或多种其他疗法治疗过。本发明的具体项:1、包含针对靶CD40多肽(SEQIDNO:28)的抗体的抗原结合部分的分离的抗体或蛋白质,特征在于所述抗体或蛋白质a.以10nM或更低的KD结合CD40多肽,和b.包含沉默的IgGFc区。2、项1的分离的抗体或蛋白质,其中所述抗体或蛋白质以50ng\/ml或更低的IC50抑制CD40L诱导的信号传递。3、项1或2中任一项的分离的抗体或蛋白质,其中所述抗体或蛋白质没有或只有低的关于CD40信号传递的激动剂活性。4、项1至3中任一项的分离的抗体或蛋白质,其中所述抗体或蛋白质包含沉默的IgGFc区,所述沉默的IgGFc区选自SEQIDNO:17、SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的氨基酸序列所组成的组。5、根据项1至4中任一项的分离的抗体或蛋白质,所述抗体或蛋白质包含重链(VH)和轻链(VL)可变区,所述重链和轻链可变区分别与SEQIDNO:9的VH和SEQIDNO:10的VL具有至少60、70、80、90、95、96、97、98、99或100百分比序列同一性。6、根据项1至5中任一项的分离的抗体或蛋白质,所述抗体或蛋白质选自:a.包含SEQIDNO:11的重链氨基酸序列和SEQIDNO:12的轻链氨基酸序列的mAb1抗体,b.包含SEQIDNO:13的重链氨基酸序列和SEQIDNO:14的轻链氨基酸序列的mAb2抗体,和c.包含SEQIDNO:15的重链氨基酸序列和SEQIDNO:16的轻链氨基酸序列的mAb3抗体。7、根据项1至6中任一项的分离的抗体或蛋白质,所述抗体或蛋白质用作药物。8、根据项1至7中任一项的分离的抗体或蛋白质,所述抗体或蛋白质用于治疗自身免疫病症和\/或炎性病症。9、根据项1至8中任一项的分离的抗体或蛋白质,所述抗体或蛋白质用于预防或降低移植中移植物排斥的风险。10、根据项7的分离的抗体或蛋白质,所述抗体或蛋白质用于治疗多发性硬化、系统性红斑狼疮、综合症、类风湿关节炎、移植排斥和移植物抗宿主病。11、药物组合物,其包含根据项1至6中任一项的抗体或蛋白质,所述抗体或蛋白质与至少一种可药用的赋形剂、稀释剂或载剂组合。12、项11的药物组合物,其还包含其他活性成分。13、液体药物制剂,其包含根据项1至6中任一项的抗体或蛋白质与至少一种缓冲剂。14、分离的核酸,其编码根据项1至6中任一项的抗体或蛋白质。15、克隆或表达载体,所述克隆或表达载体包含根据项14的一种或多种核酸。16、根据项15的克隆或表达载体,所述克隆或表达载体包含与合适的启动子序列有效连接的下列编码序列(a)-(c)中的至少一种:(a)SEQIDNO:22和SEQIDNO:23;(b)SEQIDNO:24和SEQIDNO:25;或(c)SEQIDNO:26和SEQIDNO:27。17、宿主细胞,其包含根据项15或16的一种或多种克隆或表达载体。18、用于生产项1至6中任一项的抗体或蛋白质的方法,所述方法包括培养项17的宿主细胞,纯化和回收所述抗体或蛋白质。提供下列实施例作为示例,不作为限制。附图图注图1显示了在用Chir12.12(空心圆圈)、mAb1(实心圆圈)、mAb2(实心方块)、mAb3(实心三角)或人CD40L(空心方块)的剂量反应刺激人PBMC培养物72小时后掺入3H-胸苷。图2显示了在用Chir12.12(空心圆圈)、mAb1(实心圆圈)、mAb2(实心方块)、mAb3(实心三角)、人CD40L(空心方块)、同种型对照(实心菱形)的剂量反应刺激人PBMC培养物72小时后掺入3H-胸苷,在存在5μg\/ml抗IgMF(ab’)2或1μMCpG2006的条件下共刺激。图3显示了在用Chir12.12(空心圆圈)、mAb1(实心圆圈)、mAb2(实心方块)、mAb3(黑三角)、人CD40L(空心方块)、同种型对照(实心菱形)的剂量反应刺激人PBMC培养物72小时后掺入3H-胸苷,在存在75ng\/mlIL-4的条件下共刺激。图4显示了用20μg\/mlCD40L和Chir12.12(空心圆圈)、mAb1(实心圆圈)、mAb2(实心方块)、mAb3(黑三角)或人CD40L(空心方块)的剂量反应刺激人PBMC培养物72小时后掺入3H-胸苷。图5显示了抗人CD40抗体与BJAB细胞系的剂量依赖性结合,分别是Chir12.12(实心圆圈)、mAb1(空心方块)、mAb2(空心三角)、mAb3(实心三角)。实施例材料1.单克隆抗体在50mM柠檬酸盐pH7.0,140mMNaCl中提供Chir12.12(1.9mg\/ml)、mAb1(0.88mg\/ml)、mAb2(1.9mg\/ml)和mAb3(1.9mg\/ml)。还使用IgG同种型对照进行选择实验(Sigma,St.Louis,USA)。2.B细胞活化刺激从JacksonImmunoResearch(Suffolk,UK)获得AfiniPureF(ab’)2片段兔抗人IgM,并从Microsynth(Balgach,Switzerland)获得CpG2006。使用本领域普通技术人员已知的标准程序,生成重组人CD40L。使用本领域普通技术人员已知的标准程序,产生含有人IL-4的上清液。3.体外组织培养试剂PBMC培养基:RPMI-1640,10%FBS,1%青霉素\/链霉素,1%非必需氨基酸,1%丙酮酸钠,5mMβ-巯基乙醇(均来自Invitrogen,SanDiego,USA)。方法1.CD40L-介导的PBMC增殖测定1.1纯化人外周血单核细胞(PBMC)从健康的志愿者(Blutspendezentrum,Basel)获得的全血血沉棕黄层中纯化原代PBMC。用含有5mMEDTA的不含Ca2+和Mg2+的PBS1:4稀释血沉棕黄层并将25ml等分至50mlFalcon管中。稀释的血沉棕黄层位于每个Falcon管14mlFicoll-PlaquePlus(GEHealthcare)的下方,并在室温2250rpm(无中断)离心20min。离心后,将中间层转移到单个50mlFalcon管中。将多个管(来自一个供体)的中间层组合为至多30ml体积。加入补充了5mMEDTA的PBS,在室温下2250rpm旋转细胞5min。在加入15ml红细胞(RBC)裂解缓冲剂和室温孵育5min之前,弃去上清液。之后,加入20mlPBS\/5mMEDTA,再次旋转细胞(RT\/5min,2250rpm)。在PBS\/5mMEDTA中洗涤细胞2次(之间有离心步骤),并在使用台盼蓝染料排除确定活细胞数之前,重悬在35mlPBMC基质中。冷冻保藏不立刻用于体外刺激的细胞。1.2体外PBMC刺激测定在存在或缺少恒定剂量的5μg\/ml抗IgMF(ab’)2、1μMCpG2006、含有人IL-4(75ng\/ml)的上清液或40μg\/ml重组huCD40L(标出终浓度)的条件下,在Costar96孔板中,制备一式三份的每种抗CD40或同种型对照mAb的7.2倍系列稀释。每种抗CD40mAb的起始浓度范围是从20μg\/ml至100μg\/ml,取决于实验条件。对于所有实验,在剂量反应中使用CD40L作为阳性对照。基于之前的实验,选择抗IgM、CpG2006、IL-4和CD40L的剂量,其中在剂量反应中评估了这些试剂(单独或组合的)诱导PBMC或B细胞增殖的能力(数据未显示)。之后将PBMC(最终密度为8x104\/孔)加入到每个孔中,然后在37℃\/5%CO2孵育3天。对于收获和使用MicroΒTrilux闪烁计数器确定胸苷掺入之前最后6小时的培养,向每个孔加入3H-胸苷(1μCi\/50μl\/孔)。应注意每个实验都包括细胞加培养基和细胞加培养基加抗IgM、IL-4、CpG2006或CD40L对照培养物(在缺失抗CD40mAb的条件下)。使用Excel和GraphPadPrism软件,分析闪烁数据。结果表示为每分钟的平均计数(cpm)(+\/-平均值的标准差)对于抗CD40mAb浓度的对数转化。每个图中标出了阳性对照和细胞加培养基背景水平。计算IC50或EC50值,通过Prism使数据进行成功的曲线拟合。如上所示,在存在或缺少测试抗CD40mAb的剂量反应条件下,用20μg\/mlCD40L刺激PBMC3天。在培养72小时后,通过3H-胸苷掺入评估增殖。结果表示为具有SEM的一式三份的培养的平均值,并且代表4个供体(独立实验)。抗CD40mAb介导的抑制作用的IC50值用μg\/ml制表。2.体外PBMC激动剂测定如上段落1.2所示,在缺少共刺激,或存在5μg\/ml抗IgMF(ab’)2或1μMCpG2006的条件下,用Chir12.12、mAb1、mAb2或mAb3剂量反应刺激人PBMC3天。在培养72小时后,通过3H-胸苷掺入评估增殖。结果表示为具有SEM的一式三份的培养的平均值,代表4个供体(独立实验)。3.ADCC测定向圆底孔(CorningIncorporated-Costar#3790)中加入50μl的PBMC悬浮液(10x106细胞\/mL),加入50μl钙黄绿素染色的Raji细胞(2x105细胞\/mL)和100μl抗体稀释液或对照。在2%Triton100中,确定最大裂解。收集板底部的细胞(250g,3分钟)并在湿化的CO2气氛(5%)中在37℃孵育1小时。通过离心(750g,3分钟)分离细胞和培养基,并将100μl上清液转移到透明底部的黑色平板(CorningIncorporated-Costar#3904)中,用于测量。在485nm激发后,用SpectraMaxGemini分光光度计(MolecularDevices)确定535nm的荧光。使用下列公式计算特异性裂解:(实验释放-自发释放)\/(最大释放-自发释放)x100。4.抗人CD40抗体变体与人BJAB细胞系的结合为了比较不同的抗CD40抗体Fc变体的结合,在其与人BJAB细胞结合中使用流式细胞术。因此,在96孔V型底平板中,每孔接种2x105细胞。用200μL的FACS缓冲剂(PBS,5%FCS,2mMEDTA),在4℃,1350xg洗涤平板2次2min。弃去上清液,将细胞重悬在100mL含有8%人血清(InVitromex,货号S4190)的FACS缓冲剂中,并孵育10min。洗涤2次后,在50μL含1%人血清的FACS缓冲剂中加入抗人CD40Fc变体,起始浓度为10μg\/mL,以1:2稀释。在冰上孵育细胞30min,再进行2次洗涤步骤。向每个孔加入50μL多克隆兔抗人IgGFITC,F(ab`)2(DAKO,货号F0315),冰上孵育30min。在孵育结束时,洗涤细胞2次,重悬在100μLFACS缓冲剂中,用FACSCantoII收集。在收集后,在FloJo.Graphing中获得FITC通道的平均荧光强度,用GraphPadPrism5.0实施曲线拟合。由于各个实验间强度的改变,将值归一化。因此,每个抗体测试系列的最高值等于100%。用百分比值实施非线性曲线拟合。5.在单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)中的CD40L介导的细胞因子生产测定5.1制备人单核细胞来源的树突状细胞从瑞士红十字提供的人血沉棕黄层中制备人PBMC。将血沉棕黄层1:5稀释在PBS(Invitrogen,货号20012019)中,并按35mL等分试样分布至50mLFalcon管中。之后,每个管中下方加入13mL的Ficoll(GEHealthcare,货号171440-02)。在RT,1680xg下离心细胞20min,不中断。收集含PBMC的层,在大体积的PBS中1000xg5min洗涤2次。最后,将细胞重悬在10mLPBS中并计数。根据生产商的说明,在AutoMACS仪器上使用Miltenyi的人单核细胞分离试剂盒II(Miltenyi,Germany,货号130-091-153),从100x107PBMC中负相分离人单核细胞。在分离后,在培养基(RPMI1640(Invitrogen,货号61870010),10%FCS(Invitrogen,货号16000044,来自美国),1mM丙酮酸钠(Invitrogen,货号11360039),1xNEAA(Invitrogen,货号11140035),1x青霉素\/链霉素(Invitrogen,货号15140122))中4℃1000xg5min洗涤细胞2次。计数分离的单核细胞,按0.4x106\/mL的密度接种在6孔板中,并在37℃,5%CO2中培养7天。为了区别单核细胞和重组的树突状细胞,在开始培养时向培养基中加入人IL-4[80ng\/mL]和人GM-CSF[100ng\/mL](均为内部生产)。5.2刺激树突状细胞(DC)释放细胞因子在培养7天后,通过润洗6孔板,混合细胞并在培养基中1400xg5min洗涤2次,收获未成熟的DC。之后,将100μL的2x105iDC接种到96孔平底板(BectonDickinson,货号353072)中。对于阳性对照,用浓度为1μg\/mL的MegaCD40L(Alexis,货号ALX-522-110-C010)刺激细胞,阴性对照仅由培养基中的iDC组成。在拮抗作用测定中,加入以1:2稀释的10μg\/mL的抗人CD40抗体Fc变体和1μg\/mLMegaCD40L用于剂量反应。在24h后,收集经刺激的细胞的上清液用于TNFα测量。在激动作用测定中,仅加入以1:2稀释的10μg\/mL的抗人CD40抗体Fc变体,并在48h后收集上清液用于TNFα测量。对于所有测定都一式三份地接种和刺激细胞。5.3通过ELISA测量TNFα为了测量上清液中的TNFα的量,如下实施ELISA。将抗TNFα捕获抗体(BDPharmingen,货号551220)以5μg\/mL50μL\/孔涂覆在ELISA平板(Greiner,NuncF96Maxisorp,货号442404)上,4℃过夜。对于每个洗涤步骤,在BioTekELx405洗平板器中,用250μL洗涤平板3次。在第一次洗涤后,在37℃孵育200μL的SuperblockTBS(ThermoScientific,Pierce,货号37535)1h。之后,加入25μl的TNFα标准(重组人TNFα,R&DSystems,货号210-TA)或样品。标准开始的终浓度为20ng\/mL,以1:2系列稀释。此外,以1:500稀释,加入25μL检测抗体(抗人TNFα生物素,BDPharmingen,货号554511)。在4℃孵育平板过夜。洗涤后,在SuperblockTBS中1:5000稀释抗生物素蛋白-POD缀合物(ExtrAV碱性磷酸酶,Sigma,货号E-2636),加入50μL,并在RT孵育1h。洗涤平板,加入50μL底物对硝基苯磷酸酯(Sigma,货号C-3041),显色15min。在SpectraMaxM5(MolecularDevices)上,用软件SoftMaxPro,在450nm读取ELISA平板。6.毒理学研究毒理学研究的主要最初目的是研究高剂量(100mg\/kg)mAb1相比Chir12.12的潜在毒性。该研究使用30只来自毛里求斯的食蟹猴。在开始给药时,动物是约4至5岁,雄性重4.5至6.6kg,雌性重3.1至4.3kg。向一组食蟹猴(5雄性\/5雌性;组2)静脉内施用mAb1(50mg\/mL),剂量水平为100mg\/kg,剂量体积为2mL\/kg,每周1次,进行5周(在第1、8、15、22、29和36天应用测试项目)。另一组食蟹猴(5雄性\/5雌性;组3)通过缓慢的大丸剂输注静脉内接受亲代抗体Chir12.12,剂量水平为100mg\/kg,剂量体积为5mL\/kg。向另一组作为对照的食蟹猴(5雄性\/5雌性;组1)给予mAb1安慰剂,剂量体积为2mL\/kg。所有的动物都在最后1次给药1或2天后进行尸检。为了评估两种抗CD40Ab的功效,决定掺入匙孔虫血蓝蛋白(KLH)免疫。在第2天,用明矾中的1mgKLH免疫动物,随后在第23天强化注射明矾中的0.5mgKLH。分别在免疫\/强化前,以及免疫和强化后第7和第14天,采血清样品。使用食蟹猕猴抗KLHIgM\/IgG参照血清作为标准,用ELISA确定KLH特异性IgM\/IgG滴度。在3次给药前时刻,和第15、29天和尸检(第37\/38天)时,采血液样品,用于免疫表型分型幼稚B细胞(CD20+CD21+CD27-)。从每份血样的总淋巴细胞计数计算绝对幼稚CD20B细胞计数,并通过流式细胞术计算相对幼稚CD20B细胞计数。表4:毒理学研究概述*基于最近的个体体重基于死亡率、临床观察(临床信号包括给药后观测、排泄物评估、皮毛检视和食物消耗)、体重、眼科检查、心血管检查、临床病理学(包括凝血、体外血小板活化检查、血液学、临床化学和尿液分析)、器官重量、宏观和微观尸检结果,评估毒性。在给药前、给药期的第15和29天,以及尸检当天,实施3次血液免疫表型分型。此外,在尸检时实施脾组织的免疫表型分型,并引流匙孔虫血蓝蛋白(KLH)注射位点处的淋巴结。此外,检查对KLH的T细胞依赖性抗体应答(TDAR)以直接比较能够完全ADCC的Chir12.12与mAb1的影响。从所有的动物收集血液用于毒理动力学评价和可能的抗药物抗体(ADA)评价。7.mAb1的额外的体外性能分析7.1PBMC纯化如前1.1节所述,制备人外周血单核细胞。7.2人扁桃体B细胞纯化去除扁桃体囊和结缔组织后,在通过金属细胞滤网粉碎前,将扁桃体材料切成~5mm大小的片,用B细胞培养基常规洗涤。然后,为了去除细胞碎片,通过70μM细胞滤网过滤扁桃体细胞2次。使用EasySepNegativeSelectionHumanBcellEnrichment试剂盒(StemcellTechnologies,Vancouver,BC,Canada),从新鲜的PBMC分离B细胞。按生产商的说明,使用EasySepNegativeSelectionHumanBcellEnrichment试剂盒纯化B细胞(StemcellTechnologies,Vancouver,BC,Canada)。7.3使用人和非人灵长类PBMC或B细胞评估CD40结合的EC50值在剂量反应中用纯化的被标记的mAb1或同种型对照抗体(终浓度范围是2.5μg\/ml-0.00125μg\/ml)在4℃孵育PBMC(恒河猴、食蟹猴或人)或扁桃体B细胞(仅人)30min。之后,在用与NHP具有最低交叉反应性的抗人(非人灵长类交叉反应性的)和生物素化的抗人IgG抗体(R10;应注意可以通过包括抗IgM染色或经由FACS染色的差别强度来区分表达膜IgG的人B细胞)孵育前,洗涤细胞。在洗涤并接受使用链霉亲和素-FITC在4℃最终染色20min前,在4℃再次孵育细胞30min。之后,洗涤细胞,并通过流式细胞术实施CD20+细胞上的CD40表达的评估。7.4评估对人和非人灵长类PBMC或B细胞的CD154诱导的增殖的抑制作用在存在EC80浓度的人重组CD154和IL-4的条件下,在96孔板中,制备一式三份的每种抗CD40或同种型对照mAb的7.2倍稀释系列。每种抗CD40mAb的起始浓度范围是从20μg\/ml至100μg\/ml,取决于实验条件。所有实验使用细胞和培养基对照作为阴性对照。之后,在37℃\/5%CO2孵育3天之前,将PBMC(恒河猴、食蟹猴或人)或扁桃体B细胞(仅人)加入到每个孔中。对于在收获和使用闪烁计数器确定胸苷掺入之前最后6小时的培养,向每个孔加入3H-胸苷(1μCi\/50μl\/孔)。8.在食蟹猴的肾同种异体移植模型中mAb1与环孢霉素A组合的功效8.1动物使用的所有食蟹猴(Macacafascicularis)都是7.5-9岁龄雄性(#5529\/#5533、#5523\/#5524和#5536\/#5538)、圈养繁殖、7.7±0.9kg,来自菲律宾(Siconbrec,MakatiCity,Philippines)。在移植时,动物表现出正常的血液学、血清\/尿液化学,并且是肺结核、沙门氏菌\/志贺氏菌、针对病毒剂(B型疱疹、猿T细胞白血病毒、猿免疫缺陷病毒、猿D型逆转录病毒、乙肝病毒)的抗体和相关的体外寄生虫\/体内寄生虫阴性的。然而,所有的动物表现出针对巨细胞病毒和甲肝病毒(HAV)的抗体(在2010测试;动物#5536是HAV阴性的)。在2010年12月,动物#5523的粪便学测试为结肠小袋纤毛虫(Balantidiumcoli)阳性。在术后第一周,动物居住在单个遥测笼中,允许彼此视觉接触。在剩余时间,动物#5536\/#5538同居,其余4只动物在整个实验过程中保持分离(不相容的动物)。所有的动物都居住在被保持的温度(20-24℃),至少40%湿度和自然光循环下。所有动物都每天用水果和蔬菜混合物喂养至少2次。无限制地提供水和KlibaNafag3446颗粒(Kaiseraugst,Germany)。根据瑞士动物福利管理条款和在BS1555执照下实施所有的实验。表5:动物特征8.2实验条件8.2.1肾移植和术后监控根据ABO匹配,DRB外显子2错配(BlancherA,TisseyreP,DutaurM,等人(2006)Immunogenetics;58(4):269-82),和具有MLR-刺激指数(MLR-SI)>7和<47的单边混合淋巴细胞反应(MLR)中的响应(BigaudM,MaurerC,Vedrine等人(2004)J.Pharmacol.Toxicol.Methods;50(2):153-9)来选择供体\/受体对。该选择的结果显示在表6中,包括双重移植(2个供体之间的交换移植)。每个受体都植入了遥测探针(DataSciencesInc,USA),用于监控动脉血压、心率和运动活动。手术用氯胺酮;10mg\/kg,肌肉内(i.m.)与阿托品(0.05mg\/kgi.m.)联合诱导全麻,并用N2O\/O2(50:50)和异丙酚静脉内(i.v.)(4-10mg\/kg\/h;需要时补充5-10mg大丸剂)保持通气。获得供体肾,用冷的(4℃)威斯康星大学溶液(冷藏时间≤4小时)冲洗并异位移植,使用标准的微脉管技术在移植物肾静脉和受体腔静脉之间,和移植物肾动脉和受体远端主动脉之间产生端侧吻合(吻合术时间≤40分钟)。在移植物出现尿液后实施输尿管cystoneostomy。去除天然的肾。用丁丙诺啡(0.01-0.02mg\/kg,i.m.,每天3次);抗生素(头孢噻肟,25mg\/kg,i.m.,每天2次或头孢曲松,50mg\/kg,在1%利多卡因中i.m.,每天4次)进行术后止痛。止痛和抗生素提供5天。无论何时当血小板计数经历显著的增加或减少时,i.m.施用阿司匹林,剂量为每天5mg\/kg(Aspegic,Sanofi-Aventis,Meyrin,Switzerland)。监控受体的临床改变,和心血管病况、体重、食物和水摄入(最大补充100-150ml\/kg\/天)、尿排出量、血液学(使用BeckmannCoulterACT5Diff)、血清和尿化学(使用Vetscan分析仪进行每日SCrea\/SUrea\/Samylase确定,和使用BeckmannSynchronCX5分析仪进行血清和尿样的最终验证)。使用血清肌酸酐(SCrea)和尿素(SUrea)水平作为移植物功能的标志物。如前所述,在第30天全麻(仅动物#5529和#5533)下,用16G针头实施经皮超声引导的活检(GaschenL,KunklerA,MenningerK等人(2001)Vet.Radiol.Ultrasound;42(3):259-64)。此外,还在动物#5529\/#5533和#5523\/#5524移植前后,实施对血液凝集功能和血小板凝聚的特别监控。在(i)与增加的超声分数相关或不相关的严重的移植物衰竭(例如Screa>500μmol\/l或SUrea>20mmol\/l);或(ii)一般健康问题和\/或明显的临床痛苦症状的情况下,将受体最终安乐死。尸检时,收集肾同种异体移植物(包括输尿管和吻合),以及所有其他的主要器官,处理用于之后的组织学分析。表6:关于所使用的供体\/受体组合和治疗方案的一般信息8.2.2mAb1和环孢霉素A(CsA)治疗在输注当天,提供从-80℃新鲜解冻的液体形式的mAb1。除了第-1、0和1天(移植前后)的前3次给药外,每周1次应用30mg\/kg\/i.v.。口服施用(p.o.)的CsA是微乳液预浓缩物(SandimmunNeoral(RTM)饮用溶液,100mg\/ml,NovartisPharmaAG)。以20mg\/kg\/p.o.的每日剂量应用CsA(从第-1天开始),与mAb1组合(参见表6)。8.2.3监控mAb1的药物动力学(PK)、免疫原性(灵长类抗人抗体)和药效学(PD)(在i.v.给药前)收集血样(500μl血清),用于确定第-1、3、7(基线和15min)、14、28、42、56、70、84和100天时的mAb1暴露。为了确定CsA,在口服给药或CsA之前(C0\/C24)和应用2小时之后(C2)收集血样。C2对应于CsA吸收的峰水平。在进一步处理前,所有的材料都储藏在-80℃(CsA检测试剂盒,HotStarTaqMasterMix,QiagenMinnesota,US)。在第-1、7、14、28、42、56、70、84和100天,收集mAb1-免疫原性的样品(50μl血清),在-80℃保持冷冻。简而言之,用重组人CD40涂敷96孔微滴度板。名义上在4℃储藏过夜。在封闭后,向平板中加入校正标准(Cs)、质量控制(QC)样品和含有mAb1的样品标本。平板名义上在+25℃搅拌孵育120分钟。在洗涤平板后,向平板加入小鼠抗人κ轻链抗体,再加入HRP山羊抗小鼠(H+L)缀合物,以检测与重组CD40结合的任何mAb1。通过添加生色底物(TMB)使其可视化,并且产生的颜色强度(吸光度)与存在的mAb1浓度直接成比例。然后,从校正曲线返回推算样品中的mAb1浓度。在移植前2-3天获得的PD样品作为基线(肝素中0.5ml)。之后,遵照与PK样品相同的程序收集。根据生产商的说明,使用TruCountTubes(BectonDickinson,货号340334)和抗人CD40-APCmAb(Clone5C3,BectonDickinson,货号555591)、抗人CD3-PerCP(CloneSP34-2,BectonDickinson,货号552851)、抗人CD20-FITCmAb(CloneLT20,Immunotools,货号21279203X2),对CD20+和CD3+细胞计数。在LSRII流式细胞仪(BectonDickinsonBiosciences)上获得数据,使用DIVA(6.1.1版)软件。根据大小和粒度,在FSC\/SSC点印迹法中门控淋巴细胞和珠子,并进一步分析CD20和CD3的表达。8.2.4组织学目视检测所有收集的组织(移植物活检或尸检),并固定在4%缓冲的福尔马林中。在脱水后,将其包埋在石蜡中。从石蜡块中切出3μm厚的切片,并用苏木精和伊红(HE)染色。在肾切片上进行3种额外的染色(希氏高碘酸染色、三色染色和Verhoeff染色)。由有经验的病理学家检查活检和尸检样品,并根据肾同种异体移植物病理学的Banff07分类打分(SolezK,ColvinRB,RacusenLC等人(2008)Am.J.Transplant;8(4):753-60)。也由外部专家进行同行审查。此外,使用适合石蜡切片染色的多价抗C4d抗体,实施补体蛋白质C4d的免疫组化(RegeleH,ExnerM,WatschingerB等人2001,Nephrol.Dial.Transplant;16:2058-2066)。C4b被认为是急性体液排斥(AHR)的稳定且可靠的标志物。在固定和石蜡包埋后,制备3μm厚切片的玻璃载玻片(SuperFrostPlus,RTM,Menzel-Glaeser,Germany),并在37℃的烘箱中干燥过夜,使其与载玻片最佳吸附。加入人排斥的肾切片作为阳性对照。在使用前,载玻片在二甲苯中脱蜡(10min),通过梯度乙醇再水合,并放在蒸馏水中。如前所述,通过在柠檬酸盐缓冲剂(pH6.0)中1bar加压蒸10min,进行抗原收回(SegererS,MackM,RegeleH,KerjaschkiD,D.KidneyInt.1999;56:52–64)。对于免疫染色,使用下列方法:(i)室温下,用在纯甲醇中的0.5%H2O2失活内源性过氧化物酶20min;(ii)在0.01MPBS,pH7.4(Sigma-AldrichChemieGmbH,Germany)中洗涤载玻片;(iii)用PBS中的4%脱脂奶粉“Rapilait”(MigrosGenossenschaftsbund,Switzerland)室温孵育载玻片60min;流干而不洗涤;(iv)用1:40在含有1%NGtS的PBS中的pAb兔抗人C4d(BiomedicaMedizinprodukte,Vienna,Austria)+4℃孵育一片载玻片过夜。通过使用兔同种型对照(ZymedLaboratoriesInc,USA)而非一抗,第二片载玻片作为阴性对照;(v)在0.01MPBS,pH7.4中洗涤载玻片;(vi)用1:200在含有1%NGtS的PBS中的生物素化山羊抗兔IgG(VectorLaboratories,Inc.USA)室温孵育所有的载玻片30min;(vii)在0.01MPBS,pH7.4中洗涤载玻片;(viii)用在PBS中的链霉亲和素\/HRP(VectorLaboratories,Inc.USA)室温孵育30min;(ix)用AEC+(DakoCytomationCorp.,Carpenteria,USA)显色HRP活性8-10min,显微镜下控制染色强度,用蒸馏水洗涤;(x)用Dako(RTM)AutomationHematoxylin(DakoCytomationCorp.,Carpenteria,USA)负染2min,并在流动自来水中变蓝5min;(xi)用含水的封固剂(MediteMedizintechnikAG,Switzerland)封固。实施例1:评价mAb1、mAb2和mAb3的激动活性实验数据基于使用分离的、未分级的原代人PBMC。全PBMC制品(而非分离的B细胞或单核细胞)更近似地模拟了体内状态,在所述状态下,抗CD40mAb可以对不同的白细胞细胞类型产生多种直接和间接的效应。使用该PBMC增殖测定确定了保留了来自亲代Chir12.12抗体的未改变的抗原结合部分的氨基酸序列的aglycosylated抗CD40mAbmAb1(N297A)和mAb2(D265A)保留亲代Chir12.12mAb的非激动性,CD40L阻断性质。抗体mAb3(LALA变体)在存在IL-4的条件下是弱激动性的。特别地,实验结果显示Fc沉默的抗CD40mAb无一能够刺激人PBMC的细胞分裂(n=4个供体),该结果与用亲代Chir12.12mAb观察到的结果相似(参见图1)。PBMC响应CD40L而增殖。mAb1或mAb2都不能增强CpG2006或抗IgMF(ab’)2诱导的PBMC增殖(图2)。额外地,Chir12.12不能增强抗IgMF(ab’)2诱导的PBMC增殖,但与mAb1和mAb2不同,其完全抑制CpG诱导的PBMC增殖。在存在IL-4的条件下,观察到mAb3(LALA突变)诱导低但可再现(n=4个供体)水平的胸苷掺入,所述水平高于仅由IL-4诱导的水平,而mAb1、mAb2和Chir12.12则不诱导(图3)。综合这些结果显示除mAb3外(在存在IL-4的条件下),抗CD40mAb无一具有激动性活性。上述结果还明确地证实在存在共刺激信号的条件下,mAb1和mAb2不具有激动剂活性。这是一个重要的发现,因为患慢性自身免疫病的患者中的白细胞可能具有活化或部分活化的表型,并因此对通过CD40或其他刺激的信号传递敏化。应注意Chir12.12(而非Fc沉默的mAb或CD40L)完全抑制CpG2006诱导的PBMC增殖。CpG2006是Toll-样受体9(TLR9)的合成配体,所述Toll-样受体9是表现出结合病原体和宿主来源的ssDNA的受体。在人中,外周血中的B细胞和(程度较低的)单核细胞表达TLR9。由于含有CpG的ODN之前已表现出能增强ADCC(Moga,等人2008),因此,推测CpG2006能够增强由亲代Chir12.12mAb的种系IgG1Fc部分介导的ADCC。实施例2:评价Fc沉默的抗CD40mAb阻断CD40L介导的PBMC增殖的能力之前的数据显示Chir12.12可以阻断CD40L介导的原代人B细胞和人B细胞淋巴瘤细胞系的增殖。我们测量了Chir12.12和根据本发明的3个抗体mAb1、mAb2、mAb3对CD40L介导的PBMC增殖的抑制作用。下表7展示了此类抑制作用的IC50值,以mg\/ml制表(结果展示为具有SEM的一式三份培养的平均值并且代表了4个供体,独立实验)。结果表明Chir12.12也可以抑制CD40L介导的PBMC增殖。此外,mAb1、mAb2和mAb3还完全阻断CD40L介导的PBMC分裂,与Chir12.12的效能相似。抗CD40mAb无一阻断抗IgM+IL-2诱导的PBMC增殖(数据未显示),提示抗CD40mAb的阻断活性是靶依赖性的(与Fc功能无关)。表7:抗CD40mAb介导的对CD40L介导的PBMC增殖的抑制作用的IC50值(μg\/ml).抗体IC50Chir12.12(wtFc)0.176mAb1(N297A)0.058mAb2(D265A)0.146mAb3(LALA)0.118实施例3:抗人CD40抗体变体与人BJAB细胞系的结合为了排除CD40特异性结合的可能改变,测试3个变体mAb1、mAb2和mAb3相比亲代Chir12.12对组成型表达CD40的B细胞系BJAB的结合。在剂量滴定中测试结合,起始于10μg\/mL,以1:2稀释。为了比较不同实验的曲线,将每个单次剂量滴定的最高中位荧光强度设定为100%结合,并应用非线性曲线拟合。在两个单独的实验中,所有4种抗体变体Chir12.12、mAb1、mAb2和mAb3对BJAB细胞都表现出相等的结合曲线(图5)。Chir12.12的Fc结合区的不同突变没有能观察到变体结合能力的改变。因此,上述结果表明Fc结合位点的突变不影响亲代Chir12.12可变区的CD40结合位点。mAb1、mAb2和mAb3保留了与BJAB细胞上的CD40相同的结合。实施例4:抗CD40Fc变体对人单核细胞来源的树突状细胞释放TNFα的刺激\/抑制作用抗CD40Fc变体对人MoDC释放TNFα的刺激作用一些抗人CD40抗体已表现出对不同细胞群体具有激动效应(Gruber1989)。为了排除Fc变体mAb1、mAb2、mAb3和Chir12.12导致MoDC的活化,研究了当与细胞孵育48h时,抗体自身是否诱导TNFα释放。与拮抗性测定相反,仅在存在全部4种抗CD40变体的情况下培养7天龄的人MoDC48h,所述全部4种抗CD40变体处在起始于10μg\/mL的剂量反义曲线中。之后,通过ELISA测试上清液中的TNFα的量。相比作为阳性对照的CD40L刺激(数据未显示),所有的抗CD40变体mAb1、mAb2、mAb3和Chir12.12不诱导从MoDC释放TNFα。所有4种抗体变体都没有观察到剂量依赖性。TNFα的量并不升高至显著高于未受刺激的MoDC的水平(数据未显示)。因此,可以排除上述4种抗体的激动活性。抗CD40Fc变体对人MoDC释放TNFα的抑制作用亲代Chir12.12抗体阻断CD40-CD40L的相互作用,并因此也应该阻断细胞活化。用CD40L三聚体刺激人单核细胞来源的树突状细胞上的CD40导致例如,前炎性细胞因子(如TNFα)的释放(Ma2009)。同样地,相比Chir12.12,Fc区的改变不应影响变体的阻断功能。全部4种抗体应该以相等的IC50抑制从人MoDCCD40L介导的TNFα释放。因此,在存在全部4种阻断性抗CD40变体的情况下,用双重三聚体重组构建体MegaCD40L刺激7天龄的人MoDC24h。之后,通过ELISA测试上清液的TNFα的量。在3次独立实验中,所有的Fc突变的变体mAb1、mAb2和mAb3表现出与Chir12.12相同的剂量反应抑制作用(数据未显示)。初步结果还显示对从人MoDC释放IL-23的相似的抑制作用(数据未显示)。应用非线性曲线拟合,以评估全部4种抗体的IC50,并计算实验的平均IC50。4种抗体的从人MoDC释放TNFα的平均IC50范围在32ng\/mL和40ng\/mL之间(表8)。总而言之,Fc区的突变不影响抗体变体的拮抗效应。表8:不同Fc变体对TNFα抑制作用的IC50#1#2#3平均值SEMChir12.12n.c.4130364mAb12344584010mAb24112423310mAb3398473212来自3次独立实验的不同的抗人CD40Fc变体的ng\/mL的IC50。Chir12.12在#1中的非线性曲线拟合不允许有效估算IC50(n.c.=未计算)。因此,上述结果显示全部4种变体在诱导从MoDC释放TNFα中是失活的。更重要的是,全部变体mAb1、mAb2和mAb3抑制人MoDC的CD40L介导的细胞因子生产,具有较之Chir12.12相同的体外效力。实施例5:数据总结下表9总结了较之亲代Chir12.12抗体,本发明的抗体mAb1、mAb2和mAb3的一些重要性质。表9:比较性数据实施例6:用于实践本发明的有用的氨基酸和核苷酸序列的简述SEQIDNO:序列描述1CHIR-12.12、mAb1、mAb2、mAb3的HCDR1氨基酸序列2CHIR-12.12、mAb1、mAb2、mAb3的HCDR2氨基酸序列3CHIR-12.12、mAb1、mAb2、mAb3的HCDR3氨基酸序列4CHIR-12.12、mAb1、mAb2、mAb3的LCDR1氨基酸序列5CHIR-12.12、mAb1、mAb2、mAb3的LCDR2氨基酸序列6CHIR-12.12、mAb1、mAb2、mAb3的LCDR3氨基酸序列7CHIR-12.12、mAb1、mAb2、mAb3的VH氨基酸序列8CHIR-12.12、mAb1、mAb2、mAb3的VL氨基酸序列9CHIR-12.12的全长重链的氨基酸序列10CHIR-12.12的全长轻链的氨基酸序列11mAb1的全长重链的氨基酸序列12mAb1的全长轻链的氨基酸序列13mAb2的全长重链的氨基酸序列14mAb2的全长轻链的氨基酸序列15mAb3的全长重链的氨基酸序列16mAb3的全长轻链的氨基酸序列17mAb1的Fc区的氨基酸序列18mAb2的Fc区的氨基酸序列19mAb3的Fc区的氨基酸序列20编码CHIR-12.12全长重链的DNA21编码CHIR-12.12全长轻链的DNA22编码mAb1全长重链的DNA23编码mAb1全长轻链的DNA24编码mAb2全长重链的DNA25编码mAb2全长轻链的DNA26编码mAb3全长重链的DNA27编码mAb3全长轻链的DNA28人CD40的氨基酸序列实施例7:用于实践本发明的有用氨基酸和核苷酸序列实施例8:毒理学结果毒理学研究的主要目标是在向食蟹猕猴每周1次静脉内施用5周后(应用6个测试项目)确定mAb1的毒性。为了比较ADCC活性抗体与ADCC-沉默的(mAb1)的效果,还使用该抗体(Chir12.12)的非沉默型(ADCC)。此外,为了评估两种抗CD40Ab的效力,用KLH免疫动物。没有归因于使用mAb1或Chir12.12治疗的死亡率或体重、临床信号与估算食品消耗的改变。在所有组中,KLH注射位点的局部反应都是可比较的。此外,在眼科和心血管研究中没有与测试项目相关的发现。在血液学中,在mAb1-和Chir12.12-治疗的动物中观察到嗜碱性粒细胞的百分比和绝对数的轻微但统计学显著地减少:不能排除与测试项目-治疗的相关性。尿液分析揭示1\/5mAb1-治疗的雌性和2\/5Chir12.12-治疗的雌性的尿液中的酮类与给药具有不明确的相关性。在临床化学中,在Chir12.12-治疗的雄性以及1只Chir12.12治疗的雌性中观察到脂肪酶浓度升高的轻微趋势,但认为这具有有限的毒理学相关性。如通过凝血酶原时间,活化的部分凝血酶原时间,和纤维蛋白原所评估的,凝血不受用mAb1或Chir12.12治疗的影响。血小板计数处于正常范围内。血浆中的P-选择素或sCD40L浓度不提示血小板活化。在Chir12.12-治疗的动物中,血液免疫表型分型显示CD20+B细胞显著减少,这是该抗体预期的药理学作用。特别地,CD20低CD21+B细胞(其被认为是CD40高)被Chir12.12耗尽。然而,尤其是在研究末期,CD20高CD21-B细胞也实质地减少。优先地,CD20+CD21+CD27-幼稚B细胞被ADCC活化抗体Chir12.12耗尽,而CD20+CD21+CD27+记忆B细胞几乎不受影响。在Chir12.12-治疗的动物中,CD16+NK细胞的绝对数也减少约50%。如预期,在用mAb1(其是ADCC-沉默的)治疗后,没有观察到CD20+B细胞的显著减少,也没有观察到CD16+NK细胞绝对数的任何减少。在给药过程中,表现出中等程度降低的仅有B细胞是CD20高CD21-B细胞。已知这些细胞是恒河猴特异性的,且源自生发中心,因此认为该发现不能相关地过渡至人类。尸检时的脾脏的免疫表型分型和KLH引流淋巴结揭示了类似的图画。在Chir12.12-治疗的动物中,CD20+B细胞的相对数减少,但对于mAb1-治疗的动物未观察到CD20+B细胞的相关降低,而CD21-B细胞轻度至中度降低(两种性别的淋巴结,仅雄性的脾脏)。引流KLH注射位点的右侧和左侧淋巴结的免疫表型分型结果没有差别。T细胞依赖性抗体反应(TDAR)显示较之对照组,在mAb1-或Chir12.12-治疗的动物中没有观察到对于KLH的任何IgG和IgM应答。由于通过抑制CD40-CD40配体相互作用阻断B细胞活化是mAb1预期的药理学作用,并且由于预期Chir12.12耗尽B细胞,该发现不被认为是毒理学相关的。毒理动力学评估揭示在研究过程中谷浓度增加,提示mAb1和Chir12.12的积累。在第4和第5次给药之后的平均谷浓度是相似的,提示在第5次mAb1和Chir12.12给药后接近稳定状态的病况。mAb1在第4和第5次给药之后的给药间隔中的平均暴露量(两种性别)分别是906和990h.mg\/mL,Chir12.12分别是757和751h.mg\/mL。AUCτ值也提示了在第5次给药后接近稳定状态的病况。肉眼检查未显示任何靶器官毒性的证据,并且器官重量也在该物种的正常范围内。在显微镜下,在所有的淋巴器官中都见到了两种抗体的测试项目相关发现(脾脏和淋巴结(肠系膜、下颌、腋窝和腹股沟的)),其中mAb1和Chir12.12引起完全抑制皮质B细胞区域中生发中心发育。脾脏和KLH引流和对侧淋巴结组织的CD20免疫染色显示了脾脏中降低的淋巴滤泡大小以及脾脏和淋巴结中的B细胞耗尽,这一效应在Chir12.12-治疗的动物中较之使用mAb1治疗明显得多。在mAb1-治疗的动物中的生发中心中的发现与免疫表型分型中所见的CD21-B细胞降低相对应。CD40免疫染色显示了在用mAb1或Chir12.12治疗后,淋巴结和脾脏中的CD40染色的显著降低。总而言之,基于该研究的结果,每周1次向雄性和雌性食蟹猴静脉内施用浓度为100mg\/kg的mAb1或Chir12.12为期5周(6次施用)是良好耐受的。免疫表型分型显示除CD21-B细胞外,B细胞在Chir12.12-治疗的动物而非mAb1-治疗的动物中耗尽,然而TDAR显示了在mAb1-和Chir12.12-治疗的动物中KLH免疫后缺少IgG和IgM反应。组织病理学揭示来自mAb1-和Chir12.12-治疗的动物的脾脏和淋巴结中缺少生发中心。对B细胞的效应是理想的药理学作用,并因此不认为是不利的。在该研究条件下,认为mAb1和Chir12.12的无可观察的不利效应的剂量水平(NOAEL)都是100mg\/kg剂量。实施例9:mAb1的额外的体外性能分析确定mAb1在人、恒河猴和食蟹猴的白细胞之间的结合和功能性交叉反应性。表10显示了在全部3个物种中mAb1的结合EC50的直接比较。表10:mAb1的人和NHP交叉反应性mAb1以可比较的EC50结合全部3个物种的CD20+细胞(B细胞)。此外,mAb1能抑制CD154+IL-4诱导的人扁桃体B细胞和食蟹猴和恒河猴的PBMC增殖。综合上述结果提示mAb1结合CD40与抑制CD154诱导的人B细胞或非人灵长类PBMC增殖的能力是非常相似的。可用的体外受体占用(RO)数据和功能性抑制作用使得能够确定对于每个物种的这两个变量之间的关系(表11)。表11:mAb1RO和功能性抑制作用之间的关系a可溶性CD154+IL4-诱导恒河猴中PBMC和人中扁桃体B细胞的增殖。b假设恒河猴和人的体内KD与食蟹猴的PK\/PD研究中计算的该值相同。c假设mAb1远高于[靶]可应用Hill-Langmuir公式。结果提示相比人B细胞,mAb1恒河猴PBMC需要低约2倍的RO来抑制PBMC增殖50%。在人体中,可以用约75%(体内预测)RO获得完全的抑制作用。实施例10:移植研究移植物存活在同种异体移植物肾移植中,用mAb1(30mg\/kgi.v.)和环孢霉素A(20mg\/kg,口服)组合治疗导致参与研究的6只动物显著延长的存活。在动物#5529、#5533、#5523、#5524、#5536和#5538中,移植物分别在>91*、31、>92*、>92*、>98*和>98*天(平均:>83.6天)期间是有功能的(*方案结束)。在未治疗的(或用亚治疗IS剂量治疗的)动物中的存活范围是7-10天(历史数据)。由于急性肾衰竭和无尿,在移植31天后安乐死动物#5533。该病理学出现在持续的高血压期之后,麻醉后进行活检采样。移植后监控(a)肌酸酐(SCrea)和尿素(SUrea)的血清浓度Screa是用于评估肾功能的主要参数。在全部6只动物中,移植1天后SCrea水平增加至高于基线水平(从81.8±14.6至221.5±37.1μmol\/l)。Screa的此类升高是移植后第一周期间常见的特征(表12)。表12:在用分别为30和20mg\/kg的mAb1和CsA组合疗法治疗的NHP肾同种异体移植物受体中观察到的Screa的变化在第一周期间,SUrea浓度经历了快速升高至高于第0天测量的基线(4.5±1.3mmol\/l)之上(表13)。在动物#5529\/#5533和#5536\/#5538中,SUrea水平是16-20mmol\/l(第3-5天),而在动物#5523和#5524中,分别是9或8mmol\/l(第7天)。表13:在用分别为30和20mg\/kg的mAb1和CsA组合疗法治疗的NHP肾同种异体移植物受体中观察到的SUrea的变化移植1周后,肾功能倾向于正常化,并且SCrea\/Surea变得接近基线水平。然而,动物#5533、#5523和#5524(而非#5529、#5536和#5538)在移植后第7至19-25天之间表现出额外的SCrea\/Surea增加,提示肾脏发生功能障碍。在该时间段内,可以观察到诸如烦渴\/多尿(#5523和#5524)、持续高血钙(SCa)(#5533)或移植物体积增大(#5523和#5524)的信号。在第20-25天后,动物#5529、#5523、#5524、#5536和#5538改善并表现出优秀的肾功能直到研究结束。然而,在第31天,动物#5533表现出SCrea\/Surea水平明显增加,证实为急性肾衰竭(SCrea;629μmol\/l和SUrea;18mmol\/l)。该病理学出现在持续高血压期之后,在安乐死的前1天进行活检程序。在该时间段的过程中,记录到了高血压峰(~170mmgHg收缩压)和低血压发作(~40mmgHg收缩压)。(b)血清淀粉酶、脂肪酶浓度、体重和血小板计数在移植后第1-7天,全部动物的血清淀粉酶浓度都轻微增加约1.3倍(第0天为311±53U\/L,移植后第7天为418±66.8U\/L)(表14)。在移植后第1天,动物#5533表现出在研究中观察到的最高的淀粉酶浓度(1050U\/L)。在移植前,在第一次mAb1给药前和24小时后(第-1和第0天)没有观察到淀粉酶水平间的差异。表14:用30mg\/kgi.v.mAb1和20mg\/kgp.o.CsA组合治疗的肾移植的动物中的血清淀粉酶浓度(U\/L)平均上,脂肪酶血清浓度在移植前后经历了微小的变化(表15)。仅在实验方案结束时可见微小增加(第84天;2.18倍)。在第1天测量时,动物#5533表现出最高的脂肪酶浓度(284.4U\/L)。未获得动物#5536和#5538的脂肪酶数据。淀粉酶和脂肪酶浓度的变化与使用不同抗体或低分子量化合物的其他移植实验中所见的水平(数据未显示)相似。表15:用30mg\/kgi.v.mAb1和20mg\/kgp.o.CsA组合治疗的肾移植的动物中的4只的血清脂肪酶浓度(U\/L)移植后时间平均脂肪酶(U\/L)STDEV增加倍数第0天121.3第7天13.052.261.09第14天12.91.251.08第56天16.63.411.38第84天26.221.062.18主要可以在动物#5529、#5533和#5536中观察到快速和明显的体重减轻。在全部6只移植的动物中,在移植后前21天内,其范围是从-4至-18%。然而,在该时间点后至研究结束,体重减轻倾向于恢复。在移植后的时间段内,血小板计数正常(300-400细胞x103\/μl)或增加(600-800细胞x103\/μl)。由于血小板计数快速增加,动物#5529接受阿司匹林治疗3天(第7-9天)。动物#5533表现出长期的血小板增多(>1000细胞x103\/μl),并在第7-26天接受阿司匹林治疗。(c)mAb1血液水平和B细胞计数之前进行了参照PK\/PD研究和分析,其中给予食蟹猴10mg\/kg抗体的单次静脉内剂量(数据未显示)。在该研究中,浓度vs.时间谱表现出明显的靶介导的处置(TMD),由于可能更高的靶表达水平,1只动物表现出比另一只动物更快速的清除,强调了靶表达水平在控制PK中的作用。从该研究中,还确立了当mAb1血清浓度高于约5微克\/mL时,这转化为几乎100%CD40受体占用。移植研究的设计(每周和高mAb1剂量水平-30mg\/kg,无恢复\/冲洗阶段)不允许相同的分析水平,并根据之前进行的PK\/PD研究建模。然而,发现了下列观察结果(总结在表16中);i)在第一次给药前收集的样品中未检测到mAb1;ii)贯穿所有剂量的给药阶段都检测到mAb1;iii)在所有收集到的样品中和个体之间,谷浓度是可变的(食蟹猴5524为1200-2500微克\/mL;食蟹猴5523为1000-2000微克\/mL而食蟹猴5529为850-2400微克\/mL)。所有的暴露值都远高于(170至500倍)在食蟹猴中获得完全的受体占用所需的浓度。表16:食蟹猕猴#5533、#5529、#5523和#5524的mAb1血清浓度该研究中还评估了免疫原性测试(猴抗mAb1抗体)。所有样品都显示为阴性,但由于药物干扰,该样品中的高mAb1水平可能阻止了其检测。在所有的受治疗的动物中都可以观察到CD20+细胞随时间部分耗尽。在之前进行的PK\/PD研究中也观察到相似的结果(数据未显示)。组织学结果肾同种异体移植物的组织病理学评估揭示了移植物#5523、#5524、#5529和#5538中没有急性和慢性排斥,以及在达到实验结束的移植物#5536中的临界改变,即(结果总结在表17中)。在动物#5523、#5524和#5538中观察到最小限度的血管周围和间质浸润,并且在动物#5529中观察到最小限度的肾小球细胞过多。表17:组织学结果在移植后第31天安乐死的动物#5533表现出肾小管膨胀、间质浸润和纤维化,但仅最小限度的小管炎。此外,在输尿管附近发现明显的嗜酸性细胞浸润,并且发现靠近吻合的脓肿。所有上述发现都提示长期低下的肾功能,但不能证实排斥。所有病例中C4d免疫染色都是阴性的。在所有动物的淋巴器官中观察到了缺少有或无滤泡萎缩的生发中心发育。在动物#5529和#5533中诊断了由结肠小袋纤毛虫(Balantidiumcoli)感染导致的盲肠结肠炎。未发现任何其他治疗相关改变。移植研究-讨论移植研究的目标是评估在肾同种异体移植物排斥的非人灵长类模型中,当作为与亚治疗剂量的环孢霉素A的组合疗法给药时,mAb1的有益效应。此外,涉及在诱导全身性炎症的模型中评估缺少副作用。当作为与亚治疗剂量的CsA(20mg\/kgp.o.)的组合疗法应用时,mAb1表现出增加NHP中肾同种异体移植物存活的功效。平均移植物存活期>83.6天,6只动物中有5只达到了实验方案的结束(在第91-98天建立)。使用非激动剂阻断性抗CD40抗体(mAb1)靶向CD40导致在移植肾或胰岛的NHP中移植物存活期延长。此外,我们能够评估较之先前报道的Chir12.12(IgG1\/κ同种型的完全人单克隆抗CD40抗体,具有B细胞耗尽和共刺激阻断性质),使用mAb1(其是Fc-沉默的)的更好的效力和安全性。在整个移植后阶段,缺少任何相关的临床病理学事件(例如,归因于典型的移植后受损的肾功能的淀粉酶\/脂肪酶水平的最小限度的增加)。然而,动物#5333、#5523和#5524在第7-19天表现出降低的肾功能。通常该时间段特征是移植后动物中的SCrea\/Surea水平、血压和移植物体积的恢复。在这些动物中,可见受损的肾功能的信号,如增加的SCrea\/SUrea(全部3只动物)、移植物体积的短暂增加(#5523,#5524)或烦渴\/多尿(#5523、#5524)。一个假设可能是这些动物出现了早期排斥过程,所述过程经过3周的mAb1治疗后得到控制。在早期移植后期中的此异常可能是由于靶向CD40途径的分子(Fc-沉默的)的作用的免疫模式所诱导的差异。1只动物(#5533)由于急性肾衰竭(无排斥)在第31天安乐死。这一结果是由移植程序后不完全的肾功能恢复导致的。提示肾功能低下的信号是高Surea水平(11-19mmol\/l)或持续的高SCa浓度(>2.8mmol\/l)。活检收集程序应用麻醉过程中观察到的持续的高血压(>140mmHg收缩压)与低血压的组合加速了最后的移植物丢失,在安乐死前一天夜晚记录到了高血压峰(~170mmHg收缩压)(PalmerBF(2002)N.Engl.J.Med;347(16):1256-1261)。所有的这些事件都不能归因于mAb1治疗,而仅是移植后阶段中的个体差异。在组织学上也可以证实组合疗法的高功效。在实验结束时,6个移植物中的5个表现出优秀的移植物质量。在使用Chir12.12的移植实验中也观察到缺乏生发中心的发育。没有观察到其他治疗相关的组织改变。长期存活者之一(#5529)出现了由结肠小袋纤毛虫导致的盲肠结肠炎。虽然该感染在恒河猴中是常见的并且通常是无症状的,但免疫抑制可能导致急性疾病发作(SchusterFL,Ramirez-AvilaL,(2008)Clin.Microbiol.Rev;21(4):626-38)。在该动物中,没有观察到临床信号,如腹泻或体重减轻。关于B细胞计数监控,可以在全部治疗的动物中观察到随时间部分耗尽。该部分耗尽可能并非由于活性的Fc-受体介导的耗尽,因为mAb1是沉默的抗体,其不结合FcR也不在体外介导ADCC。部分耗尽可以是在实验结束时的组织学中观察到的缺少生发中心的反映。该部分耗尽可能是由于缺少存活信号。总而言之,移植研究的结果支持使用mAb1(并且延伸至本发明的其他抗体和蛋白质)作为组合疗法中肾排斥治疗的有效靶,具有优秀的安全性谱。优秀的安全性谱和效力进一步支持本发明的抗体在治疗自身免疫病症和\/或炎性病症,以及预防由表达CD40抗原的细胞上的CD40L介导的CD40信号传递介导的移植排斥的用途。总结尚未报道抗CD40在患者中诱导止血事件,但出于安全性的原因,在接受抗CD40AbChir12.12的B细胞淋巴瘤患者中胰腺酶的升高和胰腺炎的潜在风险排除了在慢性自身免疫病和移植中使用此Fc活性的抗CD40抗体。因此,我们生成了在体外和体内都不能介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的Fc沉默的IgG1抗CD40抗体(mAb1、mAb2和mAb3)。与亚治疗剂量的环孢霉素组合,mAb1能够延长非人灵长类肾同种异体移植物的存活。此外,mAb1能够完全抑制对使用T细胞依赖性抗原的免疫的初级和次级抗体应答。关键地,在移植或免疫研究中,没有止血事件或异常的胰腺组织学证据。综合这些结果提示mAb1是安全并且有效的治疗剂,并能够用于治疗患B淋巴细胞和抗原呈递细胞驱动的自身免疫病的患者或进行同种异体移植物移植的患者,其中CD40-CD154相互作用涉及对病理学的贡献。...
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