本发明涉及间充质干细胞培养，具体涉及一种骨髓间充质干细胞体外培养液及培养扩增方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一群具有向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化能力的干细胞，存在于成体的骨髓、骨、脂肪和肌肉等组织中。MSC体外贴壁性使之易于分离纯化，且体外培养的MSC增殖能力强，是一种具有重要应用价值的种子细胞。
人骨髓间充质干细胞(human bone mesenchymal stem cells，HBMSCs)是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，在相应的诱导条件下能体外分化为骨、脂肪、软骨、神经、肝和心肌细胞等多种细胞组织，在放射病、血液病等临床治疗以及组织器官修复等方面具有极大的应用潜力，是当前科学研究的热点。
目前HBMSCs体外扩增培养多采用经典的Dexter长期培养体系(Dexter-type longterm cultures，Dexter-LTC)，其成本高、操作复杂，培养的细胞易老化、培养周期长，远无法满足临床和科研的需求。故如何获得低成本、操作简便、活力更高的HBMSCs具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种人骨髓间充质干细胞体外培养液及培养扩增方法，用于提高人骨髓间充质干细胞的的扩增效率，同时保持生物学效应及多向分化潜能。
上述目的是通过如下技术方案得以实现的：
一种骨髓间充质干细胞体外培养液，用于体外培养扩增骨髓间充质干细胞，该体外培养液中含有如下结构所述的化合物(Ⅰ)，
进一步地，所述的骨髓间充质干细胞体外培养液以DMEM培养液作为基础培养液，还包括L-谷氨酰胺、维生素C、胰岛素、红细胞生成素和血管内皮生长因子。
一种骨髓间充质干细胞体外培养液的制备方法：将DMEM培养液作为基础培养基，并依次加入如权利要求1所述的化合物(Ⅰ)、L-谷氨酰胺、维生素C、胰岛素、红细胞生成素和血管内皮生长因子，再用氢氧化钠调节pH值，最后加入胎牛血清并过滤除菌，得到骨髓间充质干细胞体外培养液；其中，所述化合物(Ⅰ)浓度为15～25mg/L，所述L-谷氨酰胺浓度为200～400mg/L，所述维生素C浓度为60～90mg/L，所述胰岛素浓度为10～20mU/L，所述红细胞生成素浓度为20～40U/L，所述血管内皮生长因子浓度为20～120μg/L。
进一步地，所述的制备方法中用氢氧化钠调节pH值至7.0～7.2。
进一步地，所述的制备方法中化合物(Ⅰ)浓度为20mg/L。
进一步地，所述的制备方法中L-谷氨酰胺浓度为300mg/L，所述维生素C浓度为75mg/L，胰岛素浓度为15mU/L，红细胞生成素浓度为30U/L，血管内皮生长因子浓度为70μg/L。
一种骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，包括如下步骤：
步骤S1，制备如上所述的骨髓间充质干细胞体外培养液；
步骤S2，收集人骨髓间充质干细胞原代细胞，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，计细胞数，调整细胞密度后加入步骤S1制备的体外培养液，并接种至培养皿中；
步骤S3，将培养皿置于CO2培养箱中培养；
步骤S4，使用倒置相差显微镜观察细胞贴壁及生长状况，在首次传代后24小时首次换液，并在换液后每隔48小时换液1次；
步骤S5，当细胞达80％至90％融合时，用PBS洗掉非贴壁细胞及杂质，收集贴壁细胞。
进一步地，所述的骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法中，步骤S3CO2培养箱培养条件为：37℃、5％的CO2、95％饱和湿度。
本发明的优点：
本发明提供的人骨髓间充质干细胞体外培养液及培养扩增方法可以提高人骨髓间充质干细胞的的扩增效率，与现有技术相比，具有突出的实质性特点和显著的进步。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
实施例1：体外培养液的制备和体外培养扩增方法
体外培养液组成：
配制950ml DMEM培养液作为基础培养基，并依次加入化合物(Ⅰ)20mg、L-谷氨酰胺300mg、维生素C 75mg、胰岛素15mU、红细胞生成素30U和血管内皮生长因子70μg，再用氢氧化钠调节pH值至7.0～7.2，最后加入50ml胎牛血清并过滤除菌，得到骨髓间充质干细胞体外培养液，放入4℃保存备用。
培养扩增方法：
步骤S1，制备上述骨髓间充质干细胞体外培养液；
步骤S2，收集人骨髓间充质干细胞原代细胞，用0.25％胰蛋白酶消化制成细胞悬液，计细胞数，调整细胞密度，以2×105个/ml加入步骤S1制备的体外培养液，并接种至培养皿中；
步骤S3，将培养皿置于37℃、5％的CO2、95％饱和湿度CO2培养箱中培养；
步骤S4，使用倒置相差显微镜观察细胞贴壁及生长状况，在首次传代后24小时首次换液，并在换液后每隔48小时换液1次；
步骤S5，72h细胞达80％至90％融合，用PBS洗掉非贴壁细胞及杂质，收集贴壁细胞。
实施例2：体外培养液的制备和体外培养扩增方法
体外培养液组成：
配制950ml DMEM培养液作为基础培养基，并依次加入化合物(Ⅰ)15mg、L-谷氨酰胺200mg、维生素C 60mg、胰岛素10mU、红细胞生成素20U和血管内皮生长因子20μg，再用氢氧化钠调节pH值至7.0～7.2，最后加入50ml胎牛血清并过滤除菌，得到骨髓间充质干细胞体外培养液，放入4℃保存备用。
培养扩增方法：
步骤S1，制备上述骨髓间充质干细胞体外培养液；
步骤S2，收集人骨髓间充质干细胞原代细胞，用0.25％胰蛋白酶消化制成细胞悬液，计细胞数，调整细胞密度，以2×105个/ml加入步骤S1制备的体外培养液，并接种至培养皿中；
步骤S3，将培养皿置于37℃、5％的CO2、95％饱和湿度CO2培养箱中培养；
步骤S4，使用倒置相差显微镜观察细胞贴壁及生长状况，在首次传代后24小时首次换液，并在换液后每隔48小时换液1次；
步骤S5，72h细胞达80％至90％融合，用PBS洗掉非贴壁细胞及杂质，收集贴壁细胞。
实施例3：体外培养液的制备和体外培养扩增方法
体外培养液组成：
配制950ml DMEM培养液作为基础培养基，并依次加入化合物(Ⅰ)25mg、L-谷氨酰胺400mg、维生素C 90mg、胰岛素20mU、红细胞生成素40U和血管内皮生长因子120μg，再用氢氧化钠调节pH值至7.0～7.2，最后加入50ml胎牛血清并过滤除菌，得到骨髓间充质干细胞体外培养液，放入4℃保存备用。
培养扩增方法：
步骤S1，制备上述骨髓间充质干细胞体外培养液；
步骤S2，收集人骨髓间充质干细胞原代细胞，用0.25％胰蛋白酶消化制成细胞悬液，计细胞数，调整细胞密度，以2×105个/ml加入步骤S1制备的体外培养液，并接种至培养皿中；
步骤S3，将培养皿置于37℃、5％的CO2、95％饱和湿度CO2培养箱中培养；
步骤S4，使用倒置相差显微镜观察细胞贴壁及生长状况，在首次传代后24小时首次换液，并在换液后每隔48小时换液1次；
步骤S5，72h细胞达80％至90％融合，用PBS洗掉非贴壁细胞及杂质，收集贴壁细胞。
实施例4：实施例1的对比，不添加化合物(Ⅰ)
体外培养液组成：
配制950ml DMEM培养液作为基础培养基，并依次加入L-谷氨酰胺300mg、维生素C75mg、胰岛素15mU、红细胞生成素30U和血管内皮生长因子70μg，再用氢氧化钠调节pH值至7.0～7.2，最后加入50ml胎牛血清并过滤除菌，得到骨髓间充质干细胞体外培养液，放入4℃保存备用。
培养扩增方法：
步骤S1，制备上述骨髓间充质干细胞体外培养液；
步骤S2，收集人骨髓间充质干细胞原代细胞，用0.25％胰蛋白酶消化制成细胞悬液，计细胞数，调整细胞密度，以2×105个/ml加入步骤S1制备的体外培养液，并接种至培养皿中；
步骤S3，将培养皿置于37℃、5％的CO2、95％饱和湿度CO2培养箱中培养；
步骤S4，使用倒置相差显微镜观察细胞贴壁及生长状况，在首次传代后24小时首次换液，并在换液后每隔48小时换液1次；
步骤S5，72h细胞达80％至90％融合，用PBS洗掉非贴壁细胞及杂质，收集贴壁细胞。
实施例5：化合物(Ⅰ)的制备和结构确证
分离制备方法：(a)将芭蕉的干燥根茎(2kg)粉碎，用75％乙醇热回流提取(20L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(4L)，依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水饱和的正丁醇(4L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用8％乙醇洗脱10个柱体积，再用70％乙醇洗脱12个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1(8个柱体积)、20:1(8个柱体积)、10:1(8个柱体积)和5:1(10个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1(8个柱体积)、5:1(10个柱体积)和2:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～14个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)(624mg，HPLC归一化纯度大于98％)。
结构确证：HR-ESI-MS显示[M+H]+为m/z 265.1756，结合核磁可得分子式为C16H24O3，不饱和度为5。核磁共振氢谱数据δH(ppm，CDCl3，500MHz)：H-3(2.74，m)，H-4a(3.12，dd，J＝15.2，13.3Hz)，H-4b(2.53，d，J＝14.6Hz)，H-6(2.86，qd，J＝7.3，2.2Hz)，H-7(3.26，m)，H-8a(1.44，m)，H-8b(1.41，m)，H-10a(2.06，m)，H-10b(1.87，m)，H-11a(4.32，m)，H-11b(4.22，m)，H-12(4.85，d，J＝4.7Hz)，H-13(1.17，d，J＝7.2Hz)，H-14(1.02，s)，H-15(1.09，s)，12-OMe(3.35，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，CDCl3，125MHz)：133.6(C，1-C)，129.2(C，2-C)42.4(CH，3-C)，39.7(CH2，4-C)，215.4(C，5-C)48.5(CH，6-C)，45.2(CH，7-C)，46.4(CH2，8-C)，37.1(C，9-C)，46.9(CH2，10-C)，68.8(CH2，11-C)，106.2(CH，12-C)，13.6(CH3，13-C)，28.2(CH3，14-C)，29.7(CH3，15-C)，54.6(CH3，12-OMe)。红外波谱表明该化合物含有羰基(1748cm-1)。13C-NMR、DEPT和HSQC谱中显示有16个碳信号，包括四个甲基(一个甲氧基)，四个亚甲基(一个连氧碳)，四个次甲基(一个连氧碳)，以及四个季碳(两个烯烃碳和一个羰基碳)，以上功能结构再结合不饱和数表明该化合物为三环结构。1H-NMR谱结合HSQC谱显示三个甲基质子信号δH 1.17(3H，d，J＝7.2Hz)、1.02(3H，s)、1.09(3H，s)，一个甲氧基质子信号δH 3.35(3H，s)，三组亚甲基质子信号δH 3.12(2H，dd，J＝15.2，13.3Hz)与2.53(1H，d，J＝14.6Hz)、1.44(1H，m)与1.41(1H，m)、2.06(1H，m)与1.87(1H，m)，一组连氧亚甲基质子信号4.32(1H，m)与4.22(1H，m)，三个次甲基质子信号δH 2.74(1H，m)、2.86(1H，qd，J＝7.3，2.2Hz)、3.26(1H，m)，一个连氧次甲基质子信号δH 4.85(1H，d，J＝4.7Hz)。1H-1H COSY谱中存在H-12/H-3/H2-4、H-6/H-7/H2-8和H-6/H3-13相关信号，同时HMBC谱中显示有H2-4与C-2，H-6与C-1和C-7，H2-8与C-1和C-10，H2-10与C-2和C-14，H-12与C-2和C-11，H3-13与C-7，H3-14与C-8、C-9和C-10，H3-15与C-9和C-10，12-OMe与C-12相关信号，通过上述NMR谱中的相关信息可以构建该化合物的连接方式，并且上述波谱数据表明该化合物为tremulane型倍半萜。HMBC谱中，质子信号δH 3.35与C-12的相关性表明C-12位连有一个甲氧基并形成缩醛结构；H2-4、H-6和H3-13与C-5(δC215.4)的相关性表明C-5为羰基。在tremulane型倍半萜中，H-6与H-7位一般为β构型，H3-14构型通常处是β位，H3-15构型为α位，在该化合物的NOE试验中体现的H-7与H3-14相关信号符合tremulane型倍半萜的构型关系。NOESY谱中，H-3与H3-13的相关性表明H-3为α构型。此外，H-12与H-3的NOE相关性以及两者的耦合常数(4.7Hz)表明H-12的构型为α型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。结构式和碳原子编号如下：
实施例6：人骨髓间充质干细胞的培养扩增结果
骨髓间充质干细胞生长曲线测定
实验组：以实施例1制备的第3代细胞为标本，制备单细胞悬液，调整密度为2×104个/mL，接种于12孔培养板，继续用实施例1中的体外培养液培养，每孔500μL，每2天换液。分别于1、2、3、4、5、6、7、8天，每组取2孔进行细胞计数，绘制细胞生长曲线。
对照组：以实施例4制备的第3代细胞为标本，制备单细胞悬液，调整密度为2×104个/mL，接种于12孔培养板，继续用实施例4中的体外培养液培养，每孔500μL，每2天换液。分别于1、2、3、4、5、6、7、8天，每组取2孔进行细胞计数，绘制细胞生长曲线。
实验结果表明，实验组的细胞增殖速度明显高于对照组，实验组第6天时达到平台期，细胞浓度为16×104个/mL，对照组第7天时达到平台期，细胞浓度为12×104个/mL。
实施例2和3具有与实施例1近似的技术效果。
上述试验结果表明，本发明提供的骨髓间充质干细胞体外培养液及培养扩增方法可以显著提高骨髓间充质干细胞体外培养扩增效率，与现有技术相比，具有突出的实质性特点和显著的进步。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。