敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法与流程

技术特征：

1.一种敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，通过失活吸水链霉菌XM201基因组中编码pyk的ORF3547，以及编码sdh的ORF1011、ORF6607和ORF4917，导致中心碳代谢流量重排及相关前体积累，使格尔登素的发酵产量得以提高。

2.如权利要求书1所述的敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，所述编码pyk的ORF3547的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求书1所述的敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，所述编码sdh的ORF1011的序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求书1所述的敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，所述编码sdh的ORF6607的序列如SEQ ID NO.3所示。

5.如权利要求书1所述的敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，所述编码sdh的ORF4917的序列如SEQ ID NO.4所示。

6.如权利要求书1所述的敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，构建步骤如下：

第一步：设计并构建用于ORF3547失活的同源重组质粒载体I；

第二步：设计并构建用于ORF1011失活的同源重组质粒载体II；

第三步：设计并构建用于ORF6607失活的同源重组质粒载体III；

第四步：设计并构建用于ORF4917失活的同源重组质粒载体IV；

第五步：将构建得到的四个同源重组质粒载体通过接合转移导入受体菌吸水链霉菌XM201中进行同源重组；

第六步：通过对突变株的筛选和阿泊拉霉素抗性验证，并通过PCR产物片段大小的差异筛选得到ORF3547、ORF1011、ORF6607、ORF4917失活的突变株。

7.权利要求书6所述敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，所述质粒载体I的构建方法是，在质粒pJTU1278的KpnI/XbaI位点插入来自ORF3547的0～750bp区域左侧2025bp PCR片段和来自ORF3547的0～750bp区域右侧2045bp PCR片段，得到的载体通过HindIII位点连入阿泊拉霉素抗性基因；所述质粒载体II的构建方法是，在质粒pJTU1278的KpnI/XbaI位点插入来自ORF1011的上游17bp～基因内677bp区域左侧2068bp PCR片段和来自ORF1011的上游17bp～基因内677bp区域右侧2049bp PCR片段，得到的载体通过HindIII位点连入阿泊拉霉素抗性基因；所述质粒载体III的构建方法是，在质粒pJTU1278的XbaI/HindIII位点插入来自ORF6607的4～624bp区域左侧2078bp PCR片段和来自ORF6607的4～624bp区域右侧2069bp PCR片段，得到的载体通过EcoRI位点连入阿泊拉霉素抗性基因；所述质粒载体IV的构建方法是，在质粒pJTU1278的XbaI/HindIII位点插入来自ORF4917的上游111bp～基因内部720bp区域左侧2144bpPCR片段和来自ORF4917的上游111bp～基因内部720bp区域右侧2176bp PCR片段，得到的载体通过EcoRI位点连入阿泊拉霉素抗性基因。

8.权利要求书1所述敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，所述发酵是指将链霉菌孢子或者菌丝体接种在种子培养基中于30℃、220rpm的转速下培养36小时后转接发酵培养基发酵6天。

9.权利要求书8所述敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，所述种子培养基含有质量体积比为1％的葡萄糖、1％的蛋白胨和0.5％的酵母提取物；所述发酵培养基含有质量体积比为3％的淀粉、7％的葡萄糖、4％的黄豆饼粉、0.3％的硫酸铵、1％的碳酸钙、0.001％的氯化钴和0.1％的大豆油。

10.权利要求书8所述敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，种子培养物按15％的接种量转接于发酵培养基。