本发明涉及一种枯草芽孢杆菌对数期表达系统，属于基因工程领域。
背景技术：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)由于具有生长速度快、发酵周期短、胞外分泌蛋白能力强等特点，正在为应用生物学发挥着重要的作用。同时作为研究透彻模式菌株又是被普遍认为是安全的(GRAS)，已广泛应用于食品和药品的研究和生产中。
但是，利用枯草芽孢杆菌过量表达途径基因某些代谢产物时，在对数期，前体合成基因的表达会促进前体的积累来提高产量。而进入稳定期后由于能量的限制，这些前体合成基因的表达反而会造成浪费，使产量降低。另外在表达一些酶制剂时，例如蛋白酶等，这类酶分子的在对数期的过量合成会使胞外有机氮源的分解更加迅速，有助于菌体的快速生长和缩短发酵时间。因此，通过调控启动子在不同生长时期的表达具有重要的现实意义。目前，研究者主要是通过添加诱导剂的方式来实现调控目的基因在不同时期的区别表达，而这类方法具有添加时期确定复杂、成本增加，且难以实现前期表达而稳定期不表达等缺点。对数期启动子是指只在菌体处于生长周期中的对数期才具有启动目的基因转录和表达能力的启动子。构建一种依托于草芽孢杆菌对数期启动子的自调控对数期表达系统具有很好的应用前景。
技术实现要素：
为了满足目前利用枯草芽孢杆菌生产代谢产物和酶制剂等过程中需要在对数期特异表达某些基因的需求，本发明提供了三个对数期启动子以及一种枯草芽孢杆菌对数期期表达系统，并将其应用至蛋白分子的表达和代谢产物的生产。
本发明的第一个目的是提供一种携带对数期启动子的质粒，是将质粒原有的用于表达目的基因的启动子替换为对数期启动的启动子；所述对数期启动的启动子包括Phag、PabrB和PvalS；其序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；用于构建所述质粒的出发质粒是pP43NMK、pUB110、pC194、pE194或在上述质粒基础上改造后的质粒。
本发明的第二个目的是提供一种枯草芽孢杆菌对数期表达系统，所述表达系统是含有所述携带对数期启动子的质粒的枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述携带对数期启动子的质粒是连接有Phag、PabrB和PvalS，中至少一种启动子的pP43NMK、pUB110、pC194、pE194或在上述质粒基础上改造后的质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为不含卡那霉素抗性的Bacillus subtilis168或Bacillus subtilis WB600。
本发明的第三个目的是提供一种枯草芽孢杆菌对数期表达系统的构建方法，所述方法是构建携带有对数期启动子的质粒作为表达载体，并转入不含卡那霉素抗性的枯草芽孢杆菌中。在一般培养条件下，菌体生长进入对数期以后，该表达载体上的目的基因开始表达，进入稳定期后，目的基因停止表达。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将枯草芽孢杆菌对数期启动的组成型启动子与载体进行连接，构建重组载体，再将重组载体转入宿主中。
在本发明的一种实施方式中，所述对数期启动的组成型启动子包括Phag、PabrB和PvalS，其序列分别如SEQ ID NO.1～3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述载体包括pP43，pP43NMK、pUB110、pC194、pE194或在上述质粒基础上改造后的质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
1.构建携带有对数期启动子的质粒：以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR获得对数期启动的启动子的DNA片段，通过酶切连接的方式替换掉质粒上用于表达目的基因的原有的启动子，转化入相应的构建宿主，获得携带有对数期启动子的质粒；所述表达质粒是：pP43NMK、pUB110、pC194、pE194或由这几种质粒改造后的质粒。
2.将携带对数期启动子的质粒转化至不含有相应抗性基因的枯草芽孢杆菌宿主中，在相应的抗性条件下筛选，获得枯草芽孢杆菌对数期表达系统。所述枯草芽孢杆菌宿主包括：Bacillus subtilis 168，Bacillus subtilis 131.1，Bacillus subtilis AG1839，Bacillus subtilis PY79，Bacillus subtilis BAB-1，Bacillus subtilis XF-1，
该表达系统的有效性的验证是以枯草芽孢杆菌中应用最为广泛的P43启动子以与对数期启动子相同的方式构建而成的传统表达系统作为对照的，通过与对照比较基因表达情况来验证有效性。
其中步骤1中携带有对数期启动子的质粒的具体构建方法如下：
(1)对数期启动子DNA片段的获得：以Bacillus subtilis 168(Bacillus subtilis 168，获取自美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心)基因组模板，PCR扩增Bacillus subtilis 168基因组上Phag、PabrB和PvalS启动子DNA片段；所述Phag、PabrB和PvalS的序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
(2)将Phag、PabrB和PvalS启动子DNA片段通过双酶切后，分别与相同酶切处理过的pP43质粒进行连接，之后转入Escherichia coli JM109中，通过氨苄青霉素平板筛选和质粒测序验证，分别得到携带有Phag的质粒pPHAG、携带有PabrB的质粒pPABRB和携带有PvalS的质粒pPVALS。
该表达系统有效性的验证，可以选用各种外源基因进行表达验证，以角蛋白酶为例，验证方法如下：
(1)菌株构建：以地衣芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增ker基因片段，连接到pP43和PyqfD上，构成新的质粒pP43-ker和pPHAG-ker。将新构建的两个质粒分别转入到Bacillus subtilis 168中。
(2)筛选含有Bacillus subtilis 168(pP43-ker)和Bacillus subtilis 168(pPHAG-ker)的菌株。
(3)酶活比较：将两株菌在发酵培养基中发酵培养，测定菌体浓度和角蛋白酶活性，比较菌体量和酶活大小。Bacillus subtilis 168(pPHAG-ker)中菌体生长更好，且角质酶酶活更高，说明该表达系统有效。
本发明的第四个目的是提供一种枯草芽孢杆菌对数期表达目的基因的方法，将目的基因与权利要求1所述的质粒连接，再转入枯草芽孢杆菌中进行表达。
本发明的第五个目的是提供所述枯草芽孢杆菌对数期表达系统在蛋白合成和代谢产物生产方面的应用。
有益效果：本发明首次筛选获得了枯草芽孢杆菌对数期启动的启动子Phag、PabrB和PvalS，并将其用于构建枯草芽孢杆菌对数期表达系统，可以使重组枯草芽孢杆菌只有在进入对数期以后，且在稳定期之前，质粒上携带的目的基因才能表达。实验表明，本发明的pPHAG、pPABRB和pPVALS表达系统表达角蛋白酶基因(ker)的效果与传统前启动系统相比，菌体浓度和角蛋白酶活分别提高15.2％和41.5％，13.2％和36.7％，10.4％和27.8％。
具体实施方式
菌株的培养方法：
种子培养基(L)：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠。
发酵培养基(L)：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠，。
培养条件：种子培养12h，37℃，220rpm，发酵培养24h，接种量5％，37℃，220rpm。菌株培养过程中添加相应浓度的抗生素以维持其质粒稳定性。
荧光强度测定：
将发酵液离心10min(10000×g，4℃)，用等体积的tris-HCL(50mM、pH8.0)洗涤沉淀两次。再次离心10min(10000×g，4℃)以后用一定体积的tris-Hcl(50mM、pH8.0)悬浮沉淀至OD600为2.0，在冰浴上超声波破碎(破碎条件：功率25W，工作时间2s，停歇时间5s，工作破碎时间共4min)。将破碎液再次离心10min(10000×g，4℃)，吸取上清液200μL用NUNC96孔黑色酶标板进行荧光检测，检测时做4个复孔，所用仪器为BioTek Synergy4多功能酶标仪，操作软件为Gen5。荧光强度参数设置为，激发：488/9nm发射：509/9nm,顶端发光，氚气灯，增益为自动调整增益。
角蛋白酶基因表达及酶活测定：
种子培养基(L)：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠。
发酵培养基(L)：10g葡萄糖，10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠，0.1g硫酸镁。
培养条件：种子培养12h，37℃，220rpm，发酵培养36h，接种量5％，37℃，220rpm。菌株培养过程中添加相应浓度的抗生素以维持其质粒稳定性。
酶活测定：将发酵液离心10min(10000×g，4℃)，取上清液进行适当稀释，吸取200μL与300μL 0.05mol/L Gly-NaOH缓冲液(pH 9.0)溶解1％的底物(角蛋白)混匀，50℃反应15min，加入500μL4mol/LTCA溶液以终止反应。离心10min，吸取200μL上清液，依次加入1mL福林酚试剂和200uL 0.5mol/LNa2CO3，50℃反应15min。以零时间的反应液作为空白，于660nm处检测吸光值。
以角蛋白为底物，每15min催化分解角蛋白生成1μg酪氨酸所需要的酶量为一个酶活单位(U)。
表1引物序列表
实施例1Phag、PabrB和PvalS启动子的获得和表达载体构建
以Bacillus subtilis 168基因组模板，以#1和#2为引物，通过PCR扩增Bacillus subtilis 168基因组Phag启动子DNA片段；以Bacillus subtilis 168基因组模板，#3和#4为引物，通过PCR扩增Bacillus subtilis 168基因组PabrB启动子DNA片段；以Bacillus subtilis 168基因组模板，#5和#6为引物，通过PCR扩增Bacillus subtilis 168基因组PvalS启动子DNA片段；反应条件：预变性98℃3min；变性98℃10s；延伸68℃30s；共34cycles；后延伸5min。将上述三个PCR获得片段分别通过BamHI和XhoI双酶切处理，回收后通过DNA连接酶与相同酶切处理的pP43相连。转化至Escherichia coli JM109后，提取质粒，经测序验证正确，分别命名为pPHAG、pPABRB和pPVALS。
实施例2利用枯草芽孢杆菌对数期表达系统表达荧光蛋白
以质粒pMD-19T simple-GFP(如SEQ ID NO.15所示)为模板，#7和#8为引物，克隆gfp荧光蛋白基因(如SEQ ID NO.16所示)，前端添XhoI酶切位点和RBS，后端添加PstI酶切位点。利用XhoI和PstI酶切获得的PCR产物，连接到相同酶处理过的pP43、pPHAG、pPABRB和pPVALS上，构成新的质粒pP43-gfp、pPHAG-gfp、pPABRB-gfp和pPVALS-gfp。
(1)将10μL的浓度为100μg/mL的pP43-gfp、pPHAG-gfp、pPABRB-gfp和pPVALS-gfp质粒分别加入到500μL的Bacillus subtilis 168的感受态细胞中，45℃热激3min，37℃摇床220rpm后培养1h，涂布于含有卡纳抗生素的LB平板上，37℃培养10h，将长出的菌落进行菌落PCR验证。
(2)将上一步得到的四种菌进行培养，通过每2小时取样测定荧光强度和菌体浓度，结果现示，Bacillus subtilis 168(pPHAG-gfp)、Bacillus subtilis 168(pPABRB-gfp)和Bacillus subtilis168(pPVALS-gfp)的荧光强度在对数期内持续增加，进入稳定期后停止增加。而Bacillus subtilis 168(pP43-gfp)的荧光强度则持续增长，直到稳定结束。
实施例3利用枯草芽孢杆菌对数期表达系统表达角蛋白酶
(1)菌株构建：将来源于地衣芽孢杆菌(购自美国模式培养物集存库，编号ATCC 14580)的角蛋白酶基因(SEQ ID NO.17所示)以地衣芽孢杆菌基因组为模板，#9和#10为引物，PCR得到ker基因片段，前端添加有XhoI酶切位点和RBS，后端添加有PstI酶切位点。利用XhoI和PstI酶切获得的PCR产物，连接到相同酶处理过的pP43、pPHAG、pPABRB和pPVALS上，构成新的质粒pP43-ker、pPHAG-ker、pPABRB-ker和pPVALS-ker。
(2)酶活比较：将四株菌进行发酵培养，通过每2小时取样测定角蛋白酶酶活性和菌体浓度。结果现示，Bacillus subtilis 168(pPHAG-ker)、Bacillus subtilis 168(pPABRB-ker)和Bacillus subtilis 168(pPVALS-ker)在对数期结束时胞外酶活为357U、344U和322U，此时菌体浓度也明显高于对照菌株，进入稳定期后酶活没有增长。而Bacillus subtilis 168(pP43-ker)在对数期结束时胞外仅有105U，进入稳定期后酶活持续增高，最高有252个单位。采用枯草芽孢杆菌pPHAG、pPABRB和pPVALS对数期表达系统，菌体浓度较对照调高了15.2％、13.2％和10.4％，角蛋白酶酶活提高了41.5％、36.7％、27.8％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。