玉米转录因子ZmbHLH2及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及玉米转录因子ZmbHLH2基因及其应用。

背景技术：

玉米种植经常受到干旱的威胁，影响玉米光合和生理活性、籽粒形成和产量。鉴于玉米在粮食安全中的重要作用，从群体遗传改良、栽培措施和生理生化水平均对玉米抗旱进行了研究。在群体水平上，通过研究玉米自交系与干旱抗性密切的总根长度(TRL)和根表面积(TSA)，筛选出9个抗旱自交系。研究13个抗旱群体发现，抗旱玉米品种的棕榈酸和油酸存在显著的正相关。在栽培水平上，发现喷施氨基丁酸，减少侧根密度、增加萜类合成等均可提高玉米抗旱性。

分子生物学的发展，尤其玉米全基因组测序的完成为玉米抗旱遗传改良提供了有力支持。例如，转化微生物冷休克蛋白CspB基因可有效提高玉米品种MON87460在拔丝和抽穗期的抗旱性；过表达ZmARGOS1和ZmARGOS8基因通过降低对乙烯的敏感度提高拟南芥和玉米的抗旱性。在翻译后水平上，基因组选择性剪切也可以提高玉米抗旱性。

转录因子在植物抗旱性研究中因为具有可以同时调控多基因的优点而被广泛应用。CCAAT、homeodomain、bHLH、NAC、AP2/ERF、bZIP和WRKY等转录因子家族都具有调控抗旱的潜力。例如，玉米HD-Zip基因Zmhdz10正调控水稻和拟南芥对干旱和盐胁迫的抗性。NAC转录因子是玉米中抗旱的关键转录因子，有24个NAC转录因子可能与玉米抗旱性有关。玉米ZmbZIP72可以提高拟南芥对干旱和盐胁迫的抗性。因此，鉴定玉米转录因子家族成员的功能将有助于筛选玉米抗旱基因并为分子标记辅助育种提供帮助。

bHLH转录因子是植物体内第二大类转录因子，含有高度保守的bHLH结构域，大约包含60个氨基酸，一般由两个在功能上完全不同的区域组成：碱性区域和螺旋-环-螺旋结构域。N-端的碱性区域作为DNA结合域发挥作用，大约由15个氨基酸残基组成，其中包括约6个碱性氨基酸残基。它能与靶基因启动子区域中顺式作用元件E-box(5'-CANNTG-3')或G-box(5'-CACGTG-3')特异性结合。C端的螺旋-环-螺旋区域负责形成同源或者异源二聚体，bHLH家族成员主要以二聚体的形式来行使功能。根据bHLH结构域序列的相似性，可将来自拟南芥、杨树、水稻、苔藓和5个藻类基因组共638个bHLH基因分为32个亚族。在ABA信号途径研究中，发现bHLH转录因子AtMYC2和MYB转录因子AtMYB2是ABA信号的转录激活子，但在植物蓝光调控的光生长发育中则为抑制子。

随后发现，bHLH转录因子行驶功能可以分为ABA依赖和非ABA依赖两条路径。对植物bHLH家族成员的研究表明，第二亚组的bHLH转录因子功能与伤害、干旱、氧化胁迫、茉莉酸和脱落酸信号有关。已证明bHLH转录因子通常是与其他转录因子和蛋白结合调控植物生长发育、激素信号转导和逆境响应过程。玉米的R蛋白是植物中第一个被鉴定的bHLH转录因子，并与R2R3-MYB转录因子C1一起激活花青素合成基因的表达。BA1是玉米腋生分生组织形成所必需的bHLH转录因子。bHLH转录因子ZmPTF1调控玉米的碳代谢和根的生长，玉米中过表达ZmPTF1可提高植株对低磷胁迫的耐受性。bHLH类转录因子在植物对非生物胁迫应答中发挥重要作用，已证明bHLH参与烟草、胡杨等抗旱反应。但有关玉米bHLH转录因子在抗逆反应中的功能知之甚少。

技术实现要素：

本发明的目的是提供玉米转录因子ZmbHLH2基因及其编码蛋白。

本发明的另一目的是提供玉米转录因子ZmbHLH2基因在提高植物抗旱能力中的应用。

为了实现本发明目的，本发明从东北农业大学农学院培育的玉米品种东农255叶片中克隆获得玉米转录因子ZmbHLH2基因，ZmbHLH2基因的cDNA序列为：

i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

测序结果表明，玉米转录因子ZmbHLH2为bHLH家族转录因子，ZmbHLH2基因开放阅读框全长为2118bp，编码由7055个氨基酸组成的蛋白(SEQ ID NO.2)。通过对ZmbHLH2基因的生物信息学分析和受干旱等胁迫时的表达模式判断，该基因可能参与玉米等植物抗逆途径。

本发明还提供含有所述玉米转录因子ZmbHLH2基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体、工程菌或细胞。

携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2^nd Edition)。

本发明还提供所述玉米转录因子ZmbHLH2基因在提高植物(例如，拟南芥、玉米等)抗旱能力中的应用。

本发明还提供所述玉米转录因子ZmbHLH2基因在植物种质资源改良中的应用。

本发明还提供所述玉米转录因子ZmbHLH2基因在制备抗旱转基因植物中的应用。

本发明还提供一种转基因植株的构建方法，包括以下步骤：

(1)提取玉米叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第Ⅰ链；

(2)以DNA第Ⅰ链为模板，ZmbHLH2F和ZmbHLH2R为引物，通过PCR扩增反应获得转录因子ZmbHLH2基因的cDNA序列，并将其cDNA片段连接至pMD18-T载体中并转化大肠杆菌DH5α菌株中进行克隆和测序验证，测序验证正确的质粒命名为ZmbHLH2-18T；；

(3)以ZmbHLH2-18T质粒为模板，ZmbHLH2-ORF-F:5′-CGGAATTCATGAACCTGTGGACG-3′(下划线为EcoR I酶切位点)和ZmbHLH2-ORF-R:5′-CGGGATCCCCTGCCCATGGCAGA-3′(下划线为BamHI酶切位点)为引物，扩增ZmbHLH2基因的ORF，扩增产物经EcoR I和BamHI双酶切后连接至经相同酶切后的表达载体，利用电击法将带有ZmbHLH2基因ORF的质粒转化农杆菌GV3101菌株；

(4)利用转基因技术将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物，获得转基因稳定遗传植株。

其中，步骤(2)所述引物ZmbHLH2F和ZmbHLH2R的序列如下：

ZmbHLH2F：5′-ATCCGCATTCTGAACCATT-3′

ZmbHLH2R：5′-TGCCTATCGTGTTGTAACC-3′。

本发明进一步提供玉米转录因子ZmbHLH2基因的荧光定量PCR检测引物，引物序列如下：

ZmbHLH2-QF1：5′-GACGCCATCTCCTACATC-3′

ZmbHLH2-QR1：5′-GCTCTCCTCCTTGATTACC-3′。

分别检测玉米抗旱和不抗旱自交系中和在经过干旱、茉莉酸、脱落酸和过氧化氢处理后东农255玉米叶片ZmbHLH2基因的表达情况，结果表明，ZmbHLH2基因受干旱、茉莉酸、脱落酸和过氧化氢处理诱导表达。

本发明通过对ZmbHLH2基因转化拟南芥进行该基因的功能研究，验证了转基因拟南芥对干旱胁迫的耐受能力得到提高。该基因可用于玉米和其他作物的抗旱转基因研究中。本发明与玉米抗旱相关的转录因子基因ZmbHLH2来自玉米，不会产生基因漂移，对环境影响较小，为提高植物抗旱性提供新的基因资源。

附图说明

图1为本发明实施例1中ZmbHLH2转录因子保守区的氨基酸序列同源性比对结果。其他物种bHLH蛋白的序列分别为豌豆PsbHLH，蛋白号ADO13282.1[Pisum sativum]；马铃薯StbHLH,蛋白号CDJ79759.1[Solanum tuberosum]；拟南芥AtbHLH4，蛋白号O49687.1[Arabidopsis]；拟南芥AtbHLH5，蛋白号Q9FIP9.1[Arabidopsis]。

图2为本发明实施例2中利用荧光定量PCR检测抗旱自交系和非抗旱自交系的中ZmbHLH2的表达情况。其中抗旱自交系：郑58，吉853，齐319，旱21，X178，7922，掖52106和K12；旱敏感自交系：东91，东46，东26-6，东34，红玉米和PH4CV。

图3为东农255玉米叶片受干旱、茉莉酸、脱落酸和过氧化氢处理后，ZmbHLH2基因的表达情况。

图4为本发明实施例1中ZmbHLH2转基因拟南芥株系在土壤中的耐旱性明显提高。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

若未特别说明，本发明实施例所用的试剂、耗材、生物材料皆为通过商业途径可得。

实施例1玉米转录因子ZmbHLH2基因的克隆

利用RT-PCR技术从东北农业大学农学院培育的玉米品种东农255(该玉米品种已通过相关部门审定并推广种植)叶片中克隆获得玉米转录因子ZmbHLH2基因，具体方法如下：

1、提取玉米叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第Ⅰ链。

2、以DNA第Ⅰ链为模板，ZmbHLH2F和ZmbHLH2R为引物，通过PCR扩增反应获得转录因子ZmbHLH2基因的cDNA序列。

其中，步骤(2)所述引物ZmbHLH2F和ZmbHLH2R的序列如下：

ZmbHLH2F：5′-ATCCGCATTCTGAACCATT-3′

ZmbHLH2R：5′-TGCCTATCGTGTTGTAACC-3′。

使用2×Taq PCR MasterMix(天根生化)进行PCR扩增，反应体系为：cDNA模板2μL，引物ZmbHLH2F、ZmbHLH2R(10μmol/L)各1μL，2×PCR MasterMix 25μL，加ddH₂O至50μL。

PCR扩增程序为：94℃变性3min；94℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

3、扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，凝胶回收纯化，并克隆到pMD19-T载体上，经菌落PCR检测，送上海立菲生物技术有限公司测序验证。测序结果表明，玉米转录因子ZmbHLH2属于bHLH家族转录因子，ZmbHLH2基因(SEQ ID NO.1)开放阅读框全长为2118bp，编码由705个氨基酸组成的蛋白ZmbHLH2(SEQ ID NO.2)。ZmbHLH2转录因子保守区的氨基酸序列同源性比对结果见图1。

实施例2ZmbHLH2基因受干旱等胁迫时的表达分析

采用荧光定量PCR方法检测ZmbHLH2基因在不同抗旱自交系的表达模式。抗旱自交系，郑58，吉853，齐319，旱21，X178，7922，掖52106和K12；旱敏感自交系，东91，东46，东26-6，东34，红玉米和PH4CV(见图2)，其中ZmbHLH在抗旱自交系的表达显著高于在不抗旱自交系中的表达。

根据ZmbHLH2基因序列设计如下荧光定量PCR检测引物：

ZmbHLH2-QF1：5′-GACGCCATCTCCTACATC-3′

ZmbHLH2-QR1：5′-GCTCTCCTCCTTGATTACC-3′

ZmACTIN-F：5′-ACCTCACCGACCACCTAATG-3′

ZmACTIN-R：5′-GCAGTCTCCAGCTCCTGTTC-3′

以ZmACTIN(GenBank登录号：GRMZM2G126010)为内参基因。使用BioRad公司的CFX-96荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR，反应程序为：95℃预变性30s；94℃5s，60℃20s，72℃20s，进行45个循环。扩增结束后绘制熔解曲线，从50℃逐渐升温至95℃，升温速度0.2℃/s，全过程检测荧光信号。ZmbHLH2基因的表达量采用公式Qt＝2-Ct(ZmACTIN)-Ct(ZmbHLH2)计算，Ct表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

荧光定量PCR检测结果表明，3叶期东农255玉米幼苗受干旱(连续断水处理7天)、200μmol L^-1(w/v)茉莉酸、200μmol L^-1(w/v)脱落酸和2％(v/v)过氧化氢处理后，ZmbHLH2基因诱导表达(图3)。干旱处理一天后，转录因子ZmbHLH2的表达量与对照相比增加6.31倍，随后表达量尽管下降但在干旱3-7天的表达量分别为对照的3.09、4.13、3.66、1.79和2.84倍。茉莉酸处理后，在6和10h表达量最高，分别是对照的7.15和10.77倍。脱落酸处理在48h表达量最高，是对照的25.52倍。过氧化氢处理在6h和10h表达量最高，是对照的41.02好31.49倍。说明ZmbHLH2是干旱响应基因，受上述4种处理显著上调表达。

实施例3转ZmbHLH2基因拟南芥植株的获得及抗旱效果验证

提取玉米叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第Ⅰ链。以DNA第Ⅰ链为模板，ZmbHLH2F和ZmbHLH2R为引物，通过PCR扩增反应获得转录因子ZmbHLH2基因的cDNA序列，并将其cDNA片段连接至pMD18-T载体中并转化大肠杆菌DH5α菌株中进行克隆和测序验证，测序验证正确的质粒命名为ZmbHLH2-18T；以ZmbHLH2-18T质粒为模板，ZmbHLH2-ORF-F:5′-CGGAATTCATGAACCTGTGGACG-3′(下划线为EcoR I酶切位点)和ZmbHLH2-ORF-R:5′-CGGGATCCCCTGCCCATGGCAGA-3′(下划线为BamHI酶切位点)为引物，扩增ZmbHLH2基因的ORF，扩增产物经EcoR I和BamHI双酶切后连接至经相同酶切后的表达载体，利用电击法将带有ZmbHLH2基因ORF的质粒转化农杆菌GV3101菌株。本发明利用电击法将构建好的ZmbHLH2转化载体导入根癌农杆菌GV3101中，通过农杆菌介导法将ZmbHLH2基因转化到野生型拟南芥植株(col)中，对目标植物转基因阳性苗进行鉴定，对目标植物转基因T3代阳性纯合植株进行筛选及抗逆分析，见图4，结果表明转ZmbHLH2基因拟南芥对干旱胁迫的耐受能力得到提高，为ZmbHLH2基因在其他植物上的应用提供良好的基础。该抗旱基因ZmbHLH2来自玉米，不会产生基因漂移，对环境影响较小。

干旱断水7天后的表型，与野生型(col)拟南芥植株相比，ZmbHLH2转基因株系在土壤中的耐旱性明显提高(图4)。野生型拟南芥在经干旱处理全部死亡，存活率明显低于转基因材料。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。