胶原特异结合能力的EGFR抗体及在脊髓损伤修复中的应用的制作方法

本申请具体涉及一种具有胶原特异结合能力的egfr抗体，特别涉及一种胶原特异结合能力的egfr抗体修饰形成的功能化胶原材料、其制备方法及在脊髓损伤修复中的应用。

背景技术：

由于不可逆的神经元丢失以及胶质瘢痕的沉积，脊髓损伤最终将导致永久性的神经机能障碍。脊髓神经干细胞向神经元的分化是补充损伤丢失神经元以及功能恢复的有效策略。然而，脊髓损伤微环境中存在的许多髓鞘相关的抑制分子限制了神经干细胞分化为神经元的能力。脊髓损伤后，一系列复杂的病理生理学过程发生，其中包括机髓鞘相关抑制分子的产生和胶质瘢痕的沉积等。研究表明，脊髓损伤后，炎症性和抑制性微环境的产生是造成神经元分化比率低下的主要原因，并最终导致了行为功能恢复的失败。因此，如何重建脊髓损伤后神经再生的微环境是保证有效神经发生乃至行为功能恢复的关键。

损伤微环境中神经再生抑制分子与各自受体结合，能引发胞内钙离子浓度的提高，激活表皮生长因子受体(egfr)，使egfr磷酸化，导致神经不能再生。神经损伤后，egfr的活化是导致神经不能再生的原因。去除神经再生抑制分子的抑制作用，可以通过封闭egfr实现，使egfr不能被活化，从而使神经再生抑制分子的信号通路被阻断。西妥昔是egfr的中和抗体，可用来封闭egfr，使其不能被激活。研究表明，西妥昔可以促进神经干细胞向神经元的分化，进而提高脊髓损伤的修复效果。但是简单注射的西妥昔单抗往往不能聚集于损伤部位，而是伴随着体液扩散流失，不仅不能在损伤部位发挥最大作用，如果扩散到正常组织还会引起副作用。

技术实现要素：

本申请的主要目的在于提供一种具有胶原特异结合能力的egfr抗体修饰的胶原材料及其在脊髓损伤修复中的应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本申请采用的技术方案包括：

本申请实施例提供了一种具有胶原特异结合能力的egfr抗体(如下简称“cbd-fab抗体”)，其包含胶原结合区域和与所述胶原结合区连接的西妥昔单抗的功能区域fab段。

进一步的，所述的具有胶原特异结合能力的egfr抗体主要由胶原特异结合多肽cbd与西妥昔单抗的fab功能区融合形成。

本申请实施例还提供了用于编码所述具有胶原特异结合能力的egfr抗体的基因。

进一步的，所述的基因具有seqidno:1(轻链区)和seqidno:2(重链区)所示的核酸序列。

本申请实施例还提供了一种含有所述基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

本申请实施例还提供了所述具有胶原特异结合能力的egfr抗体于制备产品中的应用，所述产品至少具有抑制脊髓鞘相关抑制分子产生和胶质瘢痕沉积的功能。

本申请实施例还提供了所述具有胶原特异结合能力的egfr抗体于制备产品中的应用，所述产品至少具有促进神经干细胞向神经元分化的功能。

本申请实施例还提供了所述具有胶原特异结合能力的egfr抗体于制备产品中的应用，所述产品至少具有修复脊髓损伤的功能。

本申请实施例还提供了一种功能化胶原材料，其包含：胶原材料；以及，修饰在所述胶原材料上的、所述具有胶原特异结合能力的egfr抗体。

进一步的，所述具有胶原特异结合能力的egfr抗体的胶原结合区域与胶原材料结合。

前述胶原材料可优选自有序胶原材料，例如细丝状的线性有序胶原材料，其良好的生物相容性可以支持细胞粘附生长，有序的结构可以定向引导神经丝的延伸，并且可以通过占据损伤横截组织的腾空而在一定程度上抑制瘢痕的沉积。

本申请实施例还提供了所述的具有胶原特异结合能力的egfr抗体或者所述的功能化胶原材料于制备用于引导神经再生的生物材料中的用途。

较之现有技术，本申请提供的cbd-fab抗体具有良好的促进神经干细胞向神经元分化的能力，且cbd-fab抗体可以与胶原材料高效结合而形成功能化胶原材料，这种功能化胶原材料既能抑制瘢痕的形成，又能封闭神经再生抑制分子的抑制作用，并且cbd-fab抗体能从胶原材料上缓慢释放，进而可以创造合适的微环境以诱导内源神经干细胞向神经元分化，并促使其进一步的成熟及功能化，最终促进了生物行为功能的恢复。

附图说明

图1a是本申请实施例中一种cbd-fab抗体的重组结构示意图；

图1b是本申请实施例中一种胶原材料的线性结构示意图；

图1c是本申请实施例中一种cbd-fab抗体和nat-fab抗体的胶原结合能力比较图；

图1d是本申请实施例中一种cbd-fab抗体和nat-fab抗体从胶原上缓慢释放能力的比较图；

图2a是本申请实施例中以荧光显微镜检测cbd-fab抗体和nat-fab抗体封闭神经再生抑制分子的抑制能力的比较图；

图2b是本申请实施例中cbd-fab抗体和nat-fab抗体封闭神经再生抑制分子的抑制能力的定量分析图；

图3a是本申请实施例中nestin,tuj-1和neun免疫染色评价cbd-fab抗体修饰的胶原材料对内源神经分化的影响图；

图3b是本申请实施例中nestin免疫染色评价脊髓损伤区内神经细胞的定量分析图；

图3c是本申请实施例中tuj-1免疫染色评价脊髓损伤区内早期神经元的定量分析图；

图3d是本申请实施例中neun免疫染色评价脊髓损伤区内成熟神经元的定量分析图；

图4a是本申请实施例中syn免疫染色检测突触位点形成情况图；

图4b是本申请实施例中syn免疫染色检测突触位点形成情况的定量分析图；

图4c是本申请实施例中透射电镜检测神经突髓鞘化情况图；

图4d是本申请实施例中透射电镜检测神经突髓鞘化情况的定量分析图；

图5a是本申请实施例中h&e组织染色评价cbd-fab修饰的胶原材料对空腔形成的影响的检测图；

图5b是本申请实施例中h&e组织染色评价cbd-fab修饰的胶原材料对空腔形成的影响的定量分析图；

图5c是本申请实施例中cspg免疫染色评价cbd-fab修饰的胶原材料对瘢痕形成的影响的检测图；

图5d是本申请实施例中cspg免疫染色评价cbd-fab修饰的胶原材料对瘢痕形成的影响的定量分析图；

图6a是本申请实施例中电生理学检测大鼠脊髓全横断损伤模型制备是否成功的检测图；

图6b是本申请实施例中bbb行为学评分检测大鼠脊髓损伤后0至12周的下肢行为恢复情况图；

图6c是本申请实施例中电生理学检测大鼠脊髓损伤后第12周的运动诱发电位恢复情况图；

图6d是本申请实施例中bbb行为学评分检测大鼠脊髓损伤后第12周的下肢行为恢复情况图。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本申请发明经长期研究和大量实践，通过采用了由胶原结合区域(collagenbindingdomain，cbd)和西妥昔单抗的功能区域fab段重组构建了具有胶原结合能力的egfr抗体(cbd-fab抗体)。此种cbd-fab抗体能特异结合到胶原材料上，使胶原材料作为携带西妥昔单抗的载体，具备促进神经干细胞向神经元分化的能力。

本申请的发明人还进行了大量试验，包括：将cbd-fab生物结合到胶原材料上形成了具有特异胶原结合能力的egfr抗体修饰的胶原材料，实验证明，它既能抑制瘢痕的形成，又能封闭神经再生抑制分子的抑制作用。另外，通过体外和体内试验证明，cbd-fab抗体可以与胶原材料高效结合，并能从胶原材料上缓慢释放下来。又及，经cbd-fab修饰的胶原材料可以创造一个合适的微环境以诱导内源神经干细胞向神经元分化，并促使其进一步的成熟及功能化，最终提高了行为功能的恢复。此外，还检验了cbd-fab抗体促进神经干细胞向神经元分化的能力。

以下结合附图及典型实施案例对本申请的技术方案作进一步的详细说明。

1、cbd-fab在酵母表达系统中的高效表达和纯化

cbd-fab表达载体的构建

cbd-fab抗体的vl、cl，vh和ch1链委托苏州金维智生物科技有限公司全基因合成。然后，利用overlappcr将cbd(tkktlrt)、vl+cl和vh+ch1拼接成cbd-fab-l和fab-h两条链，顺序如下：l(轻链):xhoi+cbd+linker+vl+cl+noti；h(重链):ecori+vh+ch1+noti(请分别参阅序列表中的seqidno:1及seqidno:2)。

其中，cbd-fab-l(l:xhoi+cbd+linker+vl+cl+noti)序列如下(seqidno:1)：ctcgagaaaagaaccaagaagaccttacgcacaagcggtggcggtggcagcggcggcggcggcagtggtggtggcggtgatatcttactgacacagagcccggtgatcctgagcgttagtcctggtgagcgcgtgagcttcagctgccgtgccagccagagcatcggcaccaacatccactggtaccaacagcgcacaaacggcagtccgcgcctgctgatcaagtatgcaagcgagagcatcagcggcatcccgagccgttttagcggtagcggcagcggcaccgactttaccctgagcatcaacagcgtggagagcgaggacatcgccgactactactgccagcagaacaataactggccgaccaccttcggtgcgggcaccaaactggagctgaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgtgcggccgc。

其中，fab-h(h:ecori+vh+ch1+noti)序列如下(seqidno:2)：

gaattccaggtgcagctgaaacagagcggtccgggtctggtgcagccgagtcagagtctgagcatcacctgcaccgttagcggcttcagcctgaccaactatggtgtgcactgggttcgccagagtcctggcaaaggcctggagtggctgggcgttatctggagcggcggtaacaccgactacaacaccccgttcaccagccgcctgagtatcaacaaggacaacagcaaaagtcaagtgtttttcaagatgaacagcctgcagagcaacgacaccgcaatctactattgtgcccgcgcactgacctactacgactacgagttcgcctactggggtcagggtacactggtgaccgtgagtgcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacgcggccgc。

通过双酶切将cbd-fab-l和fab-h分别插入ppiczα-b(invitrogen)和ppic9k(invitrogen)两个质粒中，连接产物转化大肠杆菌(dh5α)，涂布lb平板，菌落pcr筛选阳性克隆，ppiczα-b-cbd-fab-l和ppic9k-fab-h通过测序确认克隆正确，鉴定正确的质粒，抽提质粒备用(图1a-图1b)。

cbd-fab表达载体的转化、鉴定和筛选

按照invitrogen的操作手册(invitrogen，catalogno.v175–20)中的电转化操作方法，准备对数期生长的酵母菌gs115，将10μgppiczα-b-cbdfab-l和ppic9k-fab-h分别采用sali和bstxi进行线性化(图1a-图1b)，使用电转化的方法(bio-rad,usa)，通过分步转化的方法，将线性化的ppiczα-b-cbd-fab-l和ppic9k-fab-h采用分步整合的方法转化到酵母菌基因中，将转化液涂布于ypds琼脂平板上(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，1m山梨醇，2％琼脂，100μg/mlzeocin，1-4mg/mlg418)，涂布的平板在30℃培养1-2周，待平板上形成可见的克隆时，对平板上的菌落编号，使用针对l和h基因片段的特异引物鉴定l和h是否都整合到了酵母菌基因组中，其中：

l的特异性引物为：

f(seqidno:3)：ctcgagaaaagaaccaagaagaccttacg，

r(seqidno:4)：gcggccgcacactctcccctgttgaagctc。

h的特异性引物为：

f(seqidno:5)：gaattccaggtgcagctgaaacagagcgg，

r(seqidno:6)：gcggccgcgtgagttttgtcacaag。

pcr鉴定阳性菌落，挑取单菌落到ypd液体培养基中，30℃、250rpm培养36-48小时，od600在10左右时，加入终浓度为15％甘油，-80℃保存菌种。在含有zeocin和g418抗生素的ypds平板上正常生长，并通过pcr鉴定确定阳性的菌落标记为:mut+。ppiczα-b和ppic9k空质粒采用相同方法线性化，转化入酵母菌作为阴性对照。

cbd-fab抗体在酵母菌中表达和纯化

挑取标记为mut+的单菌落，置于装有50mlbmgy(1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mm磷酸缓冲液ph6.0，1.34％酵母无氮源培养基，4×10^-5％生物素，1％甘油)的500ml的摇瓶中，于28-30℃、250-300rpm培养至od600＝2-6(约培养16-18h)；室温下1500g离心5min，收集菌体，使用bmmy(bmgy添加0.5％甲醇代替甘油)重悬菌体，使od600＝1.0左右(约100-200ml)；将所得的菌液置于1l的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30℃、250-300rpm的摇床上继续培养，每24h向培养基中添加无水甲醇至终浓度0.5％。每24h取样1ml置于1.5mlep管中，8000g高速离心2～3min，分别收集诱导菌液的上清和菌体，sds-page电泳确定目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。确定表达量较高的菌种-80℃保存菌种，采用上述方法大量表达，表达后菌液8000g、4℃高速离心20min，收集的菌液上清0.22μm滤膜过滤后，用分子量10kdamilliporepellicon超滤膜浓缩到合适体积，将菌液上清透析到20mm磷酸钠缓冲液(ph＝8.0)和0.5mnacl中，通过aktaprimeplus5.0系统利用镍柱亲和柱(his-trapaffinitycolumns，ge)对目的蛋白进行纯化。使用sds-page电泳对纯化后的的抗体进行纯度分析，蛋白浓缩后0.22μm滤膜除菌，分装冻存到-80℃，使用bca试剂盒(碧云天)对纯化后的抗体测定浓度，图2b中制备的抗体纯度均在90％以上。同时采用同样方法制备不含有cbd的fab片段标记为nat-fab。

2、cbd-fab抗体可以与胶原材料高效结合

cbd-fab抗体与胶原材料结合能力的检测

首先，将长度约4mm，直径约2mm的胶原纤维加入到96孔板中，胎牛血清室温封闭2h。将nat-fab(naturalfab)和cbd-fab按照0μm到10μm的浓度梯度每孔加入200μl,37℃孵育2h，然后吸去多余蛋白，使用预冷的pbs洗涤3次洗去没有结合的蛋白。加入anti-polyhistidine抗体(1:1000,sigma)200μl，4℃孵育2h，pbs洗3次，之后加入anti-mouse-hrp(1:10,000,sigma)37℃避光孵育30min，pbs洗3次，加入100μltmb室温反应30min，最后加入1mh2so4终止反应。使用分光光度计检测405nm处吸光度。数据分析表明，cbd-fab的胶原结合能力强于nat-fab，cbd-fab具有特异的胶原结合能力(图1c)。

cbd-fab抗体从胶原材料上缓慢释放能力的检测

先将长4mm，直径2mm的胶原纤维加入到48孔板中，然后用20μl的pbs溶解5μg的cbd-fab或nat-fab，分别加入到孔板中干的胶原材料上，室温孵育30min后，胶原材料被用于释放测试。胶原材料被浸在500μlpbs中，并在37℃、80rpm的条件下孵育。每12h更换48孔板中的pbs，并在每个时间点收集样品，使用elisa方法分析留在原材料上的蛋白样品。结果表明，相对于nat-fab，cbd-fab可以缓慢的从胶原材料上释放下来，达到了一个控制释放的效果(图1d)。

3、cbd-fab抗体在细胞水平上的活性和功能鉴定

cbd-fab抗体可促进神经干细胞向神经元分化

分离新生sd大鼠的端脑，剪碎，加入0.25％的胰酶37℃消化40min。血清终止消化，500g离心5min。含20ng/mlbfgf(peprotechasia,rehovort,israel),20ng/mlegf(peprotechasia),2％b27(invitrogen,gibco,ny,usa)的dmem/f12培养基重悬细胞，然后培养于25cm²培养瓶中。7天后，神经球被消化成单细胞用于后续的实验。神经干细胞重悬于含10％血清的贴壁培养基中，7×10⁴个细胞/孔种植在48孔板中。1天后，去除贴壁培养基，更换为含有髓鞘蛋白的分化培养基。加入nat-fab或cbd-fab以挽救神经干细胞的分化。4天之后，进行免疫荧光染色以评价神经干细胞向神经元分化的情况。结果显示，nat-fab和cbd-fab都可以提高神经干细胞向神经元分化的比例而降低向胶质细胞分化的比例，两者之间没有显著性差异(图2a-图2b)。一方面说明了西妥昔单抗的fab段具有全长抗体相似的生物学活性，另一方面说明了cbd-fab融合表达后，cbd结构不但没有影响fab活性的表达而且使其具备特异的胶原结合能力。

4、cbd-fab抗体修饰的胶原材料在大鼠脊髓全横断动物模型中的治疗效果评价

大鼠脊髓全横断动物模型的建立

sd大鼠购自维通利华实验动物技术有限公司，所有动物均使用雌性大鼠，体重200-220g，提前一周订购，控湿控温控照明的饲养条件下适应一周。所有动物均使用腹腔注射水合氯醛(0.5g/kg)的方式麻醉，背部刮毛，用碘伏消毒皮肤，手术刀开约2cm的切口，暴露胸椎t7-t9，咬骨钳撬掉t8椎板，暴露脊髓，完全横截约3-4mm的脊髓以造成完全横断创伤。损伤后立即开始分组治疗，不移植、单独移植胶原材料或移植经cbd-fab修饰的胶原材料。

cbd-fab抗体修饰的胶原材料促进神经发生的治疗评价

在脊髓损伤动物接受治疗后的第12周进行取材，固定包含损伤节段的脊髓组织，冰冻切片，染色以观察损伤区神经发生的情况。试验结果显示，cbd-fab修饰的胶原材料治疗组有更多的神经元产生，且在数量上呈现出cbd-fab剂量依赖的方式(图3a-图3d)，这些新生神经元也产生了功能突触连接、髓鞘化等功能化情况(图4a-图4d)。试验结果表明，cbd-fab修饰的胶原材料确实发挥了改善损伤微环境以促进神经发生的作用。使用胶原材料递送cbd-fab到损伤部位，并使其缓慢释放下来，有效的促进了内源神经的发生。

cbd-fab抗体修饰的胶原材料抑制瘢痕形成的治疗评价

取各治疗组脊髓纵切冰冻切片进行he染色，全景扫描以观察损伤区及两侧退化空洞大小，视对照组平均空洞面积为100％，其他各组空洞大小以相对于对照组的相对空洞面积表示。试验结果显示，对照组损伤区出现大面积的损伤空洞，而材料组损伤区空洞较小，经适量cbd-fab修饰的胶原材料组的损伤区空洞更小。说明了适量cbd-fab修饰的胶原材料更好的改善了损伤微环境，减少了组织的空洞化(图5a-图5b)。为分析各组损伤区内瘢痕化的情况，对各治疗组的纵切片进行了免疫荧光染色，使用cspg(1:500，mouse，abcam)作为一抗，评价胶原材料及cbd-fab抗体对胶质瘢痕的抑制效果。同样视对照组cspg⁺染色面积为100％，其他各组为相对面积。试验结果显示，对照组损伤区内含有大量的cspg⁺的胶质瘢痕，而材料组损伤区内的胶质瘢痕极显著少于对照组，cbd-fab修饰的胶原材料组的瘢痕化程度相对于材料组也有减少(图5c-图5d)。说明了胶原材料与cbd-fab可以协同抑制胶质瘢痕。

cbd-fab抗体修饰的胶原材料在脊髓损伤动物模型中功能恢复的评价

在大鼠接受脊髓损伤治疗手术后的第1-12周，分别对每只动物进行行为学检查。行为评分标准参考文献报道，采用bbb评分等级法进行，分为0-21级，共22级。21分为正常功能，0分为功能完全丧失。bbb评分采用单盲检测法，观察动物在空地上的下肢自主运动行为，观察时间为5分钟。试验结果显示，在12周的观察期内，对照组动物展现出非常有限的下肢自主运动，取材前评分仅达到4分，然而，功能胶原材料组动物表现出持续的行为恢复(图6b)，取材前，三个剂量的cbd-fab修饰的胶原材料组的行为学恢复都显著好于材料组和对照组(图6d)。另外，取材前分别对每只动物的运动诱发电位进行了检测，其结果与bbb评分结果相一致(图6c)。试验结果表明，cbd-fab修饰的胶原材料促进了大鼠脊髓损伤后的功能恢复，与上述神经发生和瘢痕形成情况相呼应。

综合分析以上结果，可以看到，本申请发明人成功构建了一种cbd-fab抗体，其可以与胶原材料高效结合，形成具有封闭神经再生抑制分子抑制作用的功能化胶原材料，而且可在细胞水平上促进神经干细胞向神经元的分化。进一步的动物试验结果表明，脊髓损伤后，该种cbd-fab抗体修饰的胶原材料一方面可促进内源神经发生，另一方面可抑制损伤区内胶质瘢痕的形成，利用这种具有双功能的胶原材料实现了大鼠脊髓损伤后行为功能的恢复。

应当理解，上述实施例仅为说明本申请的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本申请的内容并据以实施，并不能以此限制本申请的保护范围。凡根据本申请精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本申请的保护范围之内。