本发明涉及医药领域，特别是一种两亲性聚合物的制备方法及其应用。
背景技术：
目前，载体给药系统，例如脂质体、纳米粒和聚合物胶束等作为一种新型的给药系统已经在临床上取得了可喜的进展。作为载体给药系统的一员，从两亲性共聚物发展而来的聚合物胶束，近十年来深受青睐。它既可以作为很多难溶性药物的微储库，又能避免药物在生物体内环境中失活。载药胶束是热力学、动力学稳定的体系，具有稳定、长效、安全等许多优良的性质，使得聚合物胶束成为难溶性药物理想的输送系统，且在药物释放、基因载体和诊断制剂等很多方面得到广泛地应用。
一些水溶性较差的药物，做成制剂尤其是注射剂，需要加入大量的有机溶剂助溶，使用时疼痛感强烈，不良反应较多，出现红肿、红斑、过敏、痉痒等现象，或者做成混悬乳剂，其制剂质量稳定性差，生物利用度较低。
因此，一种既能对难溶性药物有效增溶，提高疗效，又能延长药物在体内循环时间，提高药物活性，降低突释效应，增加生物利用度并且毒性小的药物载体是目前在本技术领域急待解决的一项课题。
聚乙稀基吡咯烷酮(PVP)具有优异的溶解性、低毒性、成膜性、化学稳定性、生理惰性、粘接能力等特点广泛用于医药卫生、化妆品、食品等领域。格尔伯特醇具有很多特殊性质，它的两个烷基基团均为100%直链烷基，产品呈网状结构，从而使它具有了低粘度、良好的生物降解能力、低色泽和优异的热稳定性等特殊性能。格尔伯特醇因具有很多独特的性质而被广泛应用于制药、化妆品等领域。
技术实现要素：
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种两亲性聚合物的制备方法及其应用，可有效解决难溶性药物吸收差，疗效差，质量稳定性差，生物利用度较低，使用时疼痛感强烈，不良反应较多的问题。
本发明的技术方案为：一种两亲性聚合物由N-乙烯基吡咯烷酮单体和马来酸格尔伯特二十烷醇单酯连接构成，结构式为：
；
其中x为N-乙烯基吡咯烷酮单体的质量数，y为马来酸格尔伯特二十烷醇单酯的质量数， x和y的质量比为x：y=70~99：1~30；
其制备方法为由马来酸酐和2-辛基-十二烷格尔伯特醇酯化生成马来酸格尔伯特醇二十烷单酯，以过氧月桂酰为引发剂，以N-乙烯基吡咯烷酮和马来酸格尔伯特二十烷醇单酯为单体，在正庚烷中进行自由基聚合反应，即得两亲性聚合物；具体制备方法为：
（1）将马来酸酐和2-辛基-十二烷格尔伯特醇按照摩尔量比1~1.2：0.8～1混合，60～80℃下磁力搅拌，反应5～7小时，将产物在-20~0℃下冷冻，凝固后，用甲醇和水按照体积比2~4：6～8混合的混合液50-250ml，冲洗反应产物，除去过量的未反应马来酸酐，干燥，得马来酸格尔伯特二十烷醇单酯；
（2）取0.02～0.2g引发剂过氧月桂酰，N-乙烯基吡咯烷酮7~9g和步骤（1）所得马来酸格尔伯特二十烷醇单酯1~3g，加入正庚烷150～250ml，在氮气保护70～90℃下，机械搅拌，得白色沉淀；
（3）将步骤（2）所得白色沉淀用40～70℃的正庚烷50~250ml冲洗3～5次，抽滤，室温下干燥24-72小时，得两亲性聚合物。
所述方法制备的两亲性聚合物在制备胶束制剂中的应用，所述的胶束制剂包括作为载体的两亲性聚合物和抗肿瘤药物疏水性长春西汀或紫杉醇；所述两亲性聚合物包载长春西汀的载药量为2.01%～9.34%；所述两亲性聚合物包载紫杉醇的载药量为1.12%～8.26%。
两亲性聚合物的胶束的制备方法可以是溶剂挥发复溶法和透析法。
采用溶剂挥发复溶法制备胶束，包括以下步骤：将两亲性聚合物和抗肿瘤药物按照质量比50~200：1溶于10~30ml有机溶剂中，室温下，转速100～600r/min磁力搅拌，直到溶剂挥干；再加入水30～100ml并超声；8000～12000r/min离心取上清，过滤膜除去未被包覆的药物，得两亲性聚合物的胶束制剂； 所述有机溶剂为乙醇，三氯甲烷或乙腈中的任一种。
采用透析法制备胶束，包括以下步骤： 将两亲性聚合物和抗肿瘤药物按照质量比50~200：1溶于8~25ml有机溶剂中，置于1000Da的透析袋中，用500~1500ml纯水透析4~8天；过滤膜除去未包裹药物，冷冻干燥得两亲性聚合物的胶束制剂；所述有机溶剂为乙醇，二甲基亚砜或甲醇中的任一种。如果载的药为长春西汀，则有机溶剂是乙醇，用量为5~20ml。如果载的药为紫杉醇，则有机溶剂是甲醇，用量为8~25ml。
本发明通过格尔伯特醇与马来酸酐的酯化产物再与N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）聚合，得到了一种NVP为亲水链马来酸格尔伯特醇酯为疏水链的两亲性聚合物，这种两亲性聚合物综合了NVP及格尔伯特醇的特点，以两亲性聚合物为载体材料，将难溶性药物包埋于聚合物胶束内，制成难溶性载药胶束注射剂，有很好的肿瘤抑制作用，且毒性低，可增强难溶性药物的水溶性，改善药物的生物利用度，降低药物毒副作用。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，是由以下实施例实现。
实施例1
本发明两亲性聚合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将马来酸酐8.4g和2-辛基-十二烷格尔伯特醇30ml混合，60℃下磁力搅拌，反应5小时后将产物在-20℃下冷冻，凝固后，用甲醇和水按照体积比4：6混合的混合液50ml，冲洗反应产物，除去过量的未反应马来酸酐，干燥，得马来酸格尔伯特二十烷醇单酯；
（2）取0.1g引发剂过氧月桂酰，N-乙烯基吡咯烷酮9g和步骤（1）所得马来酸格尔伯特二十烷醇单酯1g，加入正庚烷150ml，在氮气保护70℃下，机械搅拌，得白色沉淀；
（3）将步骤（2）所得白色沉淀用40℃的正庚烷150ml冲洗5次，抽滤，室温下干燥48小时，得两亲性聚合物。
实施例2
本发明两亲性聚合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将马来酸酐5.6g和2-辛基-十二烷格尔伯特醇20ml混合，80℃下磁力搅拌，反应7小时后将产物在-10℃下冷冻，凝固后，用甲醇和水按照体积比2：8混合的混合液150ml，冲洗反应产物，除去过量的未反应马来酸酐，干燥，得马来酸格尔伯特二十烷醇单酯；
（2）取0.02g引发剂过氧月桂酰，N-乙烯基吡咯烷酮7g和步骤（1）所得马来酸格尔伯特二十烷醇单酯3g，加入正庚烷250ml，在氮气保护90℃下，机械搅拌，得白色沉淀；
（3）将步骤（2）所得白色沉淀用60℃的正庚烷50ml冲洗3次，抽滤，室温下干燥24小时，得两亲性聚合物。
实施例3
本发明两亲性聚合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将马来酸酐15g和2-辛基-十二烷格尔伯特醇60ml混合，70℃下磁力搅拌，反应6小时后将产物在0℃下冷冻，凝固后，用甲醇和水按照体积比2：8混合的混合液250ml，冲洗反应产物，除去过量的未反应马来酸酐，干燥，得马来酸格尔伯特二十烷醇单酯；
（2）取0.2g引发剂过氧月桂酰，N-乙烯基吡咯烷酮8g和步骤（1）所得马来酸格尔伯特二十烷醇单酯2g，加入正庚烷170ml，在氮气保护80℃下，机械搅拌，得白色沉淀；
（3）将步骤（2）所得白色沉淀用70℃的正庚烷250ml冲洗4次，抽滤，室温下干燥36小时，得两亲性聚合物。
实施例4
紫杉醇载药胶束的制备
将两亲性聚合物100mg，紫杉醇1mg溶于10ml乙醇中，置于1000Da的透析袋中，用1000ml水透析，第一天换水6次，之后每天换水3次，透析6天，过0.22μm滤膜除去未包裹药物，冷冻干燥得两亲性聚合物的胶束制剂。
实施例5
长春西汀载药胶束的制备
将两亲性聚合物500mg，长春西汀20mg溶于20ml甲醇，置于1000Da的透析袋中，用1000ml水透析，第一天换水6次，之后每天换水3次，透析8天，过0.22μm滤膜除去未包裹药物，冷冻干燥得两亲性聚合物的胶束制剂。
本发明经多次反复试验，均取得了相同的试验效果，相关试验资料如下：
实验一 临界胶束浓度
本发明采用芘荧光探针法测定聚合物的临界胶束浓度。较低的聚合物胶束浓度意味着聚合物能够在较低的浓度下形成聚合物胶束，这有利于药物载体在较低浓度情况下稳定存在，比如在人体环境中。本发明制备的临界胶束浓度约为4.43×10-3mg/ml。完全能够达到体内长循环释药的效果。
实验二 共聚物胶束的灌胃急性毒性实验
选用昆明小白鼠7-9周龄，体重18～22g,40只，雌雄各半，随机分为共聚物胶束组和空白对照组。禁食不禁水过夜，用最大给药量法，按共聚物最大浓度640mg/ml，最大容积0.4ml/10g,一天给药2次，给药间隔8h,空白对照组同时按等容量给予纯净水。观察两组小鼠的体重，饮食，外观体征，行为活动，精神状态，分泌物排泄物，死亡情况及中毒反应等，常规饲养14天并观察。
14天观察期内，共聚物胶束的灌胃急性毒性试验中，给药组和空白组小鼠均未出现异常反应，小鼠饮食，外观体征，行为活动，精神状态良好，大，小便如常。实验结束时对动物大体解剖。肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑、胃肠道等主要器官，给药组和对照组均正常，未发现有出血点、水肿等病变。
数据统计用SPSS16.0软件，体重组间比较采用t检验。灌胃急性毒性试验的P=0.901＞0.05表明两配对样本无显著性差异，说明小鼠在口服给予共聚物水溶液后，对小鼠体重无明显影响，与空白组比较无显著差异。
实验三 共聚物胶束的尾静脉急性毒性实验
实验动物及分组同灌胃急毒实验。给药前禁食不进水6～12h，24h内注射两次（间隔6～8h），一次1ml/只（0.64g/ml）。空白对照组同时按等容量给予生理盐水。观察两组小鼠的体重变化，饮食，外观体征，行为活动，精神状态，分泌物和排泄物，死亡情况及中毒反应等，常规饲养14天并观察。
14天观察期内，共聚物胶束的尾静脉急性毒性试验中，给药组和空白组小鼠均未出现异常反应，小鼠饮食，外观体征，行为活动，精神状态良好，大，小便如常。实验结束时对动物大体解剖。肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑、胃肠道等主要器官，给药组和对照组均正常，未发现有出血点、水肿等病变。
数据统计用SPSS16.0软件，体重组间比较采用t检验。尾静脉注射急性毒性试验的P=0.145＞0.05表明两配对样本无显著性差异，说明小鼠在尾静脉注射共聚物的生理盐水溶液后，对小鼠体重也无明显影响，与空白组比较无显著差异。
实验四 紫杉醇载药胶束对乳腺癌细胞的抑制率
MTT法测定紫杉醇载药胶束对乳腺癌细胞的抑制率，收集处于对数生长期的乳腺癌细胞（MCF-7)，将细胞接种于96孔板中用不含双抗但含10%胎牛血清的RBMI-1640的完全培养基稀释细胞，每孔总体积为100μL,约含5×103个细胞铺板于三个96孔板中，实验分为空白胶束组、载药胶束组和游离紫杉醇为阳性对照组，待细胞融合度为50%-70%时进行转染，分为6个浓度梯度，每组6个复孔；将转染后的混合物培育5-6 h后，更换成完全培养基，于5%CO2，37℃培养箱中继续培养；培养24 h后，每孔加入20μL的MTT（5 mg/mL），继续培养4 h，使MTT还原为甲臜，吸出上清后，每孔加150 μL二甲基亚砜（DMSO），用酶联免疫检测仪震荡数次，使甲臜充分溶解，测定490 nm处的吸光度（OD值），同法测定48h后的OD值。抑制率%=1-(实验组平均OD值-调零组平均OD值)/(空白组平均OD值-调零组平均OD值）×100%。
由实验结果可以看出空白胶束对MCF-7细胞没有明显的毒性作用。在最高浓度（640mg/ml）下，MCF-7细胞在经过48小时培养后抑制率仍小于10%，表明该聚合物具有良好的生物相容性，毒性很低。由于紫杉醇从胶束中释放需要一定时间，MCF-7细胞培养24小时后的载药胶束组的抑制率只是略微高于阳性对照组，进一步培养到48小时，紫杉醇进一步从胶束中释放出来，载药胶束组的抑制率与24小时相比明显增强，与阳性对照组相比抑制率显著提高。这些结果表明聚合物可以提高紫杉醇的抗癌活性和生物利用度，因此对于同等的治疗效果所需的紫杉醇剂量也更少。
本发明通过格尔伯特醇与马来酸酐的酯化产物再与N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）聚合，得到了一种NVP为亲水链马来酸格尔伯特醇酯为疏水链的两亲性聚合物，这种两亲性聚合物综合了NVP及格尔伯特醇的特点，以两亲性聚合物为载体材料，将难溶性药物包埋于聚合物胶束内，制成难溶性载药胶束制剂，有很好的肿瘤抑制作用，且毒性低，可增强难溶性药物的水溶性，改善药物的生物利用度，降低药物毒副作用。