一种抗IL‑4R单链抗体与蛇毒L‑氨基酸氧化酶融合蛋白及应用的制作方法

文档序号:11095924阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白,其特征在于:所述融合蛋白制备方法:通过重叠延伸PCR技术方法将抗IL-4R单链抗体与竹叶青蛇毒LAAO基因连接成scFv-LAAO融合基因,构建重组质粒pET28a-scFv-LAAO,转入BL21(DE3)原核表达菌,诱导表达scFv-LAAO融合蛋白,即得。

2.如权利要求1所述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白,其特征在于:所述融合蛋白的制备具体包括以下步骤:

(1)选择酶切位点为EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ的scFv基因序列,将scFv与LAAO两段基因通过重叠延伸PCR技术进行连接,连接前将scFv基因序列的Xho Ⅰ酶切位点去掉,并在LAAO基因的3’端加上Xho Ⅰ酶切位点,在竹叶青蛇毒LAAO基因序列5’端加上带有一段与抗IL-4R单链抗体scFv基因序列相同的重叠序列,以及一段连接肽连接基因,另外在“重叠序列”基因序列的3’端加上Xho Ⅰ酶切位点;

其中,设计引物F1和引物F2去除抗IL-4R单链抗体scFv基因序列的Xho I酶切位点;

(2)设计引物F1和F3,通过SOE-PCR技术连接抗IL-4R单链抗体scFv基因与竹叶青蛇毒LAAO基因,得融合基因scFv-LAAO;

(3)pET-28a载体/scFv-LAAO基因片段的双酶切与目的片段回收:设计反应体系:scFv-LAAO基因片段5-15μL,Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ各1-3μL,10×Buffer Tango 2-3μL,ddH2O 30-40μL;以上成分加入PCR管中,于35-40℃酶切3-5h,78-82℃下灭活Xho Ⅰ酶18-22min后;冷却至10-14℃,再加入1.5-2.5μL EcoR Ⅰ内切酶,35-40℃酶切3-5h,60-70℃,灭活18-22min;取scFv-LAAO基因片段进行1%琼脂糖凝胶电泳,分别回收目的片段;按照同样方法对pET-28a载体进行双酶切和回收目的片段;

(4)重组质粒pET-28a-scFv-LAAO的构建与转化:取经过Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的pET-28a载体目的片段5-15μL、scFv-LAAO双酶切目的片段35-45μL、Rapid T4 DNA ligase 1-3μL、快速连接缓冲液5-25μL、ddH2O 15-20μL,14-18℃过夜;参照《分子克隆实验指南》中的质粒转化方法,将构建的pET-28a-scFv-LAAO重组质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,复苏后进行培养;所述快速缓冲液含Tris-HCl 0.1mol/L、MgCl2 20mmol/L、二硫苏糖醇DTT 20mmol/L、三磷酸腺苷ATP 0.4mmol/L、盐酸亚精胺1mmol/L和牛血清白蛋白BSA 0.1mg/mL;

(5)重组质粒酶切鉴定和蛋白质分子量大小预测:取10个单菌落用装有15mL的TB培养液(卡那霉素50μg/mL)的100mL培养瓶中,于36-38℃环境下震荡培养至0D600=0.6~0.8,用高纯质粒小量制备试剂盒提取质粒;依次用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ对该质粒进行双酶切鉴定;将成功酶切的质粒送进行测序,并对测序结果进行蛋白质氨基酸序列翻译,并对翻译结果进行预测分析;

(6)重组毒素scFv-LAAO抗体蛋白的诱导表达:取平板上的单个菌落接种至装有8-12mL的含卡那霉素45-55μg/mL的TB培养基的50mL锥形瓶中,于35-40℃振荡培养至OD600=0.2~0.4;取菌液3500-4500rpm离心10-20min,重复三次,转移菌液至装有100mL含卡那霉素50μg/mL的TB培养基的500mL锥形瓶中,于35-40℃下振荡培养至OD600=0.4~0.6,加入浓度为0.5-1.5mM的IPTG,于35-40℃振荡培养诱导重组蛋白表达2-4h,即得。

3.如权利要求2所述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白,其特征在于:所述scFv基因序列为:

GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCTGCAG.CAGTCCGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTCCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCCTCACCAGCTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCCACCAATGGTGGTTCTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACATCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGTCCCTGGGATGGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAATGACTCGAG。

4.如权利要求2所述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白,其特征在于:所述引物F1为:5’-GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCT-3’。

5.如权利要求2所述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白,其特征在于:所述引物F2为:5’-GCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA-3’。

6.如权利要求2所述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白,其特征在于:所述引物F3为:5’-ATGACGATGAACTTTAACTCGAG-3’。

7.如权利要求2所述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白,其特征在于:所述步骤(2)为:设计引物F1和F3,去除Xho Ⅰ酶切位点的scFv基因片段15μL,LAAO基因片段15μL,1μL引物F1,1μL引物F3,8μL ddH2O;反应程序:94℃预变性5min;94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸1min重复30个循环;72℃延伸10min;PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒回收基因片段。

8.如权利要求2所述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白,其特征在于:所述步骤(3)为:pET-28a载体/scFv-LAAO基因片段的双酶切与目的片段回收:设计反应体系:scFv-LAAO基因片段10μL,Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ各2μL,10×Buffer Tango 2.5μL,ddH2O 35.5μL;以上成分加入PCR管中,于37℃酶切4h,80℃,20min灭活Xho Ⅰ酶;待冷却至12℃,再加入2μLEcoR Ⅰ内切酶,37℃酶切4h,65℃,灭活20min;取scFv-LAAO基因片段进行1%琼脂糖凝胶电泳分别回收目的片段;按照同样方法对pET-28a载体进行双酶切和回收目的片段。

9.如权利要求2所述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白,其特征在于:所述步骤(6)为:重组毒素scFv-LAAO抗体蛋白的诱导表达:挑取平板上的单个菌落接种至装有10mL的含卡那霉素50μg/mL的TB培养基的50mL锥形瓶中,于37℃振荡培养至OD600=0.2~0.4;取菌液4000rpm离心15min,重复三次,转移菌液至装有100mL含卡那霉素50μg/mL的TB培养基的500mL锥形瓶中,于37℃振荡培养至OD600=0.4~0.6,加入浓度为1mM的IPTG,于37℃快速振荡培养诱导重组蛋白表达3h,即得。

10.一种如权利要求1-9中任一项所述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白的应用,其特征在于:包括用于治疗肺癌及其并发症。

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