一种用于检测胰腺癌的引物组及检测方法与流程

本发明涉及肿瘤基因领域，具体涉及一种用于检测胰腺癌的引物组及检测方法。
背景技术：
：胰腺癌是一种高度恶性的消化系统肿瘤，位居美国癌症死亡原因的第四位在世界范围也是最致命的恶性肿瘤之一。在我国胰腺癌的死亡率在第7到第8位。近三十年来，胰腺癌的年生存率仅2％从提高至6％，而同一时期，所有部位肿瘤的5年生存率从49％提高到68％，一些癌症的生存率能达到甚至90％以上。胰腺解剖部位隐匿，胰腺癌难以早期发现确诊，病人出现临床症状时己经出现转移，难以手术切除。胰腺癌由于其本身的高度侵袭性和对化疗药物的耐药性，传统的手术及放化疗手段难以进行根治，因此具有较高死亡率。此外，胰腺癌的发生率呈逐年上升趋势，近来一份报告预测，根据目前的趋势，到年胰腺癌将成为美国癌症相关死亡的第二大常见的原因。寻找参与胰腺癌发生发展，尤其是与胰腺癌早期诊断及预后相关的新的生物学指标，对于早期发现胰腺癌并改善胰腺癌患者的预后具有重要意义。近来，循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)检测的出现给患者的检测带来了新的希望。CTCs是从肿瘤病灶脱离并移位至血液中的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。与其他组织学标本如骨髓等相比，外周血标本容易获取，且对患者创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。CTCs检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。与传统的诊断方法相比，CTCs检测可更加敏感地发现疾病的变化，且对患者没有副作用。CTC的检测通常通过抽取一定体积的血液进行。检测分为两类，包括不捕获(富集)直接检测和先捕获(富集)后检测，其中后者为主流的检测方法。先捕获(富集)后检测的方法也分为两类，即正选和负选。正选主要是通过CTC表面标志物或细胞的物理性质(大小、密度)进行捕获；前者是基于免疫磁球技术和微流控芯片技术，后者是基于过滤、离心的原理。负选则是通过白细胞表面标志物间接捕获CTC。然而基于先捕获(富集)后检测的方法有着明显的缺陷。它严重依赖于肿瘤细胞表面标记物的表达，因此无法捕获未表达表面肿瘤标记物的CTC细胞。采用RT-PCR的方法检测CTC细胞的特异性基因是CTC细胞检测的另外一种方式。首先抽取一定体积的血液，通过密度梯度离心的方式富集CTCs，然后通过RT-PCR的方式检测特定基因的mRNA，以此判断CTCs是否存在，并通过检测CT值的变化给CTCs定量。这种方法检测CTCs费用低，敏感度高，而且容易自动化。目前RT-PCR方法检测胰腺癌CTCs的检测标准还没有建立。我们通过检测胰腺癌患者的CTCs特征基因，确定胰腺癌CTCs的检测方法和检测标准。这些检测方法和标准的建立有助于肿瘤患者的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物(包括NK和CAR-T免疫治疗)的疗效及制定个体化治疗方案。针对上述问题，本发明开发一种高灵敏的多基因联合检测方法，通过联合检测CK18、CK20、CEA、Vimentin、MUC1、Epcam、Birc5、EGFR和C-met9个基因实现肿瘤的早期检测。本发明设计和运用靶特异性引物组，大幅度提高检测的灵敏度。该检测方法的检出率可达到95％，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测胰腺癌的引物组及检测方法，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种用于检测胰腺癌的引物组，包含：本发明的引物组可通过以下两种方法实现胰腺癌的检测。方法1：PCR方法。(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反应的每个循环的条件为94摄氏度、30s；55摄氏度、30s；72摄氏度、10s；(2)进行反转录和PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。方法2：荧光定量PCR方法(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；分别加入2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，其中，PCR反应的每个循环的条件为95摄氏度、10s和60摄氏度、30s；40个循环；每管设立三个复孔；(2)进行反转录和PCR反应，并实时检测荧光；(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值，判断是否有标志物靶基因表达于样品中。本发明的有益效果在于：本发明通过设计特异性PCR引物，开发出用于胰腺癌早期检测的多基因联合检测方法。此方法：(1)建立的PCR体系可对CK18、CK20、CEA、Vimentin、MUC1、Epcam、Birc5、EGFR和C-met基因进行联合检测；(2)通过同时对多个基因进行检测胰腺癌检出率可达到98％；(3)灵敏度高，低至1-5拷贝的基因表达水平均可检出；(4)特异性强，正常人或非胰腺癌病人样本不会产生非特异性信号；(5)检测速度快，操作简单，费用低廉。附图说明图1为实施例中健康人外周血样本检测阴性PCR图。图2为实施例中非胰腺癌患者外周血样本检测阴性PCR图。图3为实施例中非胰腺癌患者癌组织检测阴性PCR图。图4为实施例中胰腺癌患者外周血检测阳性PCR图。图5为实施例中胰腺癌患者肿瘤组织检测阳性PCR图。图中，M.100bpmarker；1.B2M；2.CK18；3.CK20；4.CEA；5.Vimentin；6.MUC1；7.Epcam；8.Birc5；9.EGFR；10.C-met。具体实施方式本发明针对目前胰腺癌中的肿瘤驱动基因，通过联合检测CK18、CK20、CEA、Vimentin、MUC1、Epcam、Birc5、EGFR和C-met9个基因实现胰腺癌的早期检测。针对目前检测方法灵敏度低，检测过程复杂繁琐，检测所需时间长，无法满足临床检测的实际需求。针对上述问题，设计出用于检测上述9个基因的一整套特异性引物组。根据上述9个基因的参考序列设计特异性扩增引物，其PCR产物长度最优是在180-200bp之间，退火温度不高于60度，GC含量在40-60％之间，符合一般引物设计软件的要求。通过采用实时荧光PCR反应检测体系，实现多个基因联合的高灵敏检测，其检测方法如下所述。本发明结合附图和实施例作进一步的说明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》第三版(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的(带标记的)探针、引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1:基因选择多项研究表明，单基因筛查敏感度约为20-60％，大部分用于肿瘤早期筛查的单个基因检测，其检测敏感度或特异度偏低，不能满足临床需要。采用多基因联合检测可以有效解决敏感度低的问题，提高肿瘤早期筛查和诊断的准确度。ZhouJ等人(ZhouJ,HuL,YuZ,etal.Markerexpressionincirculatingcancercellsofpancreaticcancerpatients.JSurgRes2011；171:631–6.)同时检测hTERT、CK20、C-met、CEA基因，结果表明联合检测四个基因用于胰腺癌早期诊断的敏感度远高于单基因检测。为了提高早期肿瘤的检出率，提高肿瘤患者的治愈率，改善病人预后，我们对胰腺癌和正常组织的差异表达基因进行了筛选。我们通过大量比对实验发现CK18、CK20、CEA、Vimentin、MUC1、Epcam、Birc5、EGFR和C-met组成的基因组对胰腺癌具有较高的检出率，达到98％，相对于现有的检测技术，产生了意想不到的技术效果，具有显著的进步。实施例2:引物筛选(1)设计引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3，具体为：利用生物信息学软件对靶基因A-I序列进行分析，利用序列分析软件设计特异性引物组，利用NCBI引物搜索软件检测各配对引物在人基因组中的特异性，分别设计出3对特异性扩增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3；表1：PCR检测引物(2)外周血样品的处理收集某医院收治并经病理证实的胰腺癌患者外周血，清晨7点，空腹，经肘静脉采集新鲜血液，存放于抗凝管中，摇匀，常温下保存≤4hr。2.1将抗凝管中的全血样本加入等体积PBS(pH7.0)，于室温3000rpm离心5min，去除上层血浆；2.2加入等体积氯化铵红细胞裂解液(可购自碧云天)，于室温200rpm离心8min混匀后，以3000rpm室温离心5min，弃去上清；2.3将下层血细胞和生理盐水按照体积比1:2～2:1混合后，加入Ficoll分离液，混合液与Ficoll分离液的体积比为1:2～2:1，离心力为700g，离心20～40min；2.4吸弃上清，取细胞沉淀，洗涤，即得到PBMC；2.5取PBMC用于核酸提取，多余的PBMC用RNA保护剂重悬，保存于-20度。(3)核酸的提取3.1取不多于5×105的PBMC，加入250μLBufferRLTPlus，吹打混匀；3.2将裂解液转移至gDNA清除离心型柱中，8000×g(10,000rpm)离心30s。收集流穿液，弃离心柱；3.3加入1倍体积的70％乙醇(350μL)至流穿液中，吹打混匀；3.4将样品转移至RNeasyMinElute离心柱，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；3.5在RNeasyMinElute离心柱中加入700μLBufferRW1，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；3.6在RNeasyMinElute离心柱中加入500μLBufferRPE，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；3.7将RNeasyMinElute离心柱置于新的2mL收集管中，打开盖子，全速离心5min，使乙醇挥发；3.8将RNeasyMinElute离心柱置于新的1.5mL收集管中，加入20μLRNase-freeH2O，盖紧盖子，全速离心1min洗脱RNA。(4)模板cDNA的获得4.1准确测得样品RNA浓度；4.2严格按照cDNA反转录试剂盒说明书在冰上制备反转录体系；成分体积5×Mix8μLRNA500ngRNase-freeH2O至40μL4.3轻柔混匀以上反应体系，并利用离心机短暂离心，55度20min，85度2min，获得模板cDNA；(5)普通PCR扩增用TaqDNA聚合酶配置反应体系，用引物为a-i和人内参基因(B2M)进行PCR扩增各样品，产物用1％凝胶检测；扩增体系成分体积2×Mix10μLcDNA1μL引物-F0.8μL引物-R0.8μLRNase-freeH2O7.4μLPCR反应条件是95℃预变性3分钟，1个循环；95℃变性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35个循环；72℃延伸7分钟。(6)荧光实时定量PCR扩增根据设计的特异引组a-i，通过荧光定量PCR进行扩增，体系如下：成分体积2×ChamQSYBRqPCRMasterMix10μLcDNA2μL引物-F0.4μL引物-R0.4μLRNase-freeH2O7.2μLTotal20μL95℃预变性20s，1个循环；95℃10s，60℃30s，40个循环；每管设立三个复孔；根据步骤5和6的pcr结果，筛选出以下引物组，作为本发明用于检测胰腺癌的引物组。实施例3：效果验证根据实施例2的筛选结果，采用下表所述的引物组对200个肿瘤样本进行检测。其中，CK8的正向引物为CGCCTGGAAGGGCTGACCGA，反向引物为GTTGGCAATATCCTCGTACT；N-cadherin的正向引物为CCTTAACTGAGGAGTCAGTG，反向引物为CAGACCTGATCCTGACAAGC；VEGF的正向引物为GTGCCCGCTGCTGTCTAATG，反向引物为CACATCTGCAAGTACGTTCG；VEGFR2的正向引物为GAGAAGCAGAGCCATGTGGT，反向引物为GCACTCTTCCTCCAACTGCC。1～9号引物组的检出率如上表所示，从表中可以看出，引物组中，随着引物数量的增加，在一定程度上可以提高其检出率。进一步地，通过比较5～9号引物组可以发现，引物组内的组合对于检出率的高低有重要影响。同时在相同的检测基因数量情况下，5号引物组的检出率高于6～9号引物组。因此，我们优选5号引物组的基因组合用于胰腺癌的检测。进一步通过研究发现，5号引物组中，CK18、CK20的表达可提示上皮细胞来源的肿瘤；表皮生长因子受体(EGFR)在众多恶性肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用，成为目前肿瘤研究新热点之一；C-met作为受体酪氨酸激酶与肿瘤细胞的生长、侵袭、转移和凋亡相关；Vimentin是正常间叶细胞及其来源的肿瘤标记物，与参与到EMT过程中，且发挥着关键性的作用；EPCAM属于上皮细胞粘附分子，在上皮癌变过程中发挥着作用；Birc5是凋亡抑制蛋白，在肿瘤中异常表达；MUC1在炎症和肿瘤的进展中起着重要的作用；CEA是一种广谱肿瘤标志物。由上可知，本发明并不是将9对引物进行简单叠加组合，9对引物相铺相成，在功能上彼此支持，使得检出率得到大幅度提升，取得了意想不到的技术效果。综上所述，本发明中选择的基因涉及肿瘤的代谢、增殖、侵袭等方面，可较为全面的检测出胰腺癌的细胞生物学特征。实施例4：特异性分析根据实施例2的筛选结果，采用上表所述的引物组对正常人外周血样本(图1)、非胰腺癌病人的外周血(图2)和肿瘤组织样本(图3)、胰腺癌病人的外周血(图4)和肿瘤样本(图5)进行检测。结果如图1-5所示，从图中可见所述的引物组在正常人外周血(图1)、非胰腺癌病人的外周血(图2)和肿瘤组织样本(图3)中检测到基因的低表达或不表达。在胰腺癌病人的外周血(图4)和肿瘤组织中(图5)可检测到多个基因的表达，分别为5/9和6/9，说明本发明中所述引物组具有高度的特异性。当前第1页1 2 3