一种邻苯二甲酸酯类增塑剂单链DNA核酸适配体及其筛选与表征方法及电化学传感器与流程

文档序号:11126048阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种邻苯二甲酸酯类增塑剂单链DNA核酸适配体,其特征在于,该核酸适配体为与邻苯二甲酸酯类增塑剂具有高特异性和高亲和力的核酸适配体。

2.根据权利要求1所述的核酸适配体,其特征在于,该核酸适配体的单链DNA序列高度富集,来自同一富含C碱基家族。

3.根据权利要求2所述的核酸适配体,其特征在于,该核酸适配体的单链DNA序列为5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACN1-4TCCCACGCATTCTCCACAT3'和/或者为其单碱基或双碱基的变异体。

4.根据权利要求3所述的核酸适配体,其特征在于,该核酸适配体的单链DNA序列为DBP-1:5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT3'。

5.根据权利要求3所述的核酸适配体,其特征在于,该核酸适配体的单链DNA序列为DBP-2:5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACAGGTCCCACGCATTCTCCACAT3'。

6.一种邻苯二甲酸酯类增塑剂单链DNA核酸适配体的筛选与表征的方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:步骤一:通过化学合成制备在其中一条线性脂肪侧链的末端具有氨基基团的邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的衍生物(DBP-NH2);步骤二:通过氨基与琼脂糖微球上的环氧乙烷活化基团进行缩合反应将DBP-NH2共价连接到琼脂糖微球上;步骤三:进行基于固相分离的核酸适配体筛选;步骤四:筛选后对获得的富集文库进行高通量测序。

7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤一如下:(1)邻苯二甲酸单丁酯(化合物1)的制备;DCC缩合产物(化合物2)的制备;烷基链末端氨基修饰的DBP衍生物(DBP-NH2)(化合物3)的制备。

8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,(1)邻苯二甲酸单丁酯(化合物1)的制备如下:将邻苯二甲酸酸酐(8.5g,57mmol)、正丁醇(5毫升)、无水处理的四氢呋喃(7.5毫升)及洁净干燥的磁子放入50毫升干燥的圆底烧瓶中,在磁力搅拌下60℃加热回流9小时,有不溶的白色固体生成,放置室温后抽滤,用四氢呋喃洗瓶子后再次抽滤,旋蒸后得白色浆状物质,加入CH2Cl2后,有白色沉淀,抽滤旋蒸得到油状液体,加入100毫升去离子水,再用等体积的乙酸乙酯萃取3次,用饱和NaCl萃取有机相1次,最后用无水Na2SO4干燥有机相,放置过夜,过滤,旋干得10.986g,硅胶柱分离纯化,旋干后抽真空得2.1g邻苯二甲酸单丁酯,高效液相色谱(Agilent 1200)分离为单峰,产物纯净;DCC缩合产物(化合物2)的制备如下:邻苯二甲酸单丁酯和5-(N-叔丁氧基氨基)-1-戊醇按1:1.2投料,20ml无水四氢呋喃中加入邻苯二甲酸单丁酯(1.158g),磁力搅拌及冰水浴下,加入二环己基碳二亚胺(DCC,5.495g),10分钟后加入4-二甲氨基吡啶(DMAP,0.217g),20分钟后加入5-(N-叔丁氧基氨基)-1-戊醇(1.723g,溶于5ml的无水四氢呋喃,逐滴加入),在冰水浴搅拌1小时后,撤冰水浴室温反应27小时,将反应液进行抽滤,用无水的四氢呋喃洗涤烧瓶,抽滤,将滤液旋蒸,加入20毫升石油醚洗涤,抽滤,置于冰箱过夜抽滤,用石油醚洗涤烧瓶抽滤,旋蒸,接着过硅胶柱纯化产品(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯=8:2(v:v)),旋蒸,纯化后得到约0.5g DCC缩合产物,一维核磁氢谱表征(VNMRS600兆赫,TMS为内标,CDCl3为溶剂)证实得到预期的化合物1;烷基链末端氨基修饰的DBP衍生物(DBP-NH2)(化合物3)的制备如下:将DCC缩合产物(0.5g),二氯甲烷(DCM,2毫升)和三氟乙酸(TFA,2毫升)加入三颈烧瓶中,在室温下磁力搅拌40分钟,然后将混合物过滤,旋转蒸发,得油状液体,油性液体用乙酸乙酯萃取三次,并用饱和NaHCO3洗涤一次,用无水硫酸钠干燥,最后,经过过滤,旋转蒸发,得到0.1g DBP-NH2

9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤二如下:将0.1g环氧活化的琼脂糖微球加去离子水溶胀,并用20mL去离子水反复洗涤,获得350μL湿球。然后用0.2M Na2CO3(pH≈12)洗涤琼脂糖球,在500μL反应体系中加入46.7mg(0.15mmol)DBP-NH2,置于室温条件下振荡反应48小时,反应结束后用pH 4.5的醋酸钠缓冲溶液(0.1M醋酸钠,0.5M NaCl)和pH 12碳酸钠缓冲溶液(0.2M NaHCO3/Na2CO3,0.5M NaCl)反复交替洗涤琼脂糖微球三次,最后用水洗涤,并定容至500μL,4℃冰箱保存备用。

10.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤三包括4轮筛选。

11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,筛选所用的随机单链DNA文库(Pool0,表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化,Pool0全长80个碱基,包括两端长度为20个碱基的固定序列和中间40个碱基长度的随机序列,固定序列是SELEX的PCR步骤中分别与上游引物(FP-SELEX,表1)和下游引物(PO4-RP-SELEX,表1)的结合区域,上游引物和下游引物均由宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)合成。其中下游引物5’端进行磷酸化修饰,Pool0、FP-SELEX和PO4-RP-SELEX均用1×Tris-EDTA缓冲液(10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0)配制成100μM的储存液,于-80℃储存备用;

第一轮筛选:将1nmole的Pool0(100μM储存液,10μL)稀释在490μL的结合缓冲液中(20mMTris,100mM氯化钠,2mM氯化镁,5mM氯化钾,1mM氯化钙,1%Tween20,0.03%triton X-100,2%DMSO,pH 7.9),将上述溶液于95℃加热10分钟,冰水浴淬冷5分钟,方至室温,将实施例3中制备的连接了DBP-NH2的琼脂糖微球(100μL)用结合缓冲液洗涤三次,然后将在上述洗涤后的琼脂糖微球中加入上述热处理后的pool0溶液,室温旋转孵育1小时,用10K超滤管分离,将琼脂糖球用结合缓冲液洗涤三次后,加入100μL结合缓冲液,在90℃震荡加热十分钟后用超滤管分离,收集上清液,将洗脱液进行PCR扩增,反应的总体积为2mL,所获得的PCR产物用PAGE进行定性表征后用乙醇沉淀法纯化PCR产物,然后用Lamda核酸外切酶消化法进行单链DNA的制备,再用乙醇沉淀法纯化获得富集的单链DNA文库Pool1

第2-4轮SELEX:将第一轮SELEX获得的Pool复溶后定量,投入200pmol进行下一轮的筛选,具体筛选过程与条件与第一轮筛选相同,最后获得富集的单链DNA文库Pool4

12.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤四如下:将获得的富集文库送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行高通量测序,高通量测序结果显示出现频率最高的前100条单链DNA序列高度富集,来自同一家族,而且富含C碱基。

13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,步骤四中的单链DNA序列为5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACN1-4TCCCACGCATTCTCCACAT3'和/或者为其单碱基或双碱基的变异体。

14.根据权利要求13所述的方法,其特征在于,步骤四中的单链DNA序列为DBP-1:5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT3'或DBP-2:5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACAGGTCCCACGCATTCTCCACAT3'。

15.一种基于如权利要求1-5中任一权利要求所述的核酸适配体的电化学生物传感器。

16.如权利要求15所述的电化学生物传感器,其信号探针为DBP-1-10T-C-Fc或者DBP-1-C-Fc。

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