耐高温的具有纤维素降解能力的芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及的是一种生物环保领域的技术，具体是一种耐高温的具有纤维素降解能力的芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

纤维素是植物光合作用的主要产物，是自然界储藏最丰富的一类可再生资源，全世界每年作物秸秆产量为30亿吨左右，仅我国秸秆每年产量就超过7亿吨。秸秆中纤维素含量在40％左右，纤维素是一种含有大量高能氢键的高分子聚合物，不能直接被作物吸收利用。秸秆直接还田会影响农作物生长，而秸秆焚烧会造成大气污染。据统计，近90％的秸秆被弃置或者燃烧未得到有效利用且污染环境。

在当今能源愈发宝贵的情况下，如何有效开发和利用纤维素资源成为当今世界热门课题之一。纤维素常见的处理方法分为物理法、化学法和生物法，物理法是将纤维素切磨至粉，需要消耗大量能源和人力；化学法需用酸碱浸泡，易造成二次污染；生物法主要利用微生物新陈代谢产生纤维素酶降解纤维素。利用微生物降解纤维素是一种高效、经济、安全的方法，得到社会的广泛认可。

芽孢杆菌是细菌的一类，具有分布广、数量多、繁殖代谢速度快和适应能力强的特点，能形成芽胞(内生孢子)，对外界有害因子抵御作用强。芽胞杆菌能产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，促进有益厌氧菌生长，能刺激动物免疫器官的生长发育，可以自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在环境中对纤维素进行降解。因此芽孢杆菌降解纤维素一直是纤维素生物降解领域的研究重点。综上，筛选高效纤维素降解菌，尤其是芽孢杆菌对于纤维素资源化利用尤其重要。

技术实现要素：

本发明针对现有涉及芽孢杆菌的应用无法对秸秆中果胶和半纤维素组分进行分解，且对高温耐受能力有限等缺陷，提出一种耐高温的具有纤维素降解能力的芽孢杆菌及其应用，该细菌不仅对纤维素具有较强降解能力，还对秸秆中的半纤维素、果胶和木质素组分具有一定的降解能力；同时，该细菌可以在60℃的高温下生长繁殖，并可耐受100℃的高温，具有良好的高温堆肥应用前景。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种耐高温的具有纤维素降解能力的芽孢杆菌，即耐高温纤维素降解芽孢杆菌JWT-1，属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏日期为2016年7月11日，保藏编号为CGMCC No.12758。

所述的芽孢杆菌在80℃和60℃的条件下CMCase和FPase活性分别为121.18U/mL和104.14U/mL。

本发明涉及上述耐高温纤维素降解芽孢杆菌JWT-1的应用，具体为：将JWT-1制成高温堆肥菌剂进而制备成秸秆生物有机肥。

所述的高温堆肥菌剂通过以下方式制备：将JWT-1接种于LB液体培养基中，24h后取样测定，当菌液的浓度为2.0×10⁹cfu/mL以上时停止发酵；然后将每升菌液与0.4-0.6kg水稻秸秆混匀后制成。

所述的应用，通过将高温堆肥菌剂、秸秆段和水混合后进行自然发酵后，经过翻堆制成秸秆生物有机肥。

所述的秸秆生物有机肥具体通过以下方式制备：将水稻秸秆粉碎至3-5cm的秸秆段并按秸秆重量的0.5-1.0％接入堆肥菌剂，调节堆体水含量为50～70％；每天测定堆体温度，刚开始堆体温度会迅速上升至60℃，并维持1-2天，当温度达到顶峰且逐渐下降至45℃时，代表完成第一次发酵，然后进行翻堆5-6天翻堆1次，共翻堆3次；待第三次翻堆完成后，即制得秸秆生物有机肥。

所述的JWT-1采用-80℃低温冷冻保藏法保藏以降低甚至停止其新陈代谢作用从而达到保藏菌种的目的。

技术效果

与现有技术相比，本发明的技术效果包括：

1、本发明纤维素降解菌不仅对纤维素具有较强降解能力，同时还可降解秸秆中半纤维素、木质素和果胶具有一定降解能力，产物不会对环境造成污染。

2、本发明纤维素降解菌繁殖迅速，最高可在60℃高温下生长繁殖，并可耐受100℃高温，培养成本低，便于产业化实施，可制成高温堆肥添加菌剂。

附图说明

图1为实施例1CMC-刚果红平板产生的水解圈；

图2为实施例1生长曲线图；

图3为实施例1纤维素酶、滤纸酶活性曲线图；

图4为实施例1中16S rDNA电泳图；

图5为实施例1秸秆降解测试；

图6为实施例2单周期堆肥温度曲线图。

具体实施方式

实施例1

一、菌种的分离、纯化和保藏

取上海市闵行区浦江镇上海交大浦江绿谷试验基地腐烂水稻秸秆和土壤为样品，不同样本磨碎后均取10g，置于100mL富集培养基中，37℃、150rpm恒温培养。每隔5天，以10％的接种量接入另一富集培养基中，反复驯化4次。富集培养基采用以CMC-Na为唯一碳源的培养基。

取100μL富集液涂布于CMC-刚果红培养基平板，之后于35℃培养箱中倒置恒温培养，5天后观察，平板上出现透明水解圈。挑取少量菌体在LB固体培养基上划线直至获得单菌落，再将获得的单菌落在以CMC-Na为唯一碳源的培养基上连续培养6代，待菌落形态稳定后，即得纯培养菌体形态如图2。

二、菌种鉴定

结合细菌的Biolog GP2和16S rDNA(图4)。鉴定该菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。命名该菌为JWT-1，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.12758。

三、各温度下生长曲线的测定

经测定，该菌最适培养基为LB培养基，调节PH为7.0，将活化细菌以1％的体积比接种到LB液体培养基，分别于28℃、32℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，在150rpm摇床上培养，培养时间为1、2、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、60、66、72、78、84、90、96小时，分别测菌液OD₆₀₀，绘制曲线如图2所示。

所述的LB液体培养基的成分为：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、蒸馏水1000mL，pH7.0。

四、产纤维素酶、滤纸酶活力的测定

取1.5mL0.05mol/L醋酸(HAc)缓冲液配制的0.5％羧甲基纤维素钠溶液(CMC-Na)，于25mL容量瓶中，加入0.5mL离心发酵液50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃反应30min；将剪好的滤纸片(1cm×1cm)放进25mL容量瓶内，加入1.5mLHAc-NaAc缓冲液(pH＝4.8)，再加入0.5mL粗酶液，轻轻摇匀，使滤纸完全浸泡在液体中，并在相应的温度保温1h。

在每个容量瓶内加1.5mLDNS试剂，沸水浴5min，流动水立即冷却，以葡萄糖标准曲线的空白为对照，测定其OD₅₂₀值；在上述条件下，定义每分钟1mL粗酶液催化纤维素水解生成1μg葡萄糖为一个酶活力单位(U)。

经测定，该芽孢杆菌在80℃和60℃的条件下CMCase和FPase活性最高，分别为121.18U/mL和104.14U/mL。

五、对秸秆降解测试

把菌接种到秸秆降解培养基中。秸秆降解培养基成分为：酵母提取物0.5g，蛋白胨1.0g，CaCO₃ 1.0g，NaCl 1.0g，H₂O1000mL。每个三角瓶装100mL，并放入准确称取的秸秆段1.0g。37℃、150rpm静止培养30d后观察滤纸崩解情况如图5、图6所示，秸秆已经崩解，体积明显降低。将瓶底沉淀离心后烘干进行称重，沉淀质量为0.21g，秸秆失重率为81％。

实施例2

高温堆肥菌剂的制备

将菌接种于LB液体培养基中，24h后取样测定菌液的浓度约为2.0×10¹⁰cfu/mL后，停止发酵。每升菌液与0.4-0.6kg稻草秸秆混匀，便制备成高温堆肥菌剂。

实施例3

高温堆肥菌剂在水稻秸秆堆肥中的应用

将水稻秸秆经粉碎设备粉碎至3-5cm，形成秸秆段，按秸秆重量的1.0％接入堆肥菌剂，调节堆体水含量在65％左右。每天测定堆体温度，刚开始堆体温度会迅速上升到70℃附近，并维持1-2天，当温度达到顶峰并逐渐下降到45℃以下时，代表完成发酵(如图7)。整个堆肥过程约7-8天翻堆1次，共翻堆3次。待第三次翻堆完成，即制得秸秆生物有机肥。

经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN103013887，公开日2013-04-03，公开了一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KMXU56，其保藏号为CGMCC No.6595。含有短小芽孢杆菌KMXU56的接种剂，经菌种活化、发酵种子液制备、接种剂的制备步骤得到。技术的菌株从水葫芦渣在自然发酵条件下分离筛选出来，具有较好的分解纤维素能力，能够在中高温范围(40℃～70℃)条件下生存；经发酵培养和扩繁后制得的接种剂，加入到水葫芦渣混合物中，在自然条件下进行堆肥发酵，可将水葫芦渣转化为生物有机肥。但该技术无法针对秸秆中果胶和半纤维素组分进行分解；此外，该杆菌对高温耐受能力有限，若堆肥温度大于70℃则可能会影响该菌株活性。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。