一株高木糖耐性肺炎克雷伯氏菌株及其构建方法与流程

【技术领域】

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种高木糖耐性肺炎克雷伯氏菌株及其构建方法。

背景技术：

木糖，是植物细胞壁(木质纤维素)水解产物中除葡萄糖外含量最高的糖类物质。伴随着人类对能源和化工产品需求量的巨大增长和全球变暖、海平面升高、海水酸化等环境问题的日益严重，追求绿色化工和寻找可再生新能源的呼声日益高涨，而木质纤维素作为目前已知的含量最丰富，成本最低的生物质材料，对其进行有效利用进行生物质乙醇以及其他大宗化学品的生物方法生产是解决上述矛盾和问题的可行方案之一。因此，找到一种可行的方法对木糖加以利用，能够有效提高木质纤维素的利用率，提高生产效率，降低成本。

作为一种重要的化工原料和液体燃料，2，3-丁二醇广泛应用于化工、医药、食品和航空航天等领域。而目前生产2，3-丁二醇的主要方法是化学法，化学法主要是以石油裂解时产生的四碳类碳氢化合物在高温高压下水解得到，成本高、过程烦琐、不易操作，所以一直很难实现大规模的工业化生产。相比于化学合成法，生物法生产2，3-丁二醇不仅解决了原料来源问题，而且无毒、污染小，符合人们对环境友好的要求，是未来最具竞争力的2，3-丁二醇生产方法。

肺炎克雷伯氏菌是目前已知存在的天然2，3-丁二醇产量最高的菌株之一，前人对该菌株生产2，3-丁二醇的研究大都集中在不同底物和条件下表型优异菌株的筛选和发酵条件的优化和少数基因的转录和表达上，对该菌株木糖耐受性的研究一直没有突破，直至gtme的出现为底物耐受性的研究打开了一扇新的大门。提高肺炎克雷伯氏菌株在高浓度木糖环境下高效转化2，3-丁二醇的能力，能够为利用生物方法工业化生产2，3-丁二醇和木质纤维素合理利用打下坚实的基础。

技术实现要素：

本发明的目的是选育高木糖耐性的肺炎克雷伯氏菌株。

所述的基因rpod核苷酸序列如表中seqno：1所示

所述出发酵母菌株为肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniaecicc10781)，购自中国工业微生物菌种保藏中心)，公众可购买获得。

大肠杆菌(escherichiia.colidh5α)，本实验室保藏。

实验使用的质粒pdk7，本实验室保藏。

本发明的技术方案：高木糖耐性肺炎克雷伯氏菌株的构建方法，通过易错pcr的方法将目的基因rpod扩增出来，连接到pdk7质粒上，根据不同体系依次命名易错pcr突变质粒文库。将质粒文库中的各个质粒分别电击转化kpg电转感受态，将验证成功的菌株分别按照对应质粒顺序命名，纯化保藏好得到rpod突变菌株文库。将突变株经高木糖压力筛选，获得高木糖耐受表型。分别将对照菌k.pneumoniae及高木糖耐性表型菌株进行发酵，以细胞生长速度和2，3丁二醇产量为指标，筛选获得高木糖耐性和高产2，3-丁二醇的突变株kpc。该构建方法的具体操作过程如下：

(1)全局转录因子σ编码基因rpod突变质粒文库的构建

依照表1易错pcr反应体系中mn²⁺与mg²⁺的不同，分别设定a、b、c三个和1-7七种共计3×7＝21个体系(表2)，根据genbank公布的k.pneumoniaeσ因子基因(rpod)序列设计引物，以k.pneumoniae基因组为模板，进行pcr反应，扩增目的基因rpod。

表1易错pcr反应体系

*121个体系分别对应唯一一种mn²⁺和mg²⁺浓度组合，单位mm

表2个易错pcr体系

表3pcr反应条件

得到各易错pcr体系产物后，经纯化回收，与pdk7质粒一同经saci、xbai双酶切后连接，转化e.colidh5α感受态后，于cm抗性平板上涂布培养，挑取转化子经验证后，试剂盒提取、纯化质粒，根据不同体系依次命名构建易错pcr突变质粒文库。

(2)rpod突变菌株文库的构建

将质粒文库中的各个质粒分别电击转化kpg电转感受态，通过cm抗性平板筛选获得的转化子利用菌落pcr技术扩增cm抗性基因cat片段后进行质粒精提验证，将验证成功的菌株分别按照对应质粒顺序命名，纯化保藏好得到rpod突变菌株文库。

(3)突变株的筛选与高耐性和高产2，3丁二醇表型的获得

将突变株经高木糖压力筛选，可获得高木糖耐受表型，分别将对照菌k.pneumoniae及高木糖耐性表型菌株进行发酵，利用bioscreen全自动生长曲线分析仪测定生长曲线，以细胞生长速度和2，3-丁二醇产量为指标，筛选获得高木糖耐性和高产2，3-丁二醇的突变株，总体技术路线见图1所示。

本发明的优点和积极效果：

本发明将提高肺炎克雷伯氏菌木糖发酵生产2，3-丁二醇效率，解决木糖利用难题，与原始菌株比较木糖消耗量提高了169％，2，3-丁二醇产量提高了216％，具有重要的经济、社会和环境效益。同时也将扩展了定向进化技术在生物技术领域的应用，使工业微生物菌种改造从经典的物理或化学随机突变向对特定启动子的定向进化和细胞整体代谢网络的操纵转变，快速高效地提高菌种的耐受性和生产性能。

【附图说明】

图1.高耐性菌株筛选技术路线

图2.21个易错体系扩增产物(m：dl5000marker；1-21：分别对应a1至c7共21个体系扩增产物)

图3.a1片段(2088bp)、pdk7质粒(4800bp)酶切(m：dl5000marker；1：pdk7质粒saci、xbai双酶切；2：a1体系rpod片段saci、xbai双酶切)

图4.pdk7-rpod质粒的构建过程与图谱

图5.(a)a1-1质粒精提验证(m：dl5000marker；1：pdk7质粒；2：a1-1质粒)；(b)质粒pcr验证(m：dl5000marker；1：pdk7质粒pcr；2：a1-1质粒pcr)；(c)a1-1质粒酶切验证(m：dl5000marker；1：pdk7质粒对照；2：a1-1质粒双酶切(saci、xbai)

图6.cat基因菌落pcr(m：dl5000marker；1-20：分别为抗性平板上挑取所得转化子菌落对应菌落pcr产物)

图7.(a)不同菌株菌体干重增长曲线；(b)不同菌株木糖发酵消耗曲线；(c)2，3-丁二醇的生成曲线；(d)乙偶姻生成曲线

【具体实施方式】

本发明所使用的肺炎克雷伯氏菌体是可以采用任何来源的肺炎克雷伯氏菌株。

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：全局转录因子σ编码基因rpod基因突变文库的建立

(1)rpod突变质粒文库的构建

多数情况下，研究者使用pcr的方法扩增dna时要求扩增过程尽可能减少碱基错配或碱基置换的出现，以提高变异菌株筛选或菌种鉴定是的准确性和可靠性。而具有热稳定性的dna聚合酶凭借其固有的3’→5’的核酸外切酶活性确保了扩增过程中的高保真度，此外，通过控制pcr反应条件能够进一步降低扩增过程中碱基错误的引入。

易错pcr正是基于以上条件的反向利用，通过使用保真度较低的聚合酶，调整pcr反应体系和反应条件，以一定概率向dna扩增过程中引入随机突变，以建立某个基因的突变文库，用以筛选表型出现变化的菌株和个体。本实验利用易错pcr方法扩增k.pneumoniae菌株的rpod基因，依照表1易错pcr反应体系中mn²⁺与mg²⁺的不同，分别设定a、b、c三个和1-7七种共计3×7＝21个体系(表2)，用引物rpod-sense-saci(pdk7)和rpod-anti-xbai(pdk7)见表4按照表3方法对每个体系进行温度梯度pcr，确定个体系pcr退火温度(表5)。

表4本实例中所用到的引物

表5易错pcr各体系退火温度(单位：℃)

易错pcr各体系条件确立后，按照上述方法和条件，以rpod-sense-saci(pdk7)和rpod-anti-xbai(pdk7)为引物，以kpg基因组为模板进行易错pcr，获得21体系扩增产物2088bp，电泳验证图如图2所示。得到各易错pcr体系产物后，经试剂盒纯化回收，与pdk7质粒一同经saci、xbai双酶切电泳图见图3所示，酶切后用solutioni连接(连接体系见表6)构建质粒，将构建好的质粒转化e.colidh5α感受态后，于cm抗性平板上涂布，过夜培养，挑取转化子利用试剂盒精提质粒，然后进行以rpod-sense-saci和rpod-anti-xbai为引物，精提的质粒为模版进行pcr验证，反应条件：95℃5min；94℃45s，55℃1min，72℃130s，28个循环；72℃10min。用saci和xbai进行双酶切进行验证，经验证后，将验证正确的质粒进行纯化，并根据不同体系依次命名构建易错pcr突变质粒文库，质粒的构建图谱见图4(以a1-1质粒为例)。突变质粒文库构建过程凝胶电泳验证见图5(以a1-1质粒为例)，本实例中所用的pcr扩增体系见表7，质粒文库所含有各体系质粒(共计91个质粒)见表8。

表6solutioni连接酶连接方法

注：反应条件为16℃水浴，过夜连接

表7本实施例中所用的pcr扩增体系

表8质粒文库

实施例2：σ因子全局转录调控获得高耐性和高产2，3-丁二醇表型及发酵实验

(1)重组突变质粒电转化及突变菌株文库的构建：

将表8质粒文库中的各个质粒分别电击转化kpg感受态，通过cm抗性平板筛选获得的转化子，利用菌落pcr技术扩增cm抗性基因cat片段(940bp，图6)所用引物见表9，然后精提质进行pcr验证和酶切验证，将验证成功的菌株分别按照对应质粒顺序命名，纯化保藏好得到rpod突变菌株文库(共计523株菌株)。

表9本实例中所用到的引物

(2)菌株复筛与高耐性和高产2，3丁二醇表型的获得：

将筛选得到的突变菌株文库中的突变株，经过120g/l高木糖压力筛选，可获得高木糖耐受表型，然后分别将对照菌k.pneumoniae及高木糖耐性表型菌株进行发酵，利用bioscreen全自动生长曲线分析仪测定生长曲线，分别以细胞生长速度和2，3丁二醇产量为指标，最后筛选获得一株具有高木糖耐性和高产2，3-丁二醇表型的突变株kpc。

(3)高木糖耐性并高产2，3-丁二醇突变菌株的发酵验证实验

将所得突变菌株和对照菌株分别接种到装有120g/l液体木糖培养基的1l发酵罐中，发酵条件为250rpm、35℃、通气为0.4l/min，进行发酵培养60h，通过取样分析，测定od600，由od600可以计算出菌体干重，结果如图7(a)可知突变菌株菌体干重的增长速率和总量都明显高于对照菌株，说明突变菌株kpc的生长速度比对照菌株快。利用hplc测定发酵液中木糖及各产物浓度，高效液相色谱条件为：色谱柱为bio-radhpx-87h，300×7.8mm；检测器为示差折光检测器(rid)；流动相为5mmol/l硫酸，流速为0.6ml/min；检测器温度为45℃，柱温为65℃。将样品稀释到合适的浓度并经0.22μm的滤膜过滤，进样量为20μl。将所得的结果绘制成折线图：由图7(b)可知，初始木糖浓度为120g/l时，kpg和kpc两株菌62h木糖消耗量分别为37.65g/l和110.5g/l，消耗速率分别为0.61g/l/h和1.78g/l/h；相对出发菌株，kpc菌株木糖消耗量提高了193.5％。改造菌株木糖消耗总量和消耗速率有大幅度提高。

由图7(c)和图7(d)可以看到，随着木糖消耗的增加，乙偶姻和2，3-丁二醇的产量都有不同程度的提高，发酵62h菌株kpc中，乙偶姻和2，3-丁二醇产量分别达到4.76g/l和38.6g/l，相对kpg分别提高了361.3％和228.5％。