一种草酸青霉菌及其在制备亚油酸甘油三脂中的应用的制作方法

本发明属于亚油酸甘油三酯的制备技术领域，具体涉及一种草酸青霉菌及其在制备亚油酸甘油三脂中的应用。

背景技术：

亚油酸是一种公认的必需脂肪酸。由于亚油酸能降低血液胆固醇，预防动脉粥样硬化而倍受重视。亚油酸具有降低血脂、软化血管、降低血压、促进微循环的作用，可预防或减少心血管病的发病率，特别是对高血压、高血脂、心绞痛、冠心病、动脉粥样硬化、老年性肥胖症等的防治极为有利，能起到防止人体血清胆固醇在血管壁的沉积，有“血管清道夫”的美誉，具有防治动脉粥样硬化及心血管疾病的保健效果。

由于亚油酸氧化性强，容易酸败，气味不好等特点，亚油酸常以甘油酯的形式存在，更加稳定，气味和味道更平和，也容易被人和动物吸收，越来越受到人们的重视，因此亚油酸甘油酯可以作为亚油酸的代替品，在食品和医药行业具有潜在的市场应用价值。现在制备亚油酸甘油三脂的方法主要有化学合成法、酶催化法。目前还没有利用发酵法从草酸青霉菌中制备亚油酸甘油三脂的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种草酸青霉菌及其在制备亚油酸甘油三脂中的应用。

为实现上述目的，本发明产生的有益效果是，一种草酸青霉菌，其保藏的分类学名称为草酸青霉菌（Penicillium oxalicum ）CLP001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2016年11 月24 日，保藏号为: CCTCC M 2016675。该菌的18sDNA序列如序列表：

GTATAGACCTACCTGATCCGAGGTCACCTGGTTAAGATTGATGGTGTTCGCCGGCGGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGCCCCCCGGAAGCGGGGGGCGAGAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTTAGTCAAGTACTCAGACTGCAATCTTCAGACAAGAGTTCGTTTGTGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGGATGCCCCCCGGCGGCCGTGAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACGATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTT。

所述的草酸青霉菌在制备亚油酸甘油三脂中的应用，亚油酸甘油三脂的结构式如下：

所述草酸青霉菌在制备亚油酸甘油三脂中的应用具体包括以下步骤：

（1）菌种活化：将草酸青霉菌接种到平板培养基上，20~25℃下培养48小时，获得活化菌种；

（2）初级培养：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到SD培养基中，在120r/min，20℃条件下，摇床培养48h，得种子液；

（3）次级培养：将步骤（2）得到的种子液接种到SD培养基中，种子液的体积为SD培养基体积的1~2%，在20℃条件下，静置培养20d得发酵液；

（4）粗提物制备：将步骤（3）制备的发酵液减压抽滤，得到菌丝体，菌丝体干燥后使用乙酸乙酯浸提，浸提液减压浓缩得粗提物；

（5）凝胶柱层析粗分：将步骤（4）制备的粗提物使用凝胶柱层析分离，经薄层层析检测，合并相同流份并减压干燥，得粗产物；凝胶柱中所用凝胶为羟丙基葡聚糖凝胶，流动相为二氯甲烷:甲醇=1:1混合液；

（6）将步骤（5）得到的粗产物经正相硅胶柱层析分离，得亚油酸甘油三酯。

所述步骤（4）中乙酸乙酯浸提的过程如下：菌丝体使用乙酸乙酯静置浸提10~14h，过滤，得一次浸提后菌丝体和第一次浸提液；将一次浸提后菌丝体用乙酸乙酯超声浸提25~35min，过滤，得二次浸提后菌丝体和第二次浸提液；将二次浸提后菌丝体用乙酸乙酯超声浸提25~35min，过滤，得三次浸提后菌丝体和第三次浸提液；合并三次的浸提液。

所述步骤（6）的具体过程如下：将步骤（5）得到的粗产物经正相硅胶柱层析，以石油醚:丙酮体积比=100:1~10:1梯度洗脱，取石油醚:丙酮体积比=50:1部分洗脱液，经减压浓缩干燥得亚油酸甘油三酯。

所述平板培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、酵母浸出粉10.0g/L、葡萄糖40.0g/L、琼脂20.0g/L，pH 6.0±0.1。

所述SD培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、葡萄糖40.0g/L，pH 自然。

本发明产生的有益效果是：本发明以草酸青霉菌为原料进行亚油酸甘油三酯的提取，具有选择性高、环境友好等特点，而且产率可达到20%；且提取方法简单，成本低，具有可持续性，制得的亚油酸甘油三酯纯度高（可达99%），在食品和医药行业具有潜在市场应用价值。

附图说明

图1为实施例1制备的亚油酸甘油三酯的¹H NMR图；

图2为实施例1制备的亚油酸甘油三酯的¹³C NMR图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。以下实施例中的所用的草酸青霉菌菌株从河南省河南大学校园内植物垂丝海棠叶子中分离筛选出来的，筛选按以下步骤进行：将采集的新鲜垂丝海棠叶子，无菌水洗干净，70%乙醇浸泡消毒3min，无菌水洗三次，去除乙醇，并取最后一次的无菌水进行无菌检验；去除叶子边缘，切成0.5×0.5 cm 小块，放入培养基（蛋白胨10.0g/L、酵母浸出粉10.0g/L、葡萄糖40.0g/L、琼脂20.0g/L，青霉素25万单位/L）中培养。待切开长出菌丝，通过平板划线法连续分离纯化3次，得到表面形态一致的内生菌。得到的内生菌经与NCBI比对相似度，表明分离得到的内生真菌为草酸青霉菌，命名为草酸青霉（Penicillium oxalicum）CLP001，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏日期：2016年11 月24 日，保藏编号：CCTCC NO：CCTCC M 2016675）。

实施例1

所述草酸青霉菌在制备亚油酸甘油三脂中的应用具体包括以下步骤：

（1）菌种活化：将草酸青霉菌接种到平板培养基上（平板培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、酵母浸出粉10.0g/L、葡萄糖40.0g/L、琼脂20.0g/L，pH 6.0±0.1），25℃下培养48小时，获得活化菌种；

（2）初级培养：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到SD培养基（所述SD培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、葡萄糖40.0g/L，pH 自然）中，在120r/min，20℃条件下，摇床培养48h，得种子液；

（3）次级培养：将步骤（2）得到的种子液接种到SD培养基中，种子液的体积为SD培养基体积的1.5%，在20℃条件下，静置培养20d得发酵液10L；

（4）粗提物制备：将步骤（3）制备的发酵液减压抽滤，得到菌丝体，菌丝体经40℃恒温干燥后，使用乙酸乙酯静置浸提12h（乙酸乙酯与菌丝体体积比为1:1），过滤，得一次浸提后菌丝体和第一次浸提液；将一次浸提后菌丝体用乙酸乙酯超声浸提（乙酸乙酯与菌丝体体积比为1:1，超声浸提时间为30min），过滤，得二次浸提后菌丝体和第二次浸提液；将二次浸提后菌丝体用乙酸乙酯超声浸提（乙酸乙酯与菌丝体体积比为1:1，超声浸提时间为30min），过滤，得三次浸提后菌丝体和第三次浸提液；合并三次的浸提液减压浓缩得粗提物，回收乙酸乙酯；

（5）凝胶柱层析粗分：将步骤（4）制备的粗提物使用凝胶柱层析分离，经薄层层析检测，合并相同流份并减压干燥，得粗产物；凝胶柱中所用凝胶为羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20），流动相为二氯甲烷:甲醇=1:1混合液；

（6）将步骤（5）得到的粗产物进行正相硅胶柱层析，以石油醚:丙酮体积比=100:1~10:1梯度洗脱，石油醚和丙酮的比每次降低10个梯度（100:1，90:1，80:1，70:1，60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，10:1）；取石油醚:丙酮体积比=50:1部分洗脱液，经减压浓缩干燥得亚油酸甘油三酯（1050mg，纯度99.1%）。

图1为本实施例制备的亚油酸甘油三酯的¹H NMR图，图2为本实施例制备的亚油酸甘油三酯的¹³C NMR图。由图1－2可知，经¹H NMR、¹³C NMR分析，比对文献（武拉斌，黄波，肖朝江, 等. 茴香根化学成分研究[J]. 大理学院学报, 2013, 12(9): 1-3.），确认提取到的化合物为亚油酸甘油三酯。

上述实施例为本发明优选的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明所作的改变均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 黄河科技学院

<120> 一种草酸青霉菌及其在制备亚油酸甘油三脂中的应用

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 539

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 1

gtatagacct acctgatccg aggtcacctg gttaagattg atggtgttcg ccggcgggcg 60

ccggccgggc ctacagagcg ggtgacgaag ccccatacgc tcgaggaccg gacgcggtgc 120

cgccgctgcc tttcgggccc gccccccgga agcggggggc gagagcccaa cacacaagcc 180

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