一种林木基因组DNA甲基化遗传连锁图谱的构建方法与流程

本发明涉及分子遗传技术领域，尤其涉及一种林木基因组DNA甲基化遗传连锁图谱的构建方法。

背景技术：

在众多表观遗传修饰形式中，最常见且研究最多的是DNA甲基化(Jaenisch and Bird，2003)，是指在甲基转移酶催化作用下以S-腺苷甲硫氨酸为供体，将甲基基团共价添加到DNA碱基上的修饰形式(Santi et al.，1983)。DNA甲基化在许多生物学过程中发挥着十分重要的作用，包括基因表达调控、基因印记和转座子沉默等。众多关注DNA甲基化的研究表明，DNA甲基化多态性也可以影响表型(Katherine et al.，2013)。早在20世纪80年代，就有众多研究报道胞嘧啶甲基化的主要功能是作为基因表达的抑制子(Razin and Riggs，1980；van der Ploeg，1980)减少了表型变异，这种现象在植物和动物中都有发现。人类癌症的发生与CpG岛的甲基化使抑癌因子p16的转录沉默有关，高等植物的某些发育过程如开花、果实成熟和种子发育等也会随DNA甲基化的改变而改变或受到抑制。有越来越多的研究证据表明，表型变异不仅由遗传因素决定，还会受到基因表观遗传修饰的影响(Verhoeven et al.，2010)，并且这种影响所产生的表型是可以遗传的。

林木是多年生植物，世代周期长且需要经历长时间段的组织分化，还要适应多变的自然环境。我国森林覆盖面积较广，林木物种比较丰富，众多林木树种在商业用材生产和生态环境保护中起着非常重要的作用。目前对林木遗传资源的分布、遗传多样性和群体结构等的研究已取得了一定的进展，也对某些树种进行了遗传连锁图谱的构建，能够为将来进一步的研究和育种工作提供理论基础。然而，表型变异并不仅仅由DNA序列决定，DNA甲基化对表型的影响也很显著。林木中表观遗传连锁图谱的构建还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种林木基因组DNA甲基化遗传连锁图谱的构建方法，本发明提供的构建方法高效、稳定、易操作，有利于林木遗传资源分布、遗传多样性和群体结构的深入研究。

本发明提供了一种林木基因组DNA甲基化遗传连锁图谱的构建方法，包括以下步骤：

1)提取木质部组织的基因组DNA，所述木质部组织取自林木胸径位置成熟木质部；

2)采用第一组酶和第二组酶分别对所述基因组DNA进行双酶切，在两组双酶切产物上分别连接接头，得到两组酶切连接后的产物；

所述第一组酶包括EcoRI和HpaII，所述第二组酶包括EcoRI和MspI；

3)分别对两组酶切连接后的产物依次进行预扩增和选择性扩增，通过毛细管电泳分离所述选择性扩增的产物，获得群体基因组甲基化标记位点；

所述选择性扩增用引物为：在预扩增用引物的3'端随机增加3个核苷酸碱基，且5'端进行荧光标记；

4)从所述群体基因组甲基化标记位点中筛选符合孟德尔遗传分离的群体甲基化多态性位点，构建甲基化遗传连锁图谱。

优选的是，所述步骤2)中第一组酶EcoRI和HpaII的双酶切产物用接头的序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

所述步骤2)中第二组酶EcoRI和MspI的双酶切产物用接头的序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

优选的是，所述预扩增用引物的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

优选的是，所述步骤2)中的双酶切和连接接头在一个体系中进行，所述体系包括：2μL 10×Buffer，0.25μL 12U/μL的EcoRI酶，0.4μL 10U/μL的HpaII或MspI酶，1μL 100μM的EcoRI的接头，1μL 100μM的HpaII或MspI的接头，0.5μL 10U/μL的T4DNA连接酶，4μL 100ng/μL的基因组DNA，ddH₂O补足至20μL；

所述体系的温度为35～37℃，酶切与连接反应总时间为10～14h。

优选的是，所述步骤3)中预扩增的反应体系包括：4μL 5×Buffer，1μL 10μM的SEQ ID No.5引物，1μL 10μM的SEQ ID No.6引物，0.3μL 10mM的dNTPs，0.3μL 10U/μL的Go Taq polymerase，任一组所述步骤2)酶切连接后的产物3μL，ddH₂O补足至20μL；

所述预扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃30s，56℃30s，72℃80s，30个循环；72℃延伸5min。

优选的是，所述步骤3)中选择性扩增的反应体系包括：3μL稀释20倍后的预扩增产物，4μL 5×Buffer，4μL选择性扩增的引物，0.3μL 10mM的dNTPs，0.3μL 10U/μL的Go Taq polymerase，ddH₂O补足至20μL；

所述选择性扩增的条件为：94℃预变性3min；首个循环扩增参数为94℃30s，65℃30s，72℃80s，将每个循环的退火温度依次递减0.7℃，共扩增13个循环；94℃30s，56℃30s，72℃60s扩增25个循环；72℃延伸5min。

优选的是，所述步骤5)的筛选过程中，将最小等位频率<5％的低频率位点和不存在多态性位点舍弃。

本发明提供一种林木基因组DNA甲基化遗传连锁图谱的构建方法，可通过筛选群体内符合孟德尔遗传分离的稳定甲基化位点进行表观遗传图谱构建，方法精确性高。本发明提供的方法能够高效、稳定地构建林木基因组DNA甲基化遗传连锁图谱，实现重要性状基因定位，能够为林木分子标记辅助育种提供直接有力的技术支持，对确保我国林木速生丰产、林业持续稳定健康地发展具有重要的战略意义。

附图说明

图1是本发明实施例1得到的毛白杨基因组DNA甲基化遗传图谱。

具体实施方式

本发明提供了一种林木基因组DNA甲基化遗传连锁图谱的构建方法，包括以下步骤：

1)提取木质部组织的基因组DNA，所述木质部组织取自林木胸径位置成熟木质部；

2)采用第一组酶和第二组酶分别对所述基因组DNA进行双酶切，在两组双酶切产物上分别连接接头，得到两组酶切连接扩增产物；

所述第一组酶包括EcoRI和HpaII，所述第二组酶包括EcoRI和MspI；

3)分别对两组酶切连接后的产物依次进行预扩增和选择性扩增，通过毛细管电泳分离所述选择性扩增的产物，获得群体基因组甲基化标记位点；

所述选择性扩增用引物为：在预扩增用引物的3'端随机增加3个核苷酸碱基，且5'端进行荧光标记；

4)从所述群体基因组甲基化标记位点中筛选符合孟德尔遗传分离的群体甲基化多态性位点，构建甲基化遗传连锁图谱。

在本发明中，提取木质部组织的基因组DNA，所述木质部组织取自杂交群体内个体胸径位置成熟木质部。所述林木优选为F1代杂交群体，本发明对所述杂交所用母本和父本并没有特殊的限制，采用常规杂交授粉进行组合交配即可。本发明对所述木质部组织的采取方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的木质部组织采取方法即可。如剥去树皮，取木质部材料置于液氮中进行保存。

本发明对所述基因组DNA的提取方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规的CTAB法提取基因组即可。

得到基因组DNA后，本发明采用第一组酶和第二组酶分别对所述基因组DNA进行双酶切，在两组双酶切产物上分别连接接头，得到两组酶切连接扩增产物；第一组酶包括EcoRI和HpaII，所述第二组酶包括EcoRI和MspI。两组的双酶切产物均可在T4连接酶的作用下与特定的人工合成接头相连接，形成带有接头的特异性片段，从而保证预扩增引物与其退火结合。其中，接头是双链的寡核苷酸，由核心序列和限制性内切酶识别序列二部分组成。人工接头优选5′端去磷酸化，从而保证只有一端可以被连接到酶切片段的末端。所述第一组酶EcoRI和HpaII的双酶切产物用接头的序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；所述步骤2)中第二组酶EcoRI和MspI的双酶切产物用接头的序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

在本发明中，所述双酶切和连接接头在一个体系中进行，所述体系包括：2μL 10×Buffer，0.25μL 12U/μL的EcoRI酶，0.4μL 10U/μL的HpaII或MspI酶，1μL 100μM的EcoRI的接头，1μL 100μM的HpaII或MspI的接头，0.5μL 10U/μL的T4DNA连接酶，4μL 100ng/μL的基因组DNA，ddH₂O补足至20μL。在本发明中，所述10×Buffer优选含有MgCl₂，所述体系的温度为35～37℃，优选为36℃，所述酶切与连接的总反应时间为10～14h，优选为12h。

得到两组酶切连接扩增产物后，分别对两组酶切连接后的产物依次进行预扩增和选择性扩增。在本发明中，所述预扩增用引物的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。在本发明中，所述预扩增的反应体系包括：4μL 5×Buffer，1μL 10μM的SEQ ID No.5引物，1μL 10μM的SEQ ID No.6引物，0.3μL 10mM的dNTPs，0.3μL 10U/μL的Go Taq polymerase，任一组所述步骤2)酶切连接后的产物3μL，ddH₂O补足至20μL；所述5×Buffer优选包括MgCl₂，所述预扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃30s，56℃30s，72℃80s，30个循环；72℃延伸5min。

得到预扩增产物后，本发明利用预扩增产物进行选择性扩增，通过毛细管电泳分离所述选择性扩增的产物，获得群体基因组甲基化标记位点。在本发明中，所述选择性扩增用引物为：在预扩增用引物的3'端随机增加3个核苷酸碱基，且5'端进行荧光标记。在本发明中，所述选择性扩增的反应体系包括：3μL稀释20倍后的预扩增产物，4μL 5×Buffer，4μL选择性扩增的引物，0.3μL 10mM的dNTPs，0.3μL 10U/μL的Go Taq polymerase，ddH₂O补足至20μL；所述5×Buffer包括MgCl₂，所述选择性扩增的条件为：94℃预变性3min；首个循环扩增参数为94℃30s，65℃30s，72℃80s，将每个循环的退火温度依次递减0.7℃，共扩增13个循环；94℃30s，56℃30s，72℃60s扩增25个循环；72℃延伸5min。

所述选择性扩增后，本发明通过毛细管电泳分离所述选择性扩增的产物，获得群体基因组甲基化标记位点。通过对比两组不同双酶切组合下的扩增结果，根据对特定识别作用的酶切位点测序，利用毛细管电泳技术就可以确定出全甲基化位点、半甲基化位点与未甲基化位点三种甲基化标记分离类型，随后进行每个位点的群体甲基化多态性数据收集。

得到群体基因组甲基化标记位点后，本发明从所述甲基化标记位点中筛选稳定的群体多态性位点，将最小等位频率<5％的低频率位点和不存在多态性位点舍弃。

筛选出在群体内符合孟德尔分离的稳定遗传多态性位点后，采用本领域技术人员熟知的遗传作图方法进行甲基化遗传图谱构建即可。如利用JoinMap 4.1软件中的CP(cross pollinator)模型对多态性DNA甲基化标记进行连锁分析、确定重组率和标记排列顺序，并按照操作流程构建为DNA甲基化标记遗传图谱(E-map)；利用回归作图算法进行标记顺序排列；利用Kosambi作图函数将重组率转换成图距单位cM(centiMorgan)，似然比LOD(logarithm of odds)值≥5.0，重组率r<0.30。图谱连锁群作图通过MapChart 2.3完成。

下面结合实施例，对本发明提供的一种林木基因组DNA甲基化遗传连锁图谱的构建方法进行详细的描述，但是不能将它们理解为对本申请保护范围的限定。

实施例1

1、本实施例所用的杂交子代群体是以银腺杨“YX01”(Populus alba×P.glandulosa)为母本，毛白杨雄性优良无性系“LM50”(P.tomentosa Carr.)为父本杂交获取的F1代家系，随机选取552株作为实验材料。用利刃剥离植株胸径处树皮(大约5cm×5cm)，取出小块木质部材料放入液氮中冷冻处理保存，用于基因组DNA的提取。

2、杨树杂交子F1代群体552株不同基因型个体成熟木质部基因组DNA提取采用的是改良的CTAB法。具体包括以下步骤：

1)将含有β-巯基乙醇的CTAB提取缓冲液在65℃条件下水浴预热；

2)将木质部材料于液氮中研磨成粉末，取0.5g粉末迅速移入1.5mL无菌离心管中；

3)向装有植物材料的离心管中加入800μl的CTAB提取缓冲液，涡旋震荡10min，置于65℃水浴，每5min轻轻颠倒震荡1次，40min后，12000r/min离心15min；

4)吸取上清液，冰浴冷却至室温，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)溶液，充分混匀，4℃，12000r/min离心10min；

5)重复步骤4)2～3次，至蛋白层不再出现为止；

6)吸取上清液，加入等体积的异丙醇(-20℃预冷)，轻柔混匀，4℃，12000r/min离心10min；

7)取上清液，-20℃沉淀1小时，4℃，12000r/min离心10min；

8)弃去上清液；

9)加入800μl 70％乙醇，轻轻震荡后置4℃，12000r/min离心30s；

10)重复步骤(9)；

11)室温下倒置离心管自然干燥；

12)用100μl去离子水溶解DNA，于-20℃下保存备用。

利用NanoVueTM紫外/可见光分光光度计检测基因组DNA浓度和质量(其检测标准为1.6＜OD260/OD280<1.9)，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳后与DNA Marker作对照，根据条带的亮度与完整性检测基因组DNA纯度及完整性。3、使用同裂酶HpaII/MspI分别与限制性内切酶EcoRI组合对材料基因组DNA分别进行双酶切，酶切连接由一步法完成。各接头的终浓度为50μM，接头在使用前序放置于65℃环境下加热10min，冷却后使用。将冷却后的接头分别与两组酶切产物进行连接，酶切选接体系如下：

第一组酶的双酶切产物用接头

EcoRI接头(100μM) 1μl

HpaII接头(100μM) 1μl

或第二组酶的双酶切产物用接头

EcoRI接头(100μM) 1μl

MspI接头(100μM) 1μl

37℃酶切连接过夜。

4、预扩增与选择性扩增

1)预扩增时，将EcoRI预扩增引物：5'-GACTGCGTACCAATTC-3'、HpaII/MspI预扩增引物：5'-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3'溶解稀释至浓度为10μM后进行预扩增。预扩增反应体系如下：

94℃预变性3min，按以下参数扩增30个循环：94℃30s，56℃30s，72℃80s，最后72℃延伸5min。

2)选择性扩增时，将预扩增产物稀释20倍，选择性扩增引物(是由预扩增引物3′端增加3个碱基获得，HpaII/MspI₊₃为荧光标记引物，序列见表1，溶解稀释至浓度为10μM后进行选择性扩增。选择性扩增反应体系如下：

94℃预变性3min，按下列步骤进行PCR扩增：首个循环扩增参数为94℃30s，65℃30s，72℃80s，然后将每个循环的退火温度依次递减0.7℃，共扩增13个循环；最后按下列步骤扩增25个循环：94℃30s，56℃30s，72℃60s。最后72℃延伸5min。

表1选择性扩增引物序列

本实施例中所用于选择性PCR扩增的110对引物，是EcoRI引物与HpaII/MspI引物随机组合获得。

5、舍弃低频率的非甲基化位点和不具有多态性的甲基化位点，利用多态性甲基化位点进行遗传图谱构建。利用JoinMap 4.1软件对多态性DNA甲基化标记进行连锁分析、确定重组率和标记排列顺序，在软件CP(cross pollinator)模型下利用银腺杨×毛白杨杂交子F1代群体DNA甲基化构建表观遗传连锁图谱(E-map)。回归作图算法用于进行标记顺序排列，Kosambi作图函数用于将重组率转换成图距单位cM(centiMorgan)，似然比LOD(logarithm ofodds)值≥5.0，重组率r<0.30。图谱连锁群作图通过MapChart 2.3完成。

最终确定的表观遗传连锁图谱(E-map)19个连锁群(LGI-LGXIX)共包含2463个多态性DNA甲基化标记，每个连锁群上多态性DNA甲基化标记的数目介于64个至203个之间，平均每个连锁群含有130个标记位点，毛白杨基因组DNA甲基化遗传图谱如图1所示，所有连锁的标记组成的连锁群覆盖毛白杨基因组总长度为2426.7cM。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京林业大学

<120> 一种林木基因组DNA甲基化遗传连锁图谱的构建方法

<130> 2016

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<170> PatentIn version 3.3

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