一种减少扩增偏倚的基因突变检测方法和试剂与流程

文档序号:12056596阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种减少扩增偏倚的基因突变检测方法,其特征在于,所述方法包括:

(a)使用用于捕获待检测位点或待检测区域的第一步单向引导延伸引物对含有目标区域DNA的接头连接产物进行预定循环数的第一步单向引导延伸,然后使用第一通用引物和第一步单向引导延伸引物进行PCR扩增,其中所述第一通用引物与所述接头连接产物上的接头序列匹配;

(b)使用用于捕获待检测位点或区域的第二步单向引导延伸引物对所述步骤(a)的产物进行预定循环数的第二步单向引导延伸,其中所述第二步单向引导延伸引物相比所述第一步单向引导延伸引物在模板上的结合位置距离所述待检测位点或区域更近,然后使用第二通用引物和第二步单向引导延伸引物进行PCR扩增,其中所述第二通用引物与所述接头序列匹配;

(c)对所述步骤(b)的产物进行变性,然后在适于已变性的所述步骤(b)的产物退火的温度下,用双链特异性核酸酶处理所述步骤(b)的产物,以减少丰度过高的DNA分子含量,增加丰度低的DNA分子的相对含量;

(d)使用第二通用引物和第三通用引物对步骤(c)的产物进行PCR扩增并测序。

2.根据权利要求1所述的减少扩增偏倚的基因突变检测方法,其特征在于,所述第一步单向引导延伸引物带有用于捕获所述步骤(a)的产物的亲和标记;优选地,所述亲和标记是位于所述第一步单向引导延伸引物5’端的生物素标记。

3.根据权利要求1所述的减少扩增偏倚的基因突变检测方法,其特征在于,所述第一通用引物与所述第二通用引物是相同的引物。

4.根据权利要求1-3任一项所述的减少扩增偏倚的基因突变检测方法,其特征在于,所述第一步单向引导延伸引物与所述第二步单向引导延伸引物均位于所述待检测位点或待检测区域在所述目标区域DNA的同方向。

5.根据权利要求1-3任一项所述的减少扩增偏倚的基因突变检测方法,其特征在于,所述第一步单向引导延伸引物与所述第二步单向引导延伸引物间隔距离是0-110bp,优选间隔距离是55bp。

6.根据权利要求1-3任一项所述的减少扩增偏倚的基因突变检测方法,其特征在于,有多个所述待检测位点或待检测区域,相应的,使用用于捕获所述多个所述待检测位点或待检测区域的多个第一步单向引导延伸引物和/或多个第二步单向引导延伸引物。

7.根据权利要求1-3任一项所述的减少扩增偏倚的基因突变检测方法,其特征在于,所述待检测位点或待检测区域包括点突变、插入、缺失和基因融合。

8.根据权利要求1-3任一项所述的减少扩增偏倚的基因突变检测方法,其特征在于,所述测序包括测序以得到所述待检测位点或待检测区域的基因突变情况。

9.根据权利要求1-3任一项所述的减少扩增偏倚的基因突变检测方法,其特征在于,所述方法在所述步骤(a)之前还包括:

(a’)对所述接头连接产物进行预定循环数的扩增,并以扩增产物替代所述接头连接产物进行所述步骤(a);优选地,所述预定循环数是3-5个循环。

10.一种减少扩增偏倚的基因突变检测试剂,其特征在于,所述试剂包括:

(a)用于捕获待检测位点或待检测区域的第一步单向引导延伸引物,用于对含有目标区域DNA的接头连接产物进行预定循环数的第一步单向引导延伸;和第一通用引物,用于以所述第一步单向引导延伸的产物为模板进行PCR扩增,其中所述第一通用引物与所述接头连接产物上的接头序列匹配;

(b)用于捕获待检测位点或区域的第二步单向引导延伸引物,用于对所述第一通用引物的扩增产物进行预定循环数的第二步单向引导延伸,其中所述第二步单向引导延伸引物相比所述第一步单向引导延伸引物在模板上的结合位置距离所述待检测位点或区域更近;和第二通用引物,用于以所述第二步单向引导延伸的产物为模板进行PCR扩增,其中所述第二通用引物与所述接头序列匹配;

(c)双链特异性核酸酶,用于在所述第二通用引物的扩增产物已变性且适于退火的温度下,处理所述扩增产物,以减少丰度过高的DNA分子含量,增加丰度低的DNA分子的相对含量;

(d)第三通用引物,用于对步骤(c)的产物进行PCR扩增并测序。

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