本发明涉及多糖的制备，尤其是低蛋白高纯度海参多糖的制备方法。
背景技术：
海参黏多糖是海参体壁的重要成分，其含量可占干海参总有机物的6%以上，最高可达31%。海参的多糖含量及组成等是衡量海参营养价值的最重要化学指标。不同种类的海参，同种海参的不同生长期以及同种海参的不同组织中德海参多糖的含量都有很大的差别。海参多糖含量，组成及硫酸酯化程度是判断海参优劣的关键指标。
海参黏多糖主要存在于海参体细胞外的细胞间质中，同种海参在不同海区和生长阶段有一定差别。具有抗血栓的作用，在体外有明显的抑制血小板解聚作用，由于它使血小板聚集体不能通过脏器和组织中的毛细血管而被扣下出现血小板减少。由于血小板的粘附聚集在早期凝血过程中的重要作用，所以血循环中血小板数量的大量消耗造成动物早期凝血功能异常。主要是影响血液凝结的内在通路，粘多糖在抗血栓的作用是依靠加速血纤维蛋白酶的活力，以防止单位血纤维蛋白的聚合，并改变血纤维蛋白的构筑。海参黏多糖对血小板的凝集作用并不引起血小板的活化和代谢，也不发生形态上的变化和功能，从而达到抗凝血和抗血栓的目的。也能提高机体的细胞免疫功能，促进淋巴细胞增值，增加脾、胸腺指数，增强细胞免疫，具有较强免疫活性。可改善使用药物引起的机体免疫功能低下。可抑制多种霉素和粘蛋白，使致癌性真菌、黄曲霉素被抑制、阻断致癌活性，其高钙含量对防癌有功效，可阻断癌细胞繁殖周期，提高机体免疫力，但现有的提取方法，蛋白含量高，海藻多糖纯度较低。
技术实现要素：
为了克服现有技术中去除蛋白时效率低、多糖损失大的不足，本发明提供工艺合理、技术先进、操作可行的低蛋白高纯度海参多糖的制备方法。该制备方法是采用酶解-超滤-酶解-超滤偶联法制备海参多糖，其提取所得多糖蛋白质含量极低，具有纯度高，免疫原性低等特性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：低蛋白高纯度海参多糖的制备方法，经过下列工艺步骤：
1）原料选取与处理选取干海参为原料，进行粉碎处理，过100～300目筛，得海参粉，备用；
2）脱脂处理将步骤1)所得到的海参粉加入正己烷或石油醚进行萃取脱脂处理6～10h；其中，所述的正己烷或石油醚的用量为海参粉质量的4～10倍；
3）脱除皂苷将步骤2)脱脂处理后的海参粉去除正己烷或石油醚，加入浓度为60～85%的乙醇萃取处理24～48h，脱除皂苷；其中，所述的乙醇的用量为脱脂处理后的海参粉质量的6～20倍；
4）一次酶解将步骤3)中脱除皂苷后的海参粉去除乙醇，真空干燥后置于酶解灌中，加入脱除皂苷后的海参粉质量的15～40倍的纯净水，纯净水含有0.1～1组的十二烷基二甲基甜菜碱和5～10%的异丙醇，充分溶胀后加热至100℃保持20～30min，杀灭微生物；冷却至45～55℃，加入动物蛋白水解酶酶解2～3h；其中，所述的动物蛋白水解酶的酶用量为脱除皂苷后的海参粉质量的0.3～5%；调节pH值7.0～8.0，加入胰蛋白酶酶解5～6h，其中，所述的胰蛋白酶的酶用量为脱除皂苷后的海参粉质量的0.3～5%；酶解完毕后，加热至100℃保持灭酶20～30min，得海参一次酶解液；
5）一次超滤将步骤4)中所得到的海参一次酶解液离心，收取上清液；将上清液通过分子量为10000Da的滤膜超滤，收集截留液，得海参一次超滤液；
6）二次酶解将步骤5)收集的海参一次超滤液置于酶解罐中，加入超滤液体积的3～6倍的纯净水，纯净水含有0.1～1组的十二烷基二甲基甜菜碱和5～10%的异丙醇，加热至45～55℃，加入风味蛋白水解酶酶解3～4h，其中，所述的风味蛋白水解酶的酶用量为脱除皂苷后的海参粉质量的0.3～5%；酶解完毕后，加热至100℃保持灭酶20～30min；得海参二次酶解液；
7）二次超滤将步骤6)所得到海参二次酶解液调节pH值4～5，冷却至2～5℃，静置6～12h；离心，收取上清液；将上清液通过分子量为10000Da的滤膜超滤，收集截留液，得海参二次超滤液；
8）干燥将步骤7)所得到的海参二次超滤液喷雾干燥，得海参多糖干品。
本发明选取干海参为原料，粉碎后加入正己烷或石油醚进行萃取脱脂处理；脱脂处理后的海参粉去除有机溶剂，加入乙醇萃取去除皂苷；干燥后置于酶解灌中，加入水，充分溶胀后，加入动物蛋白水解酶和胰蛋白酶进行一次酶解，灭酶；所得到的海参酶解液离心，超滤后所得的超滤液置于酶解罐中加入风味蛋白水解酶进行酶解处理，灭酶；调节pH值后冷却低温，静置，离心，超滤，收集截留液干燥，得海参多糖干品。本发明采用酶膜偶联的方法，其蛋白质脱除率高，对多糖损失少；其采用有机溶剂正己烷或石油醚进行脱脂处理；
采用乙醇萃取去除皂苷，使所得到的海参多糖纯度高。采用本发明的制备方法制取的海参多糖，经测定：蛋白含量低于0.38%。并经动物实验证实，所提取所得海参多糖免疫原性低。本发明的低蛋白高纯度海参多糖的制备方法，其工艺合理，技术先进，操作可行，适合大规模工厂化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
低蛋白高纯度海参多糖的制备方法，经过下列工艺步骤：
1）原料选取与处理选取干海参为原料，进行粉碎处理，过200目筛，得海参粉，备用；
2）脱脂处理将步骤1)所得到的海参粉加入海参粉质量6倍的正己烷，萃取脱脂处理8h；
3）脱除皂苷将步骤2)脱脂处理后的海参粉抽滤去除正己烷，再加入浓度为80%的乙醇萃取处理36h，脱除皂苷；其中，乙醇的用量为脱脂处理后的海参粉质量的14倍；
4）一次酶解将步骤3)中脱除皂苷后的海参粉去除乙醇，真空干燥，干燥后置于酶解灌中，加入脱除皂苷后的海参粉质量的30倍的纯净水，纯净水含有0.1～1组的十二烷基二甲基甜菜碱和5～10%的异丙醇，十二烷基二甲基甜菜碱和异丙醇促进蛋白质脱除，从而蛋白含量低，相对的海藻多糖高纯度。充分溶胀后加热至100℃保持25min，杀灭微生物；冷却至50℃，加入脱除皂苷后的海参粉质量1.5%的动物蛋白水解酶酶解2.2h；调节pH值7.5，加入脱除皂苷后的海参粉质量1%的胰蛋白酶酶解5.5h；酶解完毕后，加热至100℃保持灭酶25min，得海参一次酶解液；
5）一次超滤将步骤4)中所得到的海参一次酶解液采用三足式离心机，控制转速2000rpm，离心，收取上清液；上清液再采用碟片式离心机，控制转速4000rpm，离心，收取上清液；将上清液通过分子量为10000Da的滤膜超滤，收集截留液，得海参一次超滤液；
6）二次酶解将步骤5)收集的海参一次超滤液置于酶解罐中，加入超滤液体积的4倍的纯净水，纯净水含有0.1～1组的十二烷基二甲基甜菜碱和5～10%的异丙醇，加热至50℃，加入脱除皂苷后的海参粉质量2%的风味蛋白水解酶酶解3.5h；酶解完毕后，加热至100℃保持灭酶25min；得海参二次酶解液；
7）二次超滤将步骤6)所得到海参二次酶解液调节pH值4.5，冷却至4℃，静置10h；采用管式离心机，控制转速12000rpm，离心，收取上清液；将上清液通过分子量为10000Da的滤膜超滤，收集截留液，得海参二次超滤液；
8）干燥将步骤7)所得到的海参二次超滤液喷雾干燥，得海参多糖干品。
本实施例所给出的制备方法，其工艺合理，技术先进，操作可行；采用本制备方法制取的海参多糖，经测定：蛋白含量为0.36%。
实施例2
低蛋白高纯度海参多糖的制备方法，经过下列工艺步骤：
1）原料选取与处理选取干海参为原料，进行粉碎处理，过300目筛，得海参粉，备用；
2）脱脂处理将步骤1)所得到的海参粉加入海参粉质量10倍的石油醚，萃取脱脂处理6h；
3）脱除皂苷将步骤2)脱脂处理后的海参粉离心去除石油醚，加入浓度为85%的乙醇萃取处理24h，脱除皂苷；其中，所述的乙醇的用量为脱脂处理后的海参粉质量的6倍；
4）一次酶解将步骤3)中脱除皂苷后的海参粉抽滤去除乙醇，海参粉真空干燥，干燥后置于酶解灌中，加入脱除皂苷后的海参粉质量的40倍的纯净水，充分溶胀后加热至100℃保持20min，杀灭微生物；冷却至55℃，加入脱除皂苷后的海参粉质量5%的动物蛋白水解酶酶解2h；调节pH值8.0，加入脱除皂苷后的海参粉质量0.3%的胰蛋白酶酶解6h；酶解完毕后，加热至100℃保持灭酶30min，得海参一次酶解液；
5）一次超滤将步骤4)中所得到的海参一次酶解液采用三足式离心机，控制转速2000rpm，离心，收集上清液；上清液再采用管式离心机，控制转速12000rpm，离心，收取上清液；将上清液通过分子量为10000Da的滤膜超滤，收集截留液，得海参一次超滤液；
6）二次酶解将步骤5)收集的海参一次超滤液置于酶解罐中，加入超滤液体积的6倍的纯净水，加热至55℃，加入脱除皂苷后的海参粉质量5%的风味蛋白水解酶酶解3h；酶解完毕后，加热至100℃保持灭酶30min；得海参二次酶解液；
7）二次超滤将步骤6)所得到海参二次酶解液调节pH值5，冷却至5℃，静置6h；采用管式离心机，控制转速12000rpm，离心，收取上清液；将上清液通过分子量为10000Da的滤膜超滤，收集截留液，得海参二次超滤液；
8）干燥将步骤7)所得到的海参二次超滤液喷雾干燥，得海参多糖干品。
本实施例所给出的制备方法，其工艺合理，技术先进，操作可行；采用本制备方法制取的海参多糖，经测定：蛋白含量为0.37%。
实施例3
低蛋白高纯度海参多糖的制备方法，经过下列工艺步骤：
1）原料选取与处理选取干海参为原料，进行粉碎处理，过100目筛，得海参粉，备用；
2）脱脂处理将步骤1)所得到的海参粉加入海参粉质量4倍的石油醚，萃取脱脂处理10h；
3）脱除皂苷将步骤2)脱脂处理后的海参粉离心去除石油醚，加入浓度为60%的乙醇萃取处理48h，脱除皂苷；其中，所述的乙醇的用量为脱脂处理后的海参粉质量的20倍；
4）一次酶解将步骤3)中脱除皂苷后的海参粉抽滤去除去除乙醇，海参粉真空干燥后置于酶解灌中，加入脱除皂苷后的海参粉质量的15倍的纯净水，充分溶胀后加热至100℃保持30min，杀灭微生物；冷却至45℃，加入脱除皂苷后的海参粉质量0.3%的动物蛋白水解酶酶解3h；调节pH值7.0，加入脱除皂苷后的海参粉质量5%的胰蛋白酶酶解5h；酶解完毕后，加热至100℃保持灭酶20min，得海参一次酶解液；
5）一次超滤将步骤4)中所得到的海参一次酶解液采用三足式离心机，控制转速2000rpm，离心，收集上清液；上清液再采用管式离心机，控制转速12000rpm，离心，收取上清液；将上清液通过分子量为10000Da的滤膜超滤，收集截留液，得海参一次超滤液；
6）二次酶解将步骤5)收集的海参一次超滤液置于酶解罐中，加入超滤液体积的3倍的纯净水，加热至45℃，加入脱除皂苷后的海参粉质量0.3%的风味蛋白水解酶酶解4h；酶解完毕后，加热至100℃保持灭酶20min；得海参二次酶解液；
7）二次超滤将步骤6)所得到海参二次酶解液调节pH值4，冷却至2℃，静置12h；采用管式离心机，控制转速12000rpm，离心，收取上清液；将上清液通过分子量为10000Da的滤膜超滤，收集截留液，得海参二次超滤液；
8）干燥将步骤7)所得到的海参二次超滤液喷雾干燥，得海参多糖干品。
本实施例所给出的制备方法，其工艺合理，技术先进，操作可行；采用本制备方法制取的海参多糖，经测定：蛋白含量为0.38%。