一种葡萄糖脑苷脂酶基因检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种葡萄糖脑苷脂酶基因检测试剂盒，及其检测方法。

背景技术：

编码葡糖脑苷脂酶的基因(Glucocerebmsidas，以下简述GBA)突变会造成该酶的缺乏，从而引起葡糖脑苷脂在肝、脾、骨骼和中枢神经系统的单核-巨噬细胞内蓄积而发病，产生肝脾肿大、骨骼畸形、生长发育落后、贫血等临床表现。

然而目前检测GBA的主要技术为基因测序，存在低通量、操作复杂、耗时长等缺点。

荧光定量PCR技术是一项发展较为成熟的核酸检测方法。其优势在于：操作简便，因闭管操作可以减少污染，结果分析快捷。其中Taqman探针技术是一种通过检测聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，以下简称PCR)过程中产生的荧光信号来区分等位基因类型的基因检测技术。针对待检测的基因位点，设计一对Taqman探针及其对应上下游引物，所述探针对分别检测目标位点的两种等位基因。每条探针的5'端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。在PCR扩增过程中，利用Taq酶5’端核酸酶活性降解因与目标序列完全互补而结合在单链上的探针，令荧光基团与淬灭基团分离从而产生荧光。若探针与目标序列存在错配，则不能与单链结合，亦不会产生荧光。因此通过荧光定量PCR仪收集PCR扩增期间荧光信号的变化，可以判别检测样本的基因型。Taqman探针技术最突出的优点是不需要分离或洗脱等PCR后处理过程，简化操作流程并提高了检测速度。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种高准确性、低成本、高通量、快速的检测试剂盒，可用于检测葡糖脑苷脂酶基因是否存在突变。

本发明所采取的技术方案是：

一种葡萄糖脑苷脂酶基因检测试剂盒，包括用于特异性识别葡萄糖脑苷脂酶基因上4个多态性位点的Taqman探针及用于扩增多态性位点所在基因片段所对应的引物对，4个多态性位点分别为N188S、F213I、D409H和L444P。

所述Taqman探针包括野生型探针和突变型探针，对应4个多态性位点的野生型探针和突变型探针如下表所示：

表1、各个多态性位点的探针序列

W代表野生型特异探针，M代表突变型特异探针。

Taqman探针的5'端标记有荧光报告基团、3'端标记有淬灭基团，所述荧光报告基团是FAM、VIC、TAMRA或ROX中的一种，所述淬灭基团是BHQ-1或BHQ-2。

所述引物对包括上游引物和下游引物，对应4个多态性位点的上游引物和下游引物如下表所示：

表2、各个多态性位点的引物序列

F代表上游引物，R代表下游引物。

优选地，所述引物对以2个多态性位点为一组进行复合扩增。所述多态性位点的分组为：第一组，N188S、F213I；第二组，D409H、L444P。

优选地，所述检测试剂盒还包括标准品，所述标准品包括含有4种质粒。单个多态性位点具有3种分型，两种纯合子型以及一种杂合子型。针对一组体系，应用到2份纯合子标准品及1份杂合子标准品。所述纯合子标准品同时对应于两个多态性位点的纯合子型，杂合子标准品对应于两个多态性位点的杂合子型。标准品均由含多态性位点扩增片段的质粒组成。一组体系的纯合子标准品由1种质粒构成，杂合子标准品由2种质粒构成。

体系1的野生型纯合子标准品1由含有N188S-A型和F213I-T型的质粒组成，其对应的检测荧光报告基团分别为FAM及VIC，突变型纯合子标准品2由含有N188S-G型和F213I-A型的质粒组成，其对应的检测荧光报告基团分别为TAMRA及ROX，杂合子标准品3由野生型纯合子标准品1和突变型纯合子标准品2的质粒混合组成，其检测荧光报告基团分别为FAM、TAMRA、VIC及ROX。所述野生型纯合子标准品1的质粒包含如下序列：

CCTTTGTCTCTAGATACCCCTGATTCACCGAGCCCTGCAGTTGGCCCAGCGTCCCGTTTCACTCCTTGCCAGCCCCTGGACATCACCCACTTGGCTCAAGACCAATGGAGCGGTGAATGGGAAGGGGTCACTCAAGGGACAGCCCGGAGACATCTACCACCAGACCTGGGCCAGATACTTTGTGAAGTAAGGGATCAGCAAGGATGTGGGATCAGGACTGGCCTCCCATTTAGCCATGCTGATCTGTGTCCCAACCCTCAACCTAGTTCCACTTCCAGATCTGCCTGTCCTCAGCTCACCTTTCTACCT(SEQ ID NO.17)。

所述突变型纯合子标准品2的质粒包含如下序列：

GGCTGGACCGACTGGAACCTTGCCCTGAACCCCGAAGGAGGACCCAATTGGGTGCGTAACTTTGTCGACAGTCCCATCATTGTAGACATCACCAAGGACACGTTTTACAAACAGCCCATGTTCTACCACCTTGGCCACTTCAGGTGAGTGGAGGGCGGGCACCCCCATTCCATACCAGGCCTATCATCTCCTACATCGGAGCTCCAGGCCTAGAGAGCCAGGGCAGAGCCTCTGCAGGAGTTATGGGGTGGGTCCGTGGGTGGGTGACTTCTTAGATGAGGGTTTCATGGGAGGTACCCCGAGGGACTCTGACCATCTGTTCCCACATTCAGCAAGTTCATTCCTGAGGGCTCCCAGAGAGTGGGGCTGGTTGCCAGTCAGAAGAACGACCTGGACGCAGTGGCACTGATGCATCCCGATGGCTCTGCTGTTGTGGTCGTGCTAAACCGGTGAGGGCAATGGTGAGGTCTGGGAAGTGGGCTGAAGACAGCGTTGGGGGCCTTGG(SEQ ID NO.18)。

体系2的质粒标准品组合与此类似，纯合子标准品4由含有D409H-G型和L444P-T型的质粒组成，其对应的检测荧光报告基团分别为FAM及VIC，纯合子标准品5由含有D409H-C型和L444P-C型的质粒组成，其对应的检测荧光报告基团分别为TAMRA及ROX，杂合子标准品6由野生型纯合子标准品4和突变型纯合子标准品5的质粒混合组成，其检测荧光报告基团分别为FAM、TAMRA、VIC及ROX。所述野生型纯合子标准品4的质粒包含如下序列：

CCTTTGTCTCTAGATACCCCTGATTCACCGAGCCCTGCAGTTGGCCCAGCGTCCCGTTTCACTCCTTGCCAGCCCCTGGACATCACCCACTTGGCTCAAGACCAGTGGAGCGGTGAATGGGAAGGGGTCACTCAAGGGACAGCCCGGAGACATCTACCACCAGACCTGGGCCAGATACATTGTGAAGTAAGGGATCAGCAAGGATGTGGGATCAGGACTGGCCTCCCATTTAGCCATGCTGATCTGTGTCCCAACCCTCAACCTAGTTCCACTTCCAGATCTGCCTGTCCTCAGCTCACCTTTCTACCT(SEQ ID NO.19)。

所述突变型纯合子标准品5的质粒包含如下序列：

GGCTGGACCGACTGGAACCTTGCCCTGAACCCCGAAGGAGGACCCAATTGGGTGCGTAACTTTGTCGACAGTCCCATCATTGTAGACATCACCAAGCACACGTTTTACAAACAGCCCATGTTCTACCACCTTGGCCACTTCAGGTGAGTGGAGGGCGGGCACCCCCATTCCATACCAGGCCTATCATCTCCTACATCGGAGCTCCAGGCCTAGAGAGCCAGGGCAGAGCCTCTGCAGGAGTTATGGGGTGGGTCCGTGGGTGGGTGACTTCTTAGATGAGGGTTTCATGGGAGGTACCCCGAGGGACTCTGACCATCTGTTCCCACATTCAGCAAGTTCATTCCTGAGGGCTCCCAGAGAGTGGGGCTGGTTGCCAGTCAGAAGAACGACCCGGACGCAGTGGCACTGATGCATCCCGATGGCTCTGCTGTTGTGGTCGTGCTAAACCGGTGAGGGCAATGGTGAGGTCTGGGAAGTGGGCTGAAGACAGCGTTGGGGGCCTTGG(SEQ ID NO.20)。

标准品中同种质粒的拷贝数一致。标准品的制备可以根据NCBI上公开的葡萄糖脑苷脂酶基因序列采用常规的T-A克隆方法制备得到。

所述检测试剂盒还包括10x荧光定量PCR反应缓冲液、dNTPs混合液、HS-Taq酶和超纯水。

一种葡萄糖脑苷脂酶基因检测试剂盒的检测方法，其特征在于：使用如权利要求1～3、5～8任一项所述的葡萄糖脑苷脂酶基因检测试剂盒对样本中葡萄糖脑苷脂酶基因的4个多态性位点的扩增采用四重荧光定量PCR反应，以荧光定量PCR仪对反应过程中的荧光信号进行收集。

其中，所述四重荧光定量PCR反应的扩增程序为：初始变性，95℃保持2分钟；热循环40次，每次先95℃保持15秒，随后60℃保持1分钟；循环完毕后16℃保温。

本发明的有益效果是：

(1)基于聚合酶链式反应，提高了多态性位点检测的模板量，大大降低假阳性；

(2)Taqman探针通过配备不同的荧光报告基团，在一次四重荧光定量PCR下最多可以检测2个位点的基因分型，具有高效节约的特点；

(3)四重荧光定量PCR反应在2个小时内完成，Taqman探针特异性高，此检测方法具有用时少，快速和准确度高的特点；

(4)闭管检测，减少人为及环境污染，提高准确性。

(5)操作及结果判定简单：整个PCR扩增过程可以通过电脑软件进行实时检测,能够随时掌握PCR扩增情况；PCR扩增结果在电脑上直接显示,无需电泳、染色等步骤,避免了使用有毒试剂和肉眼判断结果的主观性。

附图说明

图1是试剂盒中纯合子标准品1的检测图谱，菱形(FAM)代表N188S野生型、正方形(VIC)代表F213I野生型；

图2是试剂盒中纯合子标准品2的检测图谱，三角形(TAMRA)代表N188S突变型、星号(ROX)代表F213I突变型；

图3是试剂盒中杂合子标准品3的检测图谱,菱形(FAM)代表N188S野生型、三角形(TAMRA)代表N188S突变型、正方形(VIC)代表F213I野生型、星号(ROX)代表F213I突变型；

图4是试剂盒中纯合子标准品4的检测图谱，菱形(FAM)代表D409H野生型、正方形(VIC)代表L444P野生型；

图5是试剂盒中纯合子标准品5的检测图谱，三角形(TAMRA)代表D409H突变型、星号(ROX)代表L444P突变型；

图6是试剂盒中杂合子标准品6的检测图谱,菱形(FAM)代表D409H野生型、三角形(TAMRA)代表D409H突变型、正方形(VIC)代表L444P野生型、星号(ROX)代表L444P突变型；

图7与图8是实施例1的检测图谱，图7的菱形(FAM)代表N188S野生型、正方形(VIC)代表F213I野生型，图8的菱形(FAM)代表D409H野生型、正方形(VIC)代表L444P野生型；

图9与图10是实施例2的检测图谱，图9的菱形(FAM)代表N188S野生型、星号(ROX)代表F213I突变型，图10的菱形(FAM)代表D409H野生型、正方形(VIC)代表L444P野生型；

图11和图12是实施例3的检测图谱，图11的菱形(FAM)代表N188S野生型、三角形(TAMRA)代表N188S突变型、正方形(VIC)代表F213I野生型，图12的菱形(FAM)代表D409H野生型、正方形(VIC)代表L444P野生型；

图13和图14是实施例4的检测图谱，图13的三角形(TAMRA)代表N188S突变型、正方形(VIC)代表F213I野生型，图14的菱形(FAM)代表D409H野生型、正方形(VIC)代表L444P野生型、星号(ROX)代表L444P突变型。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：葡萄糖脑苷脂酶基因检测试剂盒的组成和使用方法

所述检测试剂盒包括的用于特异性识别葡萄糖脑苷脂酶基因上4个多态性位点的Taqman探针及用于扩增多态性位点所在基因片段所对应的引物对，具体为如下表所示：

表3、检测试剂盒的组成

所述葡萄糖脑苷脂酶基因检测试剂盒的使用方法：

1、样本DNA的提取

根据样本的实际情况，选择合适的方法提取样本DNA，常见的方法有磁珠法、阴离子交换树脂法和碱裂解法等等；

2、荧光定量PCR反应

荧光定量PCR反应的扩增体系如下：

表4、荧光定量PCR反应体系

荧光定量PCR反应的扩增程序如下：

表5、荧光定量PCR扩增程序

3、软件分析获得结果

使用软件SDS2.4对结果数据进行分析。

实施例2：标准图谱的建立

按实施例1的使用方法，对葡萄糖脑苷脂酶基因检测试剂盒内的纯合子标准品和杂合子标准品进行检测，获得如图1、2、4、5所示的纯合子标准品的检测图谱以及如图3和图6所述的杂合子标准品的检测图谱。

实施例3：一号样品检测

按实施例1的使用方法，对一号样本进行检测，获得如图7和图8所示的图谱，可知一号样本为纯合野生型。

实施例4：二号样品检测

按实施例1的使用方法，对二号样本的检测结果如图9和图10所示，可知二号样本为F213I单位点突变。

实施例5：三号样品检测

按实施例1的使用方法，对三号样本的检测结果如图11和图12所示，可知三号样本为N188S单位点突变。

实施例6：四号样品检测

按实施例1的使用方法，对四号样本的检测结果如图13和图14所示，可知四号样本为N188S和L444P双位点突变。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东华美众源生物科技有限公司

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tgtgaagtaa gggatcagca aggatgtggg atcaggactg gcctcccatt tagccatgct 240

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ttctaccacc ttggccactt caggtgagtg gagggcgggc acccccattc cataccaggc 180

ctatcatctc ctacatcgga gctccaggcc tagagagcca gggcagagcc tctgcaggag 240

ttatggggtg ggtccgtggg tgggtgactt cttagatgag ggtttcatgg gaggtacccc 300

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gtggggctgg ttgccagtca gaagaacgac ctggacgcag tggcactgat gcatcccgat 420

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