一种用于鉴定桑椹菌核病的特异性引物及应用该引物进行桑椹菌核病鉴定的方法与流程

本发明属于菌核病技术领域，具体涉及一种由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病鉴定的特异性引物及其应用。

背景技术：

桑椹菌核病又称白果病，是桑椹的主要病害，该病由真菌引起，病菌在桑椹开花时开始侵入。健康的桑椹成熟时呈紫红色，受桑实杯盘菌侵染的桑椹变白色或灰白色，花被显著肥大。病椹落地后，花被部分脱离变成黑色菌核。随着桑椹种植面积的不断扩大，桑椹菌核病持续大面积爆发，且呈蔓延趋势，严重果园甚至颗粒无收，极大地影响种植户的经济效益，威胁着桑椹产业的发展。桑椹菌核病的病原菌主要有4种，分别为核盘菌、桑实杯盘菌、肉阜状杯盘菌和核地杖菌。经研究，广东地区的桑椹菌核病病原菌主要为肉阜状杯盘菌。

目前，鉴定桑椹菌核病的主要方法是表型鉴定。表型鉴定即通过观测桑椹的发病表型特征来判定桑椹菌核病是否发生。由于植株病症表型在发病中后期才能观测到，而病原菌在桑椹开花时即已侵入体内，因此表型鉴定方法对桑椹菌核病的防控意义不大。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种用于鉴定桑椹菌核病的特异性引物，应用该引物可进行由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的检测。

本发明的第二个目的在于提供一种应用该特异性引物鉴定由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的方法，该方法在桑椹菌核病的发病早期即能快速鉴定桑椹菌核病。

本发明的第三个目的在于提供上述桑椹菌核病鉴定的特异性引物在制备具有鉴定桑椹菌核病功能的药物中的应用。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：

一种用于鉴定由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的特异性引物，其特征在于：由上游引物cc-18s-f和下游引物cc-18s-r组成，所述上游引物cc-18s-f的核苷酸序列如seqidno：1中所示，所述下游引物cc-18s-r的核苷酸序列如seqidno：2中所示。

根据ncbi数据库中桑椹肉阜状杯盘菌的18srrna(genbankid：ky449059)序列特征，利用primerpremier5.0和oligo6.0设计和筛选了上述肉阜状杯盘菌的荧光pcr特异性引物(cc-18s-f:gagtgagcataagctcaccccga，如seqidno：1中所示；cc-18s-r:ctccaccccccgagagcggtc，如seqidno：2中所示)。该引物对理论扩增片段大小为344bp，该引物可由华大基因等公司合成。

本发明的特异性引物可用于常规pcr和荧光定量qpcr

本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：

一种应用上述的特异性引物进行桑椹菌核病的鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取发病桑椹和健康桑椹各10个，提取这些桑椹的dna；

(2)以提取的所述发病桑椹和健康桑椹的dna为模板，利用上述肉阜状杯盘菌的特异性引物进行荧光定量qpcr；记录发病桑椹和健康桑椹dna的qpcr反应体系的ct值；将测得的所有所述健康桑椹dna的qpcr反应体系的ct值中的最小值作为评判该桑椹是否具有桑椹菌核病的临界值；

(4)取待检测的桑椹，并提取该桑椹的dna；

(5)以步骤(4)中提取的待检测桑椹的dna为模板，利用所述肉阜状杯盘菌的特异性引物进行荧光定量qpcr，并记录所述待检测桑椹dna的qpcr反应体系的ct值；

(6)当所述待检测桑椹dna的qpcr反应体系的ct值小于所述的临界值时，表明所述待检测的桑椹已感染桑椹菌核病；当所述待检测桑椹dna的qpcr反应体系的ct值大于或等于所述的临界值时，表明所述待检测的桑椹为健康桑椹。

在上述的方法中，优选地采用dna提取试剂盒进行桑椹dna的提取。

在本发明的一个优选的实施方式中，上述的荧光定量qpcr的反应体系包括：sybrpremixextaqⅱ(2×)10.0μl、浓度为10μm的上游引物rs-16s-f0.8μl、浓度为10μm的下游引物rs-16s-r0.8μl、模板2.0μl、双蒸水6.4μl。

步骤(2)中荧光定量qpcr的扩增程序优选为：第一步95℃预变性30s，第二步95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸15s，共45个循环。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述的临界值为35。

本发明的第三个目的是通过以下技术方案来实现的：

上述桑椹菌核病鉴定的特异性引物在制备具有鉴定桑椹菌核病功能的药物中的应用。

所述的药物包括试剂盒等。

有益效果：

本发明的用于鉴定由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的特异性引物灵敏、高效、特异性好。将该特异性引物结合荧光定量pcr所得的桑椹菌核病鉴定的方法能够在发病早期快速鉴定桑椹菌核病，为桑椹菌核病的早期防治提供可靠的依据。

附图说明

图1为实施例1中青枯菌荧光pcr引物特异性检测。泳道1模板为桑椹肉阜状杯盘菌dna；泳道2模板为木霉dna；泳道3模板为核盘菌dna；泳道4模板为灰霉dna；泳道5模板为黑曲霉dna；泳道6模板为黄曲霉dna；泳道7模板为酵母dna；m为2000bpdnaladder；

图2是实施例3中不同发病程度桑椹和健康桑椹样本的ct值。

具体实施方式

在下文的实施例中，所使用的常规pcr仪为由abi公司生产的abi-9700型pcr仪。所使用的taqpcrmix(2×)、dnaisoreagentkit和t-easy载体均由宝生物公司所生产。qpcr实验采用罗氏公司(roche)生产的lightcycler480实时荧光pcr仪以及宝生物公司生产的sybrpremixextaq^tm试剂盒进行。

实施例1

桑椹肉阜状杯盘菌特异引物的设计与验证

1.根据ncbi数据库中桑椹肉阜状杯盘菌的18srrna(genbankid：ky449059)序列特征，利用primerpremier5.0和oligo6.0设计和筛选了肉阜状杯盘菌的pcr特异性引物(cc-18s-f:gagtgagcataagctcaccccga/cc-18s-r:ctccaccccccgagagcggtc)。该引物对理论扩增片段大小为344bp，该引物由华大基因公司合成。引物稀释前先在4℃条件下，以1×10⁴rpm离心2min，然后加入去离子水配成10μm的贮存液保存于-20℃待用；

2.以木霉、核盘菌、灰霉、黑曲霉、黄曲霉和酵母等6种真菌为对照，所有实验菌株均接种于pda培养基中，在恒温气浴摇床中以200rpm的转速，在28℃条件下培养24h。采用dnaisoreagentkit提取各菌株的dna，保存于-20℃条件下待用；

3.以肉阜状杯盘菌和各对照菌株dna为模板，利用肉阜状杯盘菌荧光pcr特异性引物cc-18s-f和cc-18s-r进行常规pcr扩增，pcr反应体系如下：25μl的反应体系中包含12.5μltaqpcrmix(2×)，8.5μl双蒸水，2μl模板，1μl上游引物cc-18s-f，1μl下游引物cc-18s-r。扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。pcr完成后，产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测；

4.同时将电泳条带切胶回收，连接到t-easy载体上，并转化至e.coli中，获得阳性菌落并进行测序。将测序结果在ncbi上进行比对，确定其菌属类型。

结果

以木霉、核盘菌、灰霉、黑曲霉、黄曲霉和酵母等6种真菌为对照，利用肉阜状杯盘菌荧光pcr特异性引物cc-18s-f和cc-18s-r进行常规pcr扩增，电泳分析结果如图1所示：仅肉阜状杯盘菌能扩增出条带，而对照菌株木霉、核盘菌、灰霉、黑曲霉、黄曲霉和酵母等6种真菌均未扩增出条带。

将电泳条带回收转化并测序后，将测序结果在ncbi上已知的肉阜状杯盘菌18srrna序列(ky449059)进行比对，比对结果显示该序列为肉阜状杯盘菌的18srrna特征序列。

综上所述，该肉阜状杯盘菌引物的特异性好，可用于后续肉阜状杯盘菌的荧光定量分析实验。

实施例2

早期快速鉴定桑椹菌核病的方法

ct值的确定

1.取发病桑椹和健康桑椹各10个，采用dnaisoreagentkit试剂盒提取这些桑椹的dna；

2.以步骤1提取的dna为模板，利用上述的肉阜状杯盘菌的特异性引物cc-18s-f/cc-18s-r进行荧光定量qpcr实验。20μlqpcr反应体系包括：sybrpremixextaqⅱ(2×)10.0ul、上游引物cc-18s-f(10μm)0.8μl、下游引物cc-18s-r(10μm)0.8μl、模板2.0μl、双蒸水6.4μl。荧光定量qpcr的扩增程序为：第一步95℃预变性30s，第二步95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸15s，共45个循环。pcr结束后立即进行溶解曲线分析，验证扩增的特异性。每个qpcr反应重复3次。记录qpcr反应体系的ct值，将其记录在表1中；

3.如表1中的数据所示，10个健康桑椹的ct值在35-38之间，而10个发病桑椹的ct值在11-29之间。取所有健康桑椹dna的qpcr反应体系的ct值，即35，作为检测桑椹是否具有桑椹菌核病的临界值，即当桑椹样本qpcr检测的ct值小于35时，表明有肉阜状杯盘菌的存在，该样本为发病桑椹；当桑椹样本qpcr检测的ct值大于35时，表明没有桑椹肉阜状杯盘菌的存在，该样本为健康桑椹。

桑椹菌核病的鉴定

1.取处于桑椹菌核病发病程度为1期(仅桑椹小瘦果未膨大、内部轻微感染)、2期(桑椹小瘦果膨大并严重感染)、3期(桑椹小瘦果感染至发黑，并部分感染外部花被)和4期(桑椹小瘦果和花被整体感染并发黑)的桑椹样本和健康桑椹样本，将其用自来水冲洗干净、用70％酒精表面消毒1min、用无菌水冲洗1次、液氮速冻后，存于-80℃备用；

2.以1g桑椹样本为材料，采用dnaisoreagentkit提取所有桑椹样本的dna，琼脂糖凝胶电泳检测后，保存于-20℃条件下待用；

3.对于每个桑椹样本，取1μl的桑椹样本dna为模板，利用实施例1中的引物cc-18s-f/cc-18s-r进行荧光定量qpcr实验。qpcr采用lightcycler480实时荧光pcr仪和sybrpremixextaq^tm试剂盒进行。20μlqpcr反应体系包括：sybrpremixextaqⅱ(2×)10.0ul、上游引物cc-18s-f(10μm)0.8μl、下游引物cc-18s-r(10μm)0.8μl、模板1.0μl，双蒸水6.4μl。扩增程序如下：第一步95℃预变性30s，第二步95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸15s，45个循环，pcr结束后立即进行溶解曲线分析，验证扩增的特异性。每个qpcr反应重复3次；

4.记录各样本qpcr反应体系的ct值，并将实验结果总结在图2中。

由图2可见：

(1)健康桑椹样本ct值为36.5，大于临界值35。

(2)发病1、2、3、4期的桑椹样本的ct值分别为25.4、18.3、14.2、12.2，均小于临界值35。

故本方法可用于桑椹菌核病的鉴定。

表1

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

序列表

<110>广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所

<120>一种用于鉴定桑椹菌核病的特异性引物及应用该引物进行桑椹菌核病鉴定的方法

<160>2

<170>bissap1.3.6

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物cc-18s-f的核苷酸序列

<400>1

gagtgagcataagctcaccccga23

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cc-18s-r

<400>2

ctccaccccccgagagcggtc21