本发明涉及基因工程及蛋白纯化技术领域，具体涉及一种针对pbpp蛋白的纯化方法。
背景技术：
糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点。
目前，我国ⅱ型糖尿病的患病率增长较快，据1979年在我国30万人口中的调查，糖尿病患病率为0.6％，1989年为2.02％，年均增长0.1％左右，1994年我国普查20万人口，患病率已上升为2.5％，目前20～75岁人群中糖尿病患病率约为3％左右。糖耐量低减患者不低于3％。一般而言，在我国富裕地区的糖尿病患病率高于贫困地区，城市高于农村，肥胖高于正常体重，高龄高于低龄。目前我国糖尿病发病率为1/1000左右，50岁以上的平均患病率为7％以上，40岁以下患病率随着年龄的增长而升高，患者高峰年龄在50～70岁。
我国患病率以北京、辽宁、宁夏、甘肃、云南、福建较高，据1979～1997年调查结果表明为全国之首，而新疆、贵州、山西较低。发病率较高的北京、辽宁与最低的贵州、新疆之间相差达10倍，城市发病率高于农村1～4倍，广西地区调查证明，产糖地区糖尿病患病率高于非产糖区2倍。
尽管多种治疗方法可以控制血糖浓度，但目前仍未实现糖尿病的根治。现有技术中，药物干预仍是糖尿病治疗的主要手段，其中以glp-1类似物、dppiv抑制剂等应用较为广泛。pbpp蛋白(promotingβ-cellproliferationprotein)，是指可诱导胰腺中β细胞增殖、进而促进胰岛素分泌的一类功能性蛋白，由于其不直接参与人体糖代谢机制，因此降糖作用较为温和，对人体副作用较小。然而，此类蛋白的规模化生产是目前制约其临床应用的直接技术问题，其中人源蛋白的获取较为困难，而其他生物来源的pbpp蛋白其药效及安全性又难以得到保障。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对pbpp蛋白的纯化方法，以解决现有技术中pbpp蛋白难以规模化制备的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是以基因工程手段获得的、由微生物所表达的重组pbpp蛋白，其纯化较为困难。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种针对pbpp蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
1)以斑马鱼粪便菌群的总dna为模板，以序列如seqidno.1所示和序列如seqidno.2所示的片段分别为上、下游引物执行pcr扩增，得到序列如seqidno.3所示的dna片段，即为pbpp蛋白表达基因；
2)取步骤1)所获得的pbpp蛋白表达基因，连接到pet28c载体上，即得到重组质粒pet28c-pbpp；
3)取步骤2)所得的重组质粒pet28c-pbpp，转入大肠杆菌e.colitop10中，得到重组菌株；
4)培养步骤3)所得的重组菌株，从中提取重组质粒pet28c-pbpp，将其转化入大肠杆菌e.colibl21，即得到重组表达菌株pet28c-pbpp-bl21；
5)培养步骤4)所得的重组表达菌株pet28c-pbpp-bl21，收集菌体；
6)利用eqbuffer重悬步骤5)所得菌体，超声破碎直至溶液澄清为止，而后以10000rpm的转速离心10min，取上清；取镍珠，悬浮于eqbuffer中，以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，悬浮于eqbuffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于eqbuffer中，得到镍珠悬液，将其加入至所述上清中，于4℃条件下保持2h，而后以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，悬浮于washbuffer中，而后在旋转混匀仪上常温旋转10min，而后以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于eqbuffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于eqbuffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀；
7)取步骤6)所得沉淀物悬浮于洗脱buffer中，在旋转混匀仪上常温旋转15min，以4000rpm的转速离心15min，收集上清，再以4000rpm的转速离心15min收集上清；
8)取步骤7)所得的上清液，以13000rpm的转速离心30～60min，取上清装入透析袋，先利用1×pbs缓冲液透析3h，透析过程中先后更换pbs缓冲液3次，透析后用25％体积浓度的甘油水溶液透析3h，即得到所述pbpp蛋白。
作为优选，步骤5)中用于培养重组表达菌株pet28c-pbpp-bl21的培养基是含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基。
作为优选，步骤5)中，初始向培养基中接入的重组表达菌株pet28c-pbpp-bl21菌液量为培养基体积的1％。
作为优选，步骤5)中培养至培养液od值为0.6时向其中加入终浓度为1mmol/l的iptg，于25℃条件下诱导6～8h，结束培养。
作为优选，步骤2)中pbpp蛋白表达基因与pet28c载体的连接是先经ncoi和xhoi双酶切，酶切产物纯化后采用t4连接酶连接到pet28c上。
作为优选，步骤6)中所述的以4000rpm的转速离心15min，被离心物均是装满于15ml离心管中进行离心的。
作为优选，步骤6)镍珠在eqbuffer中的悬浮，二者的体积比为1:15。
同时，本发明还提供了一种上述pbpp蛋白的功能验证方法，包括以下步骤：
1)取小鼠，连续5d以每天50mg/kg的剂量注射链脲佐菌素，得到ii型糖尿病模型小鼠；
2)取所述pbpp蛋白，以尾静脉注射方式对步骤1)所得的ii型糖尿病模型小鼠给药，每隔7天监测所述ii型糖尿病模型小鼠的血糖变化。
本发明提供了一种针对pbpp蛋白的纯化方法，该技术方案以斑马鱼粪便菌群dna为模板，扩增得到pbpp表达基因，再利用pet28c质粒为载体，先于大肠杆菌top10中扩增质粒，而后转化入大肠杆菌bl21中进行蛋白表达。在此基础上，本发明针对重组菌株的特性设计了适宜的蛋白表达及诱导条件，对于胞内表达的pbpp蛋白，本发明对菌体进行超声破碎后，先利用镍珠结合游离的蛋白，再进行蛋白洗脱，最后分别利用pbs和甘油进行透析，从而实现了pbpp蛋白的有效纯化。
在此基础上，为考察pbpp蛋白的降糖效果，本发明建立了相应的功能验证方法，该方法先利用链脲佐菌素构建ii型糖尿病模型小鼠，而后采用尾静脉注射的方式进行pbpp蛋白给药，以给药后小鼠血糖变化情况来对pbpp蛋白的降糖效果进行分析。实验发现，本发明所制备的pbpp蛋白可确切诱导胰腺中β细胞的增殖，从而对因胰岛β细胞损伤所导致的糖尿病起到治疗效果。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
以下实施例中，所用到的e.colitop10，e.colibl21，pet28c载体质粒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；所用到的限制性内切酶、t4dna连接酶、dna连接酶购自neb公司；所用到的lb固体培养基和液体培养基由本实验室自行配制。
以下实施例中，各缓冲液配方如下：
4leqbuffer：nah2po4.h2o1.46g；na2hpo4.7h2o:50.76g；最后加水到4l，过滤除菌，调ph为8.0，灭菌。
washbuffer：加0.34g咪唑在500mleqbuffer中，调ph为8.0.灭菌。(现配现用)。
洗脱buffer：加1.7g咪唑到eqbuffer，终体积为100ml，调ph为8.0，灭菌(现配现用)。
100mmiptg：2.4giptg溶于100ml水中，过滤除菌。
实施例1
1、pbpp蛋白重组表达系统的构建
以斑马鱼粪便菌群dna为模板，以seqidno.1和seqidno.2序列为引物，pcr扩增获得seqidno.3所示的pbpp片段，命名为pbpp。
已获得的pbpp片段和质粒pet28c，经ncoi和xhoi双酶切，酶切产物纯化后，采用t4连接酶连接到pet28c(seqidno.4)质粒中，重组质粒命名为pet28c-pbpp，并转化进入e.colibl21中，获得的重组表达菌株命名为pet28c-pbpp-bl21。
2、pbpp蛋白的表达与纯化
(1)pbpp蛋白表达：配制200mllb培养基，待冷却后加入200ul氨苄母液，使其终浓度为100ug/ml；挑选pet28c-pbpp-bl21单菌落进行过夜摇瓶培养；按1％接种量接入新鲜含有氨苄抗生素的lb培养基中；待其od为0.6时加入终浓度为1mmiptg进行诱导，25℃连续诱导培养6-8h后离心菌体，-80℃保存备用。
(2)pbpp蛋白纯化：
a结合蛋白：将步骤(1)中收获的菌体35mleqbuffer悬浮，超声破碎呈现澄清透亮的溶液后，10000rpm/min离心10min，收集上清备用；取1ml镍珠，用15ml离心管重悬镍珠(装满15ml)，4000rpm离心15分钟，重复两次；用1mleqbuffer重悬镍珠；将洗涤好的镍珠加入蛋白上清中，置于4度中令镍珠和蛋白结合2h；4000rpm离心15分钟，弃上清。用washbuffer重悬镍珠，将其置于15ml离心管中，加washbuffer至15ml，置于旋转仪器上于常温旋转10分钟，4000rpm离心15分钟。重复该操作3次。
b洗脱蛋白：将步骤a中收获的沉淀用1ml洗脱buffer悬浮，并在常温下于旋转仪上旋转15分钟，4000转离心15分钟，本步骤重复两次，回收总体积为2ml蛋白溶液，同时回收镍珠。
c洗涤：将洗脱的上清转移到1.5ml离心管中，最大转速13000rpm离心30-60min，小心取上清，装于透析袋中，采用1×pbs透析3h，更换pbs溶液重复3次；最后采用25％的甘油透析3h，小心吸取蛋白上清，测定浓度后，分装，-80冻存备用，并采用sds-page胶验证蛋白大小及纯度；
3、pbpp蛋白的功能性验证
试剂配置：0.1m枸橼酸缓冲液(ph4.5)：0.1m枸橼酸液4.5ml(0.21014枸橼酸溶于10ml蒸馏水中)+0.1m枸橼酸钠液5.5ml(0.29412枸橼酸钠溶于10ml蒸馏水中)；7.5mg/ml无菌stz溶液(取37.5mgstz溶于5ml枸橼酸缓冲液，与超净台0.22um滤器过滤，分装存于-20℃即可)(注意避光)
实验流程：
(1)剂量及给药方式：阳性组：50mg/kg/天stz溶液；阴性组：与阳性组同等剂量枸橼酸缓冲液；
给药方式：腹腔注射；
(2)取12只健康雄性老鼠，观察24h，无异常后进行试验；小鼠随机分为2组，称重；第一次给药前饥饿处理24h，禁食不禁水；称重后，按照阳性组剂量换算后，与超净台中腹腔注射stz药物，打完后，正常给予饲料，无菌水喂养，连续5天同一时间注射stz药物；并于打完第3，7，10，14，21，28天用试纸测定小鼠空腹8h后的血糖和接着喂食2h后的血糖，若阳性组大于11.1mmol/l，则造模成功；
(3)造模成功后，每日尾静脉注射pbpp蛋白，频率2天一次，正常饮食；阴性组，尾静脉注射无菌pbs作为对照；
(4)在第7天，第14天，第21天检测小鼠空腹8h后的血糖及接着喂食2h后的血糖，观察血糖有无下降；
实施例2
一种针对pbpp蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
1)以斑马鱼粪便菌群的总dna为模板，以序列如seqidno.1所示和序列如seqidno.2所示的片段分别为上、下游引物执行pcr扩增，得到序列如seqidno.3所示的dna片段，即为pbpp蛋白表达基因；
2)取步骤1)所获得的pbpp蛋白表达基因，连接到pet28c载体上，即得到重组质粒pet28c-pbpp；
3)取步骤2)所得的重组质粒pet28c-pbpp，转入大肠杆菌e.colitop10中，得到重组菌株；
4)培养步骤3)所得的重组菌株，从中提取重组质粒pet28c-pbpp，将其转化入大肠杆菌e.colibl21，即得到重组表达菌株pet28c-pbpp-bl21；
5)培养步骤4)所得的重组表达菌株pet28c-pbpp-bl21，收集菌体；
6)利用eqbuffer重悬步骤5)所得菌体，超声破碎直至溶液澄清为止，而后以10000rpm的转速离心10min，取上清；取镍珠，悬浮于eqbuffer中，以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，悬浮于eqbuffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于eqbuffer中，得到镍珠悬液，将其加入至所述上清中，于4℃条件下保持2h，而后以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，悬浮于washbuffer中，而后在旋转混匀仪上常温旋转10min，而后以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于eqbuffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于eqbuffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀；
7)取步骤6)所得沉淀物悬浮于洗脱buffer中，在旋转混匀仪上常温旋转15min，以4000rpm的转速离心15min，收集上清，再以4000rpm的转速离心15min收集上清；
8)取步骤7)所得的上清液，以13000rpm的转速离心30～60min，取上清装入透析袋，先利用1×pbs缓冲液透析3h，透析过程中先后更换pbs缓冲液3次，透析后用25％体积浓度的甘油水溶液透析3h，即得到所述pbpp蛋白。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤5)中用于培养重组表达菌株pet28c-pbpp-bl21的培养基是含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基。
步骤5)中，初始向培养基中接入的重组表达菌株pet28c-pbpp-bl21菌液量为培养基体积的1％。
步骤5)中培养至培养液od值为0.6时向其中加入终浓度为1mmol/l的iptg，于25℃条件下诱导6～8h，结束培养。
步骤2)中pbpp蛋白表达基因与pet28c载体的连接是先经ncoi和xhoi双酶切，酶切产物纯化后采用t4连接酶连接到pet28c上。
步骤6)中所述的以4000rpm的转速离心15min，被离心物均是装满于15ml离心管中进行离心的。
步骤6)镍珠在eqbuffer中的悬浮，二者的体积比为1:15。
实施例3
一种针对pbpp蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
1)以斑马鱼粪便菌群的总dna为模板，以序列如seqidno.1所示和序列如seqidno.2所示的片段分别为上、下游引物执行pcr扩增，得到序列如seqidno.3所示的dna片段，即为pbpp蛋白表达基因；
2)取步骤1)所获得的pbpp蛋白表达基因，连接到pet28c载体上，即得到重组质粒pet28c-pbpp；
3)取步骤2)所得的重组质粒pet28c-pbpp，转入大肠杆菌e.colitop10中，得到重组菌株；
4)培养步骤3)所得的重组菌株，从中提取重组质粒pet28c-pbpp，将其转化入大肠杆菌e.colibl21，即得到重组表达菌株pet28c-pbpp-bl21；
5)培养步骤4)所得的重组表达菌株pet28c-pbpp-bl21，收集菌体；
6)利用eqbuffer重悬步骤5)所得菌体，超声破碎直至溶液澄清为止，而后以10000rpm的转速离心10min，取上清；取镍珠，悬浮于eqbuffer中，以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，悬浮于eqbuffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于eqbuffer中，得到镍珠悬液，将其加入至所述上清中，于4℃条件下保持2h，而后以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，悬浮于washbuffer中，而后在旋转混匀仪上常温旋转10min，而后以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于eqbuffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于eqbuffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀；
7)取步骤6)所得沉淀物悬浮于洗脱buffer中，在旋转混匀仪上常温旋转15min，以4000rpm的转速离心15min，收集上清，再以4000rpm的转速离心15min收集上清；
8)取步骤7)所得的上清液，以13000rpm的转速离心30～60min，取上清装入透析袋，先利用1×pbs缓冲液透析3h，透析过程中先后更换pbs缓冲液3次，透析后用25％体积浓度的甘油水溶液透析3h，即得到所述pbpp蛋白。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>南昌大学
<120>一种针对pbpp蛋白的纯化方法
<130>2017
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<170>patentinversion3.3
<210>1
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<212>dna
<213>人工序列
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<212>dna
<213>人工序列
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<213>天然序列（斑马鱼）
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