用于检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的试剂盒及方法与流程

本发明涉及生物医学检测领域，尤其涉及一种用于检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的试剂盒及方法。
背景技术：
：结核病严重威胁当今世界人类生命健康。据世界卫生组织(who)估计，全球约有20亿人感染结核分枝杆菌，每年有约200万人死于结核病；我国是世界上22个结核病高负担国家之一，现患肺结核病人达500万。与此同时，非结核分枝杆菌在我国流行逐年攀升。非结核分枝杆菌(nontuberculousmycobacteria，ntm)是分枝杆菌属内除mtb复合群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。迄今为止，共发现154种ntm和13个亚种，大部分为腐物寄生菌，仅少部分对人体致病。ntm可以侵犯人体肺脏、淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等组织器官，并可引起全身播散性疾病。并且ntm的临床表现与结核病相似，经常误诊为结核病。目前对ntm的检测方法有细菌培养法、高效液相色谱、dna测序和膜条杂交技术等。但这些方法相对繁琐且耗时，很难达到快速检测。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种检测结核分枝杆菌与肺结核分枝杆菌的试剂盒及其方法，能快速准确地完成检测。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供了一种用于检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的组合物，包括：a.由seqidno.1和seqidno.2所组成的结核分枝杆菌引物对1；b.由seqidno.3和seqidno.4所组成的非结核分枝杆菌引物对2；c.seqidno.5的结核分枝杆菌的探针1；d.seqidno.6的非结核分枝杆菌的探针2。本发明所述的用于检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的引物对和探针也属于本发明的保护范围，包括引物对1、探针1、引物对2、探针2。表1引物和探针序列表序列编号名称序列(5'-3')seqidno.1引物cgaagtcgtaacaaggtagseqidno.2引物agcccaaiagtgtgicigseqidno.3引物ctactacgaccacatcaseqidno.4引物ccgtaaacaccgtagttgseqidno.5探针ctgatgtgctccttgagttcgccaseqidno.6探针tgcggctggatcacctcctt注：“i”为脱氧次黄嘌呤核苷酸。为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：优选地，选用is6100序列为靶点设计引物对1和探针1检测结核分枝杆菌；选用its序列为靶点设计引物对2和探针2检测非结核分枝杆菌。优选地，所述探针1和探针2均为为荧光探针，其序列5'-端带有荧光基团，3'-端带有淬灭基团，所述探针1和探针2的荧光基团不同。优选地，所述荧光基团选自fam、hex、vic、tet、tamra、cy5、texasred、joe；所述淬灭基团选自bhq1、bhq2、tamra、dabcyl、eclipse、mgb。优选地，所述seqidno.2所示序列有脱氧次黄嘌呤核苷酸修饰。优选地，所述非结核分枝杆菌为26种，详见表2。表2非结核分枝杆菌种类表编号英文名称中文名称1mcobacteriumasiaticum亚洲分枝杆菌2mcobacteriumavium鸟分枝杆菌3mcobacteriumbranderi布分枝杆菌4mcobacteriumcelatum隐藏分枝杆菌5mcobacteriumgordonae戈登分枝杆菌6mcobacteriumabcessus脓肿分枝杆菌7mcobacteriumalvei河床分枝杆菌8mcobacteriumbrumae雾分枝杆菌9mcobacteriumchelonea龟分枝杆菌10mcobacteriuminterjecram插入分枝杆菌编号英文名称中文名称11mcobacteriuminterrnedium中间分枝杆菌12mcobacteriumintraeellulare胞内分枝杆菌13mcobacteriumkansasii堪萨斯分枝杆菌14mcobacteriumlentiflavum缓黄分枝杆菌15mcobacteriummalmoense玛尔摩分枝杆菌16mcobacteriumscrofalaceum瘰疬分枝杆17mcobacteriumsimiae猿分枝杆菌18mcobacteriumszulgai苏尔加分枝杆菌19mcobacteriumtriplex三重分枝杆菌20mcobacteriumxenopi蟾分枝杆菌21mcobacteriumfortuitum偶发分枝杆菌22mcobacteriumgoodii戈地分枝杆菌23mcobacteriummucogenicum黏液分枝杆菌24mcobacteriumperegrinum外来分枝杆菌25mcobacteriumsepticum脓毒性分枝杆菌26mcobacteriumthermoresistible耐热分枝杆菌本发明还提供一种用于检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的组合物的试剂盒，其试剂盒包含核酸提取试剂、荧光pcr反应体系、阴性参考品、阳性参考品和说明书；其中，所述荧光pcr反应体系包括缓冲液、mg2+、taqdna聚合酶、ung、dutp、dntp以及如上所述的组合物(包括引物对1、探针1、引物对2、探针2)。优选地，所述试剂盒中的所有试剂均为干粉。最后，本发明提供一种采用上述试剂盒来检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤：步骤a、将经过核酸提取步骤的待检测样本、阴性参考品和阳性参考品均加入荧光pcr反应体系；步骤b、在步骤a中的荧光pcr反应体系中应用引物对1、探针1、引物对2、探针2对待检测样本进行荧光pcr扩增反应，获得扩增曲线；步骤c、分析步骤b中的扩增曲线，如果探针1有扩增曲线，则表明待检测样本中含有结核分支杆菌；如果探针2有扩增曲线，则表明待检测样本中含有非结核分枝杆菌。优选地，所述待检测样本为收集于胸科医院结核病患者的痰液样本。优选地，所述待检测样本的核酸提取步骤如下：取1毫升待检测样本加入核酸提取试剂，600w超声破碎3分钟，去掉液体，加入200微升洗脱液；所述阴性参考品和阳性参考品的核酸提取步骤与所述待检测样本的核酸提取步骤相同。优选地，所述荧光pcr扩增的程序为：50度2分钟；95度10分钟；40个循环95度10秒钟，55度45秒，与55度45秒收集fam和hex荧光信号。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：利用了不同分枝杆菌的基因序列的差异来设计荧光探针，能够一次性区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，此检测方法用时短、分类更准确可靠，解决了现有技术中检测方法繁琐且耗时长的问题。附图说明图1是检测结核分枝杆菌标准株的扩增曲线图；图2是检测非结核分枝杆菌的扩增曲线图，所述非结核分枝杆菌具体为脓肿分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌。具体实施方式本发明提供了一种用于检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的组合物，包括由seqidno.1和seqidno.2所组成的结核分枝杆菌引物对1；由seqidno.3和seqidno.4所组成的非结核分枝杆菌引物对2；seqidno.5的结核分枝杆菌的探针1；seqidno.6的非结核分枝杆菌的探针2，同时提供了含有上述引物和探针的试剂盒，并提供了利用上述试剂盒检测是否存在结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的方法。下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。实施例1检测结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌试剂盒包含核酸提取试剂、荧光pcr反应体系、阴性参考品、阳性参考品和说明书，试剂盒中所有试剂均为干粉，其规格如下表所示。表3结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的核酸检测试剂盒名称规格核酸提取试剂48管/盒荧光pcr反应体系48管/盒阴性参考品1管/盒阳性参考品1管/盒说明书1份/盒上述的荧光pcr反应体系中包含缓冲液、1.5mmmg2+、1utaqdna聚合酶、20uung、0.2mmdutp、0.2mmdntp、0.2mm引物对1、0.2mm探针1、0.2mm引物对2、0.2mm探针2等。上述引物对1和探针1用于检测结核分枝杆菌，引物对1包含seqidno.1和seqidno.2所示序列，探针1包含seqidno.5所示序列；上述引物对2和探针2用于检测非结核分枝杆菌，引物对2包含seqidno.3和seqidno.4所示序列；探针2包含seqidno.6所示序列；探针1和探针2均为为荧光探针，其序列5'-端带有荧光基团，3'-端带有淬灭基团；探针1的荧光基团为hex，淬灭基团为bhq1；探针2的荧光基团为fam，淬灭基团为bhq1，引物及探针设计如下表所示。表4引物和探针设计序列编号名称序列(5'-3')seqidno.1引物cgaagtcgtaacaaggtagseqidno.2引物agcccaaiagtgtgicigseqidno.3引物ctactacgaccacatcaseqidno.4引物ccgtaaacaccgtagttgseqidno.5探针hex-ctgatgtgctccttgagttcgcca-bhq1seqidno.6探针fam-tgcggctggatcacctcctt-bhq1注：“i”为脱氧次黄嘌呤核苷酸(seqidno.2)。实施例2本实施例为采用实施例1中所述的试剂盒来检测结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法，其包括如下步骤：1)待检测样本的核酸提取步骤采用结核分枝杆菌标准株、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌及痰液样本(收集于胸科医院结核病患者痰液)，痰液经4％naoh液化后一份细菌培养鉴定(采用常规的医院实验室标准步骤)，一份核酸鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌感染。取1毫升液化痰液加入试剂盒中的核酸提取试剂(3m盐酸胍，5mnacl、10mmedta和1％sds)，600w超声破碎3分钟，去掉液体，加入200微升洗脱液，获得待检测样本。阴性和阳性参考品与待检测样本同样操作。分别吸取50微升的待检测样本、阴性参考品和阳性参考品加入到荧光pcr反应体系中，瞬时离心上机。2)荧光pcr扩增反应及结果分析在荧光pcr反应体系中应用引物对1、探针1、引物对2、探针2对待检测样本进行荧光pcr扩增反应，获得扩增曲线。荧光pcr扩增程序：abi荧光pcr7500上进行反应检测，扩增程序：50度2分钟；95度10分钟；40个循环95度10秒钟，55度45秒，与55度45秒收集fam和hex荧光信号。结果分析：1)如图1所示，检测结核分枝杆菌标准株，hex通道观察到“s”扩增曲线，fam通道无扩增曲线；2)如图2所示，脓肿分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌fam通道观察到扩增曲线，hex通道无扩增曲线；3)50例痰液样本细菌培养结果与核酸检测结果一致。由上述实施例可知，本发明所述的方法能够一次性区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，此检测方法用时短、分类更准确可靠，解决了现有技术中检测方法繁琐且耗时长的问题。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。<110>河北省胸科医院；苏州斯奈普生物科技有限公司<120>用于检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的试剂盒及方法<160>6<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>1cgaagtcgtaacaaggtag19<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物，“i”为脱氧次黄嘌呤核苷酸<400>2agcccaaiagtgtgicig18<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>3ctactacgaccacatca17<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>4ccgtaaacaccgtagttg18<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>dna探针<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