结核分枝杆菌检测试剂盒及其使用方法

专利名称：结核分枝杆菌检测试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其使用方法。
背景技术：
以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在 一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染 和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real timePCR)技术虽然较 好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此 不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较 高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定 性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技 术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增 (IsothermalAmplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已 建立起来的环介导恒温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性。对于结核分枝杆菌的快速检测技术也有一定的研究，例如中国ZL200810028441. 7 号发明专利“基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒及其检测方 法”。该专利针对结核分枝杆菌的重复性因子插入序列6110进行检测。重复性因子插入序 列是一段能在染色体上进行转座的遗传因子，一般在染色体上存在多个拷贝，如6110是在 中发现的插入序列，该因子的长度为1361，是一功能性转座因子，其序列与肠杆菌科的3家 族有同源性。选择6110上不同寡核苷酸作为引物进行扩增，发现只有群内有扩增带，且不 同种其拷贝数也不同，在人型结核杆菌中有10 20个拷贝。牛型分枝杆菌中只有1个拷 贝，田鼠分枝杆菌中有10 20个拷贝。高拷贝数的靶序列有利于提高扩增反应的灵敏度， 而报道了在越南和东南亚地区分离到的一些人型结核杆菌中缺乏该因子。因此，以重复性 因子插入序列6110作为广泛的结核分枝杆菌诊断靶序列，有可能使得其结果有漏检。因此，需要一种检测效果更全面、漏检率低的结核分枝杆菌检测试剂盒及其使用 方法以解决上述问题。

发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种检测效果更全面、漏检率 低的结核分枝杆菌检测试剂盒。本发明的目的可以通过以下技术措施实现一种结核分枝杆菌检测试剂盒，所述 的结核分枝杆菌检测试剂盒包括以结核分枝杆菌复合群的gyrB基因为靶基因、基于环介 导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。单拷贝的gyrB是普遍存在于细菌中编码促旋酶B亚单位的基因，该基因进化速 率快，每100万年的平均碱基替换率为0. % 0. 8%。该区段基因能对假单胞菌、芽孢杆
5菌、弧菌、肠杆菌、分枝杆菌、气单胞菌、乳酸菌等不同属或科内的近缘种进行区分鉴定，还 可通过设计种特异性引物进行定量PCR或者限制性片段分析。本发明针对结核分枝杆菌复 合群的gyrB(即DNA促旋酶的B亚单位蛋白，其在NCBI上的编号为GQ247736. 1)基因设 计引物，由于该基因高度保守并广泛存在于各结核分枝杆菌菌种中，因此其引物能够扩增 并检测出结核分枝杆菌复合群所有菌种，包括M. tuberculosis, Μ. microti, Μ. africanum, Μ. bovis0作为本发明结核分枝杆菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的两对引物为外引物F3: (SEQ ID NO 1)ACCACGGAATACGACTTCGA外引物B3 (SEQ ID NO 2)AGTGAAAGGTGCGGCTCT内引物 FIP: (SEQ ID NO 3)GGTCACCCTCTCGTCGGTCAttttGCAAGAGATGGCGTTCCTC内引物 BIP:(SEQ ID NO 4)GAAGTGGTCAGCGACGTCGCttttTAACTTTGTGCGGTGCAGTG或外引物F3， (SEQ ID NO 5)GGGTACGAGTGGTCTCAGG外引物B3， (SEQ ID NO 6)CGTCTTGGGTCACCCTCT内引物 FIP， (SEQ ID NO 7)ACCGTTGACCCCGTCTTCTTGttttAGAAGTCGGAACCCCTGG内引物 BIP， (SEQ ID NO 8)ATACGACTTCGAAACCGTCGCCttttGGTCAGCCCCTTGTTGAG ；或外引物F3”(SEQ ID NO 1)ACCACGGAATACGACTTCGA外引物B3”(SEQ ID NO 2)AGTGAAAGGTGCGGCTCT内引物 FIP”(SEQ ID NO 9)GGTCACCCTCTCGTCGGTCAGCAAGAGATGGCGTTCCTC内引物 BIP”(SEQ ID NO 10)GAAGTGGTCAGCGACGTCGCTAACTTTGTGCGGTGCAGTG ；或外引物F3”， (SEQ ID NO 5)GGGTACGAGTGGTCTCAGG外引物B3”， (SEQ ID NO 6)CGTCTTGGGTCACCCTCT内引物 FIP”， (SEQ ID NO 11)
ACCGTTGACCCCGTCTTCTTGAGAAGTCGGAACCCCTGG内引物 BIP”， (SEQ ID NO 12)ATACGACTTCGAAACCGTCGCCGGTCAGCCCCTTGTTGAG。作为本发明结核分枝杆菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的结核分枝杆菌检测 试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、裂解液1、裂解液2、裂解液3、稳定液、反应液、显色液和阳性 对照液。作为本发明结核分枝杆菌检测试剂盒的更优选实施方式，所述的反应液每IL中 含有 1. 6 2mmol dNTP、20 25mmol Tris-ClUO 12. 5mmol 氯化钾、10 12. 5mmol 硫 酸铵、8 IOmmol 硫酸镁、1 1. 25mL TritonX_100、0. 8 Imol 甜菜碱、内引物 FIP/BIP 各1. 6 2mol和外引物F3/B3各0. 2 0. 25mol ；所述的裂解液1 每 IL 中含有 0. 1-0. 2mol NaOH,5 IOmL Triton X-100 ；所述的裂解液2为蛋白酶K ；所述的裂解液3每IL中含有ρΗ7· 5的0. 5-lmol Tris-HCl ；所述的显色液为SYBR Green I 或 Eva Green ；所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为结核分枝杆菌基因组DNA。作为本发明结核分枝杆菌检测试剂盒的最优选实施方式，所述的反应液每IL中 含有 2mmol dNTP、25mmol Tris_Cl、12. 5mmol 氯化钾、12. 5mmol 硫酸铵、IOmmol 硫酸镁、 1. 25mL TritonX-IOOUmol 甜菜碱、内引物 FIP/BIP 各 2mol 和外引物 F3/B3 各 0. 25mol ；所述的裂解液1 每 IL 中含有 0. Imol pH9. 5 的 NaOH 和 5mL Titon X-100 ；所述的裂解液3每IL中含有Imol pH7. 5的Tris-HCl。作为本发明结核分枝杆菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的结核分枝杆菌检测 试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其 分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。作为本发明结核分枝杆菌检测试剂盒的更优选实施方式，所述的A、B两个空腔中 分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为反应液 和Bst DNA聚合酶的混合而成。环介导恒温扩增技术(LAMP)是一种快速、灵敏、准确的核酸检测方式，其扩增效 率超强，表现在两个方面(1)灵敏度比PCR高出的是数量级的差异；(2)扩增产物的DNA数 量，也比PCR产物高出太多，能够达到几个μ g，但过于灵敏和产物量的巨大，使得LAMP极易 容易污染，尤其是在LAMP扩增反应后需要反应管开盖加入显色剂，容易出现气溶胶污染。 而气溶胶污染会使得检测结果假阳性率高，并且污染其他样品，污染检测区域，同时还难以 去除。本发明的反应管通过隔板和稳定液的设计，有效地将显色液和工作液分隔开来，不仅 能保证在储运过程中相对保持完整封闭性，而且无需打开管盖，就可以实现显色反应，大大 降低气溶胶的污染。本发明还提供一种使用结核分枝杆菌检测试剂盒的方法，该方法包括如下步骤(1)将待测痰样品液化后于离心管中离心，去上清，收集沉淀；生理盐水洗涤沉淀 2次，去上清，收集沉淀；(2)在裂解液1中加入裂解液2，吹打混勻后，加入上述沉淀中，温浴后，沸水浴裂
7解，然后加入裂解液3混勻离心，上清即为样品模板DNA ；(3)在反应容器中加入反应液38 40体积％、Bst DNA聚合酶0. 9 1. 8体积％、 稳定液52 54. 5体积％、样品模板DNA 4. 5 9体积％，恒温反应；所述体积百分比是指 占四个组分总体积的体积百分比；(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相 同则为阳性，否则为阴性；所述步骤(3)中的反应液含有以结核分枝杆菌复合群的gyrB基因为靶基因、基于 环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。作为本发明使用结核分枝杆菌检测试剂盒的方法的优选实施方式，所述步骤(1) 中的液化为加入质量百分数4% NaOH溶液或胰酶对痰样进行液化。作为本发明使用结核分枝杆菌检测试剂盒的方法的优选实施方式，所述步骤(2) 中，温浴温度为56 60°C，温浴时间为30min 300min。沸水裂解温度为95 100°C，裂 解时间为10 20min ；步骤(3)中，恒温反应的反应条件为温度63 65°C，反应时间45 90mino本发明所说的基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称LAMP)快速检测结核分枝杆菌的方法，是利用Bst DNA聚合酶和 根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性 识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果 在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎_环DNA混合物。LAMP反应 过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁 乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63 65°C )条件下45 90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传 统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员 的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本 低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩 增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特 异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即 可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以 微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴 定需2 3天，完成鉴定报告需10 15天；采用本发明的检测试剂盒仅需2小时。并且， 本发明的反应体系中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明的检测试剂盒只需一个恒 定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试 剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高 特异性；3.本发明的检测试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高； 4.本发明的检测试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断 试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物—— 焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证 率高，更加明显可靠；6.由于选择了高保守性的gyrB基因作为靶基因设计引物，使得本发明的检测试剂盒检测结核分枝杆菌的准确率更高；7.在本发明检测试剂盒中采用特制的 反应管，减少了气溶胶污染的可能性，同时方便操作。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。实施例1试剂盒的制备(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物外引物F3: (SEQ ID NO 1)ACCACGGAATACGACTTCGA外引物B3 (SEQ ID NO 2)AGTGAAAGGTGCGGCTCT内引物 FIP: (SEQ ID NO 3)GGTCACCCTCTCGTCGGTCAttttGCAAGAGATGGCGTTCCTC内引物 BIP: (SEQ ID NO 4)GAAGTGGTCAGCGACGTCGCttttTAACTTTGTGCGGTGCAGTG(2)购置DNA聚合酶Bst DNA聚合酶置于容器；(3)配制反应液反应液按每 IL 中含有 2mmol dNTP、25mmol Tris-Cl、12. 5mmol 氯 化钾、12. 5mmol 硫酸铵、IOmmol 硫酸镁、1. 25mL TritonX-100、Imol 甜菜碱、内引物 FIP/BIP 各2mol和外引物F3/B3各0. 25mol配制，置于容器；(4)配制裂解液1 裂解液1按每IL裂解液1中含有0. 1-0. 2mol NaOH,5 IOmL TritonX-100 ；(5)配制上述裂解液2 :裂解液2按ImL含50 μ g蛋白酶K配制；(6)配制裂解液3 裂解液3按每IL裂解液3中含有pH7. 5的0. 5-lmolTris-HCl ；(7)购置稳定液石蜡油，置于容器；(8)购置显色液SYBR Green I，置于容器；(9)提取阳性对照结核分枝杆菌基因组DNA，置于容器；(10)将上述8个容器装成试剂盒，封装；制备工艺简述如下1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质 检；2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；3、将稳定液分装，抽样质检；4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；5、组装试剂盒。实施例2试剂盒的制备反应液按每IL 中含有 1. 6mmol dNTP、20mmol Tris-ClUOmmol 氯化钾、IOmmol 硫 酸铵、8mmol硫酸镁、ImL TritonX-100,0. 8mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1. 6mol和外引物 F3/B3各0. 2mol配制，置于容器。上述每IL 裂解液 3 中含有 pH7. 5 的 0. 5-lmol Tris-HCl0
显色液为 EvaGreen。其他同实施例1。实施例3试剂盒的制备其他条件与实施例1相同，其不同仅在于步骤(1)中的引物为外引物F3， (SEQ ID NO 5)GGGTACGAGTGGTCTCAGG外引物B3， (SEQ ID NO 6)CGTCTTGGGTCACCCTCT内引物 FIP， (SEQ ID NO 7)ACCGTTGACCCCGTCTTCTTGttttAGAAGTCGGAACCCCTGG内引物 BIP， (SEQ ID NO 8)ATACGACTTCGAAACCGTCGCCttttGGTCAGCCCCTTGTTGAG。在本发明的其他实施例中，可以针对结核分枝杆菌复合群的gyrB基因，根据LAMP 技术的引物设计原则设计得到其他的引物。实施例4试剂盒的制备其他条件与实施例1相同，其不同仅在于步骤(1)中的引物为外引物F3”(SEQ ID NO 1)ACCACGGAATACGACTTCGA外引物B3”(SEQ ID NO 2)AGTGAAAGGTGCGGCTCT内引物 FIP”(SEQ ID NO 9)GGTCACCCTCTCGTCGGTCAGCAAGAGATGGCGTTCCTC内引物 BIP”(SEQ ID NO 10)GAAGTGGTCAGCGACGTCGCTAACTTTGTGCGGTGCAGTG。实施例5试剂盒的制备其他条件与实施例1相同，其不同仅在于步骤⑴中的引物为外引物F3”， (SEQ ID NO 5)GGGTACGAGTGGTCTCAGG外引物B3”， (SEQ ID NO 6)CGTCTTGGGTCACCCTCT内引物 FIP”， (SEQ ID NO 11)ACCGTTGACCCCGTCTTCTTGAGAAGTCGGAACCCCTGG内引物 BIP”， (SEQ ID NO 12)ATACGACTTCGAAACCGTCGCCGGTCAGCCCCTTGTTGAG。实施例6结核分枝杆菌检测试剂盒的应用一、方法和材料1、菌株本研究所用菌株有30株，主要来源于美国标准生物品收藏中心、中国药品生物制 品检定所。详见表1。
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表1菌株名称及来源菌株来源菌株及编号M. tuberculosis H37Rv (27294) > Μ. kansassi(12478) >Μ. intracellulare(13950)、Μ·chelonae(14472) > Μ. fortuitum(6481)、Μ· gordonae(14470)、Μ. aurum (23366)、Μ. neoaurum(25795)、Μ. marinum (927)、Μ. gilvum (43909)、Μ. aichiense(27280)、Μ. microti (19422)、美国标准生物品Μ· smegmatis (19420)、Μ· parofortuitum(19686)、收藏中心(ATCC) Μ· terrae (19619)、Μ· nonchromogenicum(19530)、Μ. vaccae (15483)、Μ. avium(25291)、M.phlei (11758)、Μ· scrofulaceum(19981)、Μ. gastri (15754)、Μ. triviale (23292)、Μ. xenopi (19250)、Μ. abscessus (19977)、Μ. africanum(25420)、Μ. ulcerans (19423)、Μ. bovis (19210) > Μ. malmoense (29571)；其它Μ. bovis BCG2、样品处理(模板DNA提取)(1)吸取培养菌液lmL，12000rpm离心2min，获得菌体沉淀；(2)在上述菌体沉淀中加入100 μ L DNA提取液I，沸水浴lOmin，加入12. 5 μ LDNA 提取液II，稍混勻；12000r/min离心2min，上清即为即为样品模板DNA。3、环介导恒温扩增技术的反应过程(1)在200 μ L反应管配制反应体系反应液22 μ L，Bst DNA聚合酶0. 5 μ L (4U)， 稳定液30 μ L，模板DNA2. 5 μ L。(2)将配制好的反应管于65°C恒温反应lh。4、反应后处理向上述反应产物中加入2μ L SYBR Green I，混勻，同时也向阳性对照管中加入 SYBR Green I混勻，若反应管与对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管显现橙色则为阴性。5、特异度试验纯菌株LAMP检测用LAMP方法对30株菌株进行扩增，根据显色反应观察结果，绿 色为阳性，橙色阴性，验证方法特异性。6、灵敏度试验将M. tuberculosis H37Rv (27294)精提核酸，用TE 10倍倍比连续 梯度稀释至10-12，进行LAMP检测。7、重复性试验特异度试验和灵敏度试验分别重复2次。二、结果1、特异度试验本次检测样本共32例，其中ATCC标准菌株30株，1个结核疫苗BCG， 1个纯水。M. tuberculosis H37RV (27294)检测结果阳性，3株结核分枝杆菌复合群阳性， BCG阳性，27株非结核分枝杆菌均阴性。检测结果如表2。
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表2检测结果
权利要求
一种结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述的结核分枝杆菌检测试剂盒包括以结核分枝杆菌复合群的gyrB基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。
2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述的两对引物为 外引物F3 ACCACGGAATACGACTTCGA 外引物B3 AGTGAAAGGTGCGGCTCT 内引物FIP GGTCACCCTCTCGTCGGTCAttttGCAAGAGATGGCGTTCCTC 内引物BIP GAAGTGGTCAGCGACGTCGCttttTAACTTTGTGCGGTGCAGTG ； 或外引物F3， GGGTACGAGTGGTCTCAGG 外引物B3， CGTCTTGGGTCACCCTCT 内引物FIP，ACCGTTGACCCCGTCTTCTTGttttAGAAGTCGGAACCCCTGG 内引物BIP’ ATACGACTTCGAAACCGTCGCCttttGGTCAGCCCCTTGTTGAG ； 或外引物F3” ACCACGGAATACGACTTCGA 外引物B3” AGTGAAAGGTGCGGCTCT 内引物FIP”GGTCACCCTCTCGTCGGTCAGCAAGAGATGGCGTTCCTC 内引物BIP”GAAGTGGTCAGCGACGTCGCTAACTTTGTGCGGTGCAGTG ； 或外引物F3”’ GGGTACGAGTGGTCTCAGG 外引物B3”， CGTCTTGGGTCACCCTCT 内引物FIP”’ ACCGTTGACCCCGTCTTCTTGAGAAGTCGGAACCCCTGG 内引物BIP”’ ATACGACTTCGAAACCGTCGCCGGTCAGCCCCTTGTTGAG。
3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述的结核分枝杆 菌检测试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、裂解液1、裂解液2、裂解液3、稳定液、反应液、显色液 和阳性对照液。
4.根据权利要求3所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述的反应液每 IL 中含有 1. 6 2mmol dNTP、20 25mmol Tris-ClUO 12. 5mmol 氯化钾、10 12. 5mmol 硫酸铵、8 IOmmol 硫酸镁、1 1. 25mL TritonX_100、0. 8 Imol 甜菜碱、内引物FIP/BIP各1. 6 2mol和外引物F3/B3各0. 2 0. 25mol ；所述的裂解液 1 每 IL 中含有 0. 1-0. 2mol NaOH,5 IOmL Triton X-100 ；所述的裂解液2为蛋白酶K;所述的裂解液3每IL中含有pH7. 5的0. 5-lmol Tris-HCl ；所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green ；所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为结核分枝杆菌基因组DNA。
5.根据权利要求4所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述的反应液每 IL 中含有 2mmol dNTP、25mmol Tris-Cl、12. 5mmol 氯化钾、12. 5mmol 硫酸铵、IOmmol硫酸镁、1. 25mL TritonX-IOOUmol甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol和外引 物 F3/B3 各 0. 25mol ；所述的裂解液1每IL中含有0. Imol ρΗ9· 5的NaOH和5mL Triton X-IOO ；所述的裂解液3每IL中含有Imol pH7. 5的Tris-HCl。
6.根据权利要求3、4或5所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述的结核分 枝杆菌检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下 部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。
7.根据权利要求6所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述的A、B两个空 腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为反 应液和Bst DNA聚合酶的混合而成。
8.一种使用如权利要求3所述的结核分枝杆菌检测试剂盒的方法，其特征在于，该方 法包括如下步骤(1)将待测痰样品液化后于离心管中离心，去上清，收集沉淀；生理盐水洗涤沉淀2次， 去上清，收集沉淀；(2)在裂解液1中加入裂解液2，吹打混勻后，加入上述沉淀中，温浴后，沸水浴裂解，然 后加入裂解液3混勻离心，上清即为样品模板DNA ；(3)在反应容器中加入反应液38 40体积％、BstDNA聚合酶0. 9 1. 8体积％、稳 定液52 54. 5体积％、样品模板DNA 4. 5 9体积％，恒温反应；(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相同则 为阳性，否则为阴性；所述步骤(3)中的反应液含有以结核分枝杆菌复合群的gyrB基因为靶基因、基于环介 导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。
9.根据权利要求8所述的使用结核分枝杆菌检测试剂盒的方法，其特征在于，步骤(1) 中的液化为加入质量百分数4% NaOH溶液或胰酶对痰样进行液化。
10.根据权利要求8或9所述的使用结核分枝杆菌检测试剂盒的方法，其特征在于， 步骤(2)中，温浴温度为56 60°C，温浴时间为30min 300min。沸水裂解温度为 95 100°C，裂解时间为10 20min ；步骤(3)中，恒温反应的反应条件为温度63 65°C，反应时间45 90min。
全文摘要
本发明提供一种结核分枝杆菌检测试剂盒，所述的结核分枝杆菌检测试剂盒包括以结核分枝杆菌复合群的gyrB基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明的结核分枝杆菌检测试剂盒检测效果更全面、漏检率低。
文档编号C12Q1/68GK101935693SQ20101001945
公开日2011年1月5日 申请日期2010年1月18日 优先权日2010年1月18日
发明者冯雪梅, 尹斌, 戴广明, 曹以诚, 杜正平, 柯佳佳, 田文武, 谭慧媚, 赵雁林, 陈洵 申请人:广州华峰生物科技有限公司