一种直接对微小核糖核酸675(microRNA675)进行半定量的试剂盒的制作方法

本发明涉及医学和分子生物学技术领域中的一种直接对微小核糖核酸675（microRNA675)进行半定量的试剂盒。

背景技术：

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，在细胞发育、凋亡、分化、增殖等重要的生理病理过程中发挥重要作用。研究发现，人的体液中如血液、尿液、唾液、羊水、胸腹水等广泛存在microRNA，这些microRNA的表达谱与在组织细胞中一样，在肿瘤等病理状态下会发生特征性的改变，这些特定的 microRNA表达谱是肿瘤细胞特异性生物标志物之一，是一种新的无创伤性诊断标志物以助于疾病的预测、诊断和预后。传统的microRNA检测方法包括印迹杂交技术（Northern Blotting），以及反转录与实时定量PCR（realtime PCR）联合应用，这些方法比较成熟且广为使用，但是存在着过程繁琐、价格昂贵、耗时较长、灵敏度低、易出现假阳性结果等缺陷，日益无法满足当前的检测需要。

诸多研究显示，MircroRNA675在胃癌癌、膀胱癌、肝癌及结肠癌等恶性肿瘤中高表达，通过CALN1、RUNX、Hedgehog等信号通路发挥促癌基因的作用。由于microRNA能够以少量游离的形式存在于外周血中，因此MircroRNA675可作为肿瘤标志物用于对某些恶性肿瘤的早期筛查。因此，研究开发一种直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒一直急待解决的新课题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒，该发明用于对体外细胞培养、离体组织、血液等样本提取的总mircroRNA675中的某一种mircroRNA675的进行半定量检测，利用探针进行mircroRNA675的半定量检测，无需反转录及任何扩增技术，只需将少量样本直接加入反应体系中，50-65 ℃恒温5-30分钟，检测荧光强度即可，荧光强度累积速率与mircroRNA675浓度成正比。

本发明的目的是这样实现的：一种可直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒，用于对总RNA中的某一种微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量检测，所述的一种可直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒包含的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针和一种含DNA链置换酶的杂交缓冲液；

所述的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针由A、B链两条长度不同的寡核苷酸单链组装而成，A链较长，B链较短，其中A链核苷酸序列为SEQ ID NO.1： 5’ROX-GCCTCGGTGAGCGGTGAGGGCATACAGCCGAGGCT(-BHQ2)CTCCAGACGTCACTCAGTGCACC-3’，序列中的ROX为荧光基团，BHQ2为淬灭基团；B链的核苷酸序列为SEQ ID NO.2：5’-GGTGCACTGAGTGACGTCTGGAGAG-3’；探针初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”不是DNA链置换酶能够催化的空间结构，而变形后的一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构是DNA链置换酶能够催化的空间结构；

所述的一种含DNA链置换酶的杂交缓冲液，杂交温度在55-65 ℃之间，由Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase 32 U、MgSO4 10 mM、dNTP Mix 1 mM/种、Tris-HCl 20 mM、(NH4)2SO4 10 mM、KCl 50 mM组成，其中MgSO4 浓度可以在5-20 mM之间调整；在该杂交条件下，能够触发探针从初始“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”变形为一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构的唯一条件是探针的“多功能茎环结构”中的外环结构与微小核糖核酸675（microRNA675）发生特异性结合；

所述的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针的荧光基团与淬灭基团的修饰位置，荧光基团修饰在探针A链的5’端核苷酸上，淬灭基团修饰在5’端的互补位核苷酸或相邻的核苷酸上；这样修饰后，探针在初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”时，荧光基团与淬灭基团空间距离小于10nm，将会发生荧光共振能量转移，导致荧光被淬灭，故探针在初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”时，因此检测不到荧光。当探针变形为一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构时，荧光基团与淬灭基团之间空间距离远大于10 nm，不能发生荧光共振能量转移，荧光基团不能被淬灭，故可检测到荧光；每当“靶序列的出现→与探针结合→探针变形→链延伸→链置换→靶序列重新游离”循环反应一次，被打开探针的量就增加一个靶序列原始量，靶序列的原始量越大，单位时间内发出荧光的探针量就越大，即荧光强度的累积速率与靶序列浓度成正比；因此，探针具有自身信号放大功能，极微量靶序列的存在也能够被检测到，不需要进行扩增；

所述的一种可直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒用于对总RNA中的某一种微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量检测是通过如下步骤来实现的：

（1）取浓度为10 μM的探针1 μL，加入到12 μL含DNA链置换酶2μL的杂交缓冲液中，混匀；

（2）向上述液体其中加入5 μL样本，混匀后送realtimePCR仪检测；

（3）检测条件通常为60 ℃恒温30分钟，检测温度及检测时间和可根据具体情况在50-65 ℃、5-30分钟之间调整；

（4）结果分析，荧光强度累积速率与样本中目的微小核糖核酸675（microRNA675）含量成正比，检测结果判定的方法有两种，当待测样本中目的微小核糖核酸675（microRNA675）含量较低时，相同时间内荧光强度值越高的样本，其目的微小核糖核酸675（microRNA675）的含量越高；当待测样本中目的微小核糖核酸675（microRNA675）含量较高时，达到相同荧光强度值所用时间越短的样本，其微小核糖核酸675（microRNA675）的含量越高；

所述的一种可直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒利用这种空间结构的进行微小核糖核酸675（microRNA675）的半定量检测的工作原理是，微小核糖核酸675（microRNA675）启动的自身信号循环放大反应”：初始结构的探针（无荧光信号）→微小核糖核酸675（microRNA675）的出现→与探针结合后引发探针变形（变形后发出荧光信号，非微小核糖核酸675（microRNA675）不引起探针变形）→链延伸→链置换（初始结构探针不会发生链延伸及链置换反应）→微小核糖核酸675（microRNA675）重新游离→再次引起其它初始形态的探针变形（自身信号循环放大）。

本发明的要点在于检测微小核糖核酸675（microRNA675）的探针所具有的非天然空间结构——“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”及利用这种空间结构的进行微小核糖核酸675（microRNA675）的半定量检测的工作原理。

一种直接对微小核糖核酸675（microRNA675)进行半定量的试剂盒与现有技术相比，其有益效果是：直接向检测体系中加入原始样本——总微小核糖核酸（microRNA）提取液，无需对微小核糖核酸675（microRNA675）进行反转录及扩增；检测限极低，可检出1.0*10^-18mol的微小核糖核酸675（microRNA675）；特异性高，100倍单碱基错配序列无干扰，亦不受样本中DNA杂质的干扰；操作极其简便，只需一步加样操作即可送检；检测时间短，只需5-30分钟；可广泛地应用于医学和分子生物学技术领域中。

下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。

附图说明

图1是本发明的检测原理图。

图2是以mircroRNA675作为靶序列的探针A链的二级结构预测图。

图3是检测microRNA675的探针的初始空间结构图。

图4 是检测不同含量mircroRNA675作为靶序列的探针灵敏度考察——对不同含量的microRNA675标准品进行半定量分析。

图5 是探针特异性考察——加入含量高于microRNA675 100倍的单碱基错配序列的检测结果。

具体实施方式

参照附图，一种可直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒，用于对总RNA中的某一种微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量检测，所述的一种可直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒包含的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针和一种含DNA链置换酶的杂交缓冲液。

所述的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针由A、B链两条长度不同的寡核苷酸单链组装而成，A链较长，B链较短，其中A链核苷酸序列为SEQ ID NO.1： 5’ROX-GCCTCGGTGAGCGGTGAGGGCATACAGCCGAGGCT(-BHQ2)CTCCAGACGTCACTCAGTGCACC-3’，序列中的ROX为荧光基团，BHQ2为淬灭基团；B链的核苷酸序列为SEQ ID NO.2：5’-GGTGCACTGAGTGACGTCTGGAGAG-3’；探针初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”不是DNA链置换酶能够催化的空间结构，而变形后的一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构是DNA链置换酶能够催化的空间结构。

所述的一种含DNA链置换酶的杂交缓冲液，杂交温度在55-65 ℃之间，由Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase 32 U、MgSO4 10 mM、dNTP Mix 1 mM/种、Tris-HCl 20 mM、(NH4)2SO4 10 mM、KCl 50 mM组成，其中MgSO4 浓度可以在5-20 mM之间调整；在该杂交条件下，能够触发探针从初始“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”变形为一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构的唯一条件是探针的“多功能茎环结构”中的外环结构与微小核糖核酸675（microRNA675）发生特异性结合。

所述的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针的荧光基团与淬灭基团的修饰位置，荧光基团修饰在探针A链的5’端核苷酸上，淬灭基团修饰在5’端的互补位核苷酸或相邻的核苷酸上；这样修饰后，探针在初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”时，荧光基团与淬灭基团空间距离小于10nm，将会发生荧光共振能量转移，导致荧光被淬灭，故探针在初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”时，因此检测不到荧光。当探针变形为一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构时，荧光基团与淬灭基团之间空间距离远大于10 nm，不能发生荧光共振能量转移，荧光基团不能被淬灭，故可检测到荧光；每当“靶序列的出现→与探针结合→探针变形→链延伸→链置换→靶序列重新游离”循环反应一次，被打开探针的量就增加一个靶序列原始量，靶序列的原始量越大，单位时间内发出荧光的探针量就越大，即荧光强度的累积速率与靶序列浓度成正比；因此，探针具有自身信号放大功能，极微量靶序列的存在也能够被检测到，不需要进行扩增。

所述的一种可直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒用于对总RNA中的某一种微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量检测是通过如下步骤来实现的：

（1）取浓度为10 μM的探针1 μL，加入到12 μL含DNA链置换酶2μL的杂交缓冲液中，混匀；

（2）向上述液体其中加入5 μL样本，混匀后送realtimePCR仪检测；

（3）检测条件通常为60 ℃恒温30分钟，检测温度及检测时间和可根据具体情况在50-65 ℃、5-30分钟之间调整；

（4）结果分析，荧光强度累积速率与样本中目的微小核糖核酸675（microRNA675）含量成正比，检测结果判定的方法有两种，当待测样本中目的微小核糖核酸675（microRNA675）含量较低时，相同时间内荧光强度值越高的样本，其目的微小核糖核酸675（microRNA675）的含量越高；当待测样本中目的微小核糖核酸675（microRNA675）含量较高时，达到相同荧光强度值所用时间越短的样本，其微小核糖核酸675（microRNA675）的含量越高。

所述的一种可直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒利用这种空间结构的进行微小核糖核酸675（microRNA675）的半定量检测的工作原理是，微小核糖核酸675（microRNA675）启动的自身信号循环放大反应”：初始结构的探针（无荧光信号）→微小核糖核酸675（microRNA675）的出现→与探针结合后引发探针变形（变形后发出荧光信号，非微小核糖核酸675（microRNA675）不引起探针变形）→链延伸→链置换（初始结构探针不会发生链延伸及链置换反应）→微小核糖核酸675（microRNA675）重新游离→再次引起其它初始形态的探针变形（自身信号循环放大）。

实施例一

对不同含量的mircroRNA675标准品进行半定量分析。

步骤一：探针的设计及二级结构预测，mircroRNA675核苷酸序列为SEQ ID NO.3：5’CTGTATGCCCTCACCGCTCA 3’。A链核苷酸序列为SEQ ID NO.1： 5’ROX-G^LC^LC^LTCGGTGAGCGGTGAGGGCATACAGCCGAGGCT(-BHQ2)CTCCAGACGTCACTCAGTGCACC-3’，B链的核苷酸序列为SEQ ID NO.2：5’-GGTGCACTGAGTGACGTCTGGAG

AG-3’。单下划线的序列互补，5’端修饰ROX（红色荧光基团），双下划线的T修饰BHQ2（荧光淬灭基团），带有右上角标L的核苷酸为锁核酸，锁核酸的修饰只用于增加探针初始结构的热稳定性，降低背景荧光，无其它作用。由http://sg.idtdna.com/UNAFold提供的A链二级结构预测结果以及ΔG= -2.85，表明该二级结构可自发形成。如图2所示，从5’端第2个碱基C到第33个碱基G为预期的“多功能茎环结构”。从第34个碱基T到3’端是无二级结构的线性单链，作为B链的结合域，无二级结构的线性单链有利于B链的快速结合。A链二级结构预测结果与设计预期完全一致。参见图2是本发明的软件预测的A链二级结构图。B链经相同软件预测，ΔG最小值为1.15，表明B链为无二级结构的线性单链。其3’端C的结合位点为A链5’端第33个碱基G，已经被“多功能茎环结构” 5’端第2个碱基C优先占据，因此B链与A链结合后形成了B链3’端C为游离态的双螺旋结构，即“单侧3’悬端双螺旋结构”，参见图3 是本发明的mircroRNA675探针设计图。

步骤二：探针的合成，取浓度为100 μmol /L的A链冻干粉10 μL，加入到80 μL的PBS中95 ℃金属浴1分钟，取出后缓慢冷却至室温，静置10分钟，加入浓度为100 μmol /L的B链冻干粉10 μL，混匀后室温下静置10分钟，即得。

步骤三：取含有不同浓度的人工合成mircroRNA675模板的标准液1 μL，分别加入到200 μL乳白色八联管中，样本中mircroRNA675的含量分别为1.0*10^-12mol 、1.0*10^-13mol，1.0*10^-14mol，1.0*10^-15mol，1.0*10^-16mol，1.0*10^-17mol，1.0*10^-18mol，并用超纯水代替mircroRNA675做空白对照，所得结果即背景荧光值；

步骤四：向上述液体中加入浓度为10 μmol /L的探针1 μL以及杂交缓冲液18 μL，合计20 μL，混匀后送qPCR仪检测；

步骤五：检测条件为在60 ℃恒温30 分钟；

步骤六：结果分析。检测结果如图4所示，所有含有mircroRNA675的样本荧光值均显著高于空白对照，其中mircroRNA675含量为1.0*10^-18mol（1 amol）的荧光强度值高出空白对照约2倍；并且mircroRNA675含量越高的样本，荧光强度越强，反应时间越短，mircroRNA675含量为1.0*10^-12mol（1 pmol）的样本在10分钟时就已经达到反应终点，其荧光强度高出l空白对照一个数量级，充分显示了本专利技术具有极高的灵敏度。

从a到g分别代表样本中mircroRNA675的含量依次为：1.0*10^-12mol、1.0*10^-13mol 1.0*10^-14mol、1.0*10^-15mol、1.0*10^-16mol、1.0*10^-17mol、1.0*10^-18mol，最下面的曲线是空白对照。

实施例二

利用高浓度单碱基错配序列考察本方法的特异性

步骤一：mircroRNA675探针设计与合成，见实施例1的步骤一和步骤二，单碱基错配核苷酸序列为SEQ ID NO.4：5’ CTGTATGCTCTCACCGCTCA 3’，与mircroRNA675序列相比，仅一个碱基T有差异；

步骤二：分别取浓度为10 μmol /L的探针1 μL以及杂交缓冲液18 μL，合计19 μL，混匀后加入到200 μL乳白色八联管中；

步骤三：向A样本孔中加入mircroRNA675标准品1 μL，使样本中mircroRNA675的含量为1 pmol；向B样本孔中加入单碱基错配模板1 μL，使样本中单碱基错配模板的含量为100 pmol，两个样本总体积均为20 μL，即B样本中只有高于A孔100倍的单碱基错配模板，并不加入microRNA675，混匀后送realtimePCR仪检测，并用超纯水做空白对照；

步骤四：检测条件为在60 ℃恒温60 分钟（延长时间为了更清楚的显示本检测的特异性）；

步骤五：结果分析。检测结果如图5所示，A样本荧光值始终高于B样本一个数量级，探针在高浓度单碱基错配模板的干扰下，检测结果与背景荧光（C样本）无差异显示出了很高的特异性。对microRNA的已有研究显示，绝大多数的microRNA序列差异在2个碱基以上，故本专利技术对microRNA675具有超强的识别能力。

附图1是mircroRNA675探针的工作原理图，A：“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”（探针初始结构）；B：“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构（探针变形结构）；C：以A链为模板的完整双螺旋（反应最终结构）。

其工作原理为“microRNA675启动的自身信号循环放大反应”：初始结构的探针（无荧光信号）→microRNA675的出现→与探针结合后引发探针变形（变形后发出荧光信号，非microRNA675不引起探针变形）→链延伸→链置换（初始结构探针不会发生链延伸及链置换反应）→microRNA675重新游离→再次引起其它初始形态的探针变形（自身信号循环放大）。荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET），是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10纳米范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭)，而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。如图1， A中的荧光基团与荧光淬灭基团的空间距离小于10纳米，会发生FRET，导致荧光被淬灭，因此，检测不到荧光信号；而microRNA675的出现能够使A变形成B，荧光基团与荧光淬灭基团的空间距离远大于10纳米，FRET停止，荧光信号可被检测；DNA链置换酶可以催化B生成C，并且置换下已经结合的microRNA675，使其重新游离，这样microRNA675可以再次与其它初始形态的探针结合，实现自身信号循环放大。

附图2是以microRNA675作为靶序列的探针A链的二级结构预测图，A：外环结构；B：“占位茎杆结构”；C：线状单链结构。从5’端第1个核苷酸C到第7个核苷酸A，与第34个核苷酸G到第28个核苷酸T形成的7个碱基对的双螺旋为“占位茎杆结构”，其中第34个核苷酸G是B链3’悬端的互补位点；第8个核苷酸A到第28个核苷酸T的环状单链为外环结构；第35个核苷酸T到3’端为线状结构，是B链结合的域。“占位茎杆结构”、外环结构及线状单链结构三个结构域共同组成“多功能茎环结构”。

附图3是检测microRNA675的探针的初始空间结构图。，A：外环结构（环状闭合单链）；B：占位茎杆结构（双螺旋）；C：线状单链结构；D：单侧3’悬末端双螺旋结构（占位茎杆结构5’端+B链+线状单链结构）；E：该位置的C碱基为被占位茎杆结构5’端占领的3’悬端的结合位点；F：3’悬端。 A链形成的“多功能茎环结构”和B链形成的“单侧3’悬末端双螺旋结构”共同组成了探针的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”。A链的5’端修饰红色荧光染料ROX，互补位置的相邻T碱基修饰荧光淬灭基团BHQ2。

附图4是检测不同含量mircroRNA675作为靶序列的探针灵敏度考察——对不同含量的microRNA675标准品进行半定量分析。从a到g依次代表样本中microRNA675的含量为：1.0*10^-12mol、1.0*10^-13mol 1.0*10^-14mol、1.0*10^-15mol、1.0*10^-16mol、1.0*10^-17mol、1.0*10^-18mol，最下面的曲线是空白对照（水）。纵坐标为荧光强度值，横坐标为时间，单位是分钟。空白对照样本用超纯水代替microRNA675，所得结果即背景荧光值。

附图5加入含量高于microRNA675 100倍的单碱基错配序列的检测结果。A：对样本中只含有1 pmol 的microRNA675标准品的检测结果；B：对样本中含有1 pmol 的microRNA675标准品、100 pmol的单碱基错配序列及1 pmol双链DNA的检测结果；C：对样本中不含有microRNA675，但含有100 pmol的单碱基错配序列及双链DNA的检测结果；D：对空白对照样本的检测结果。纵坐标为荧光强度值，横坐标为时间，单位是分钟。空白对照样本用超纯水代替microRNA675，所得结果即背景荧光值。

序列表

<110> 中国医科大学

<120> 一种可直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcctcggtga gcggtgaggg catacagccg aggctctcca gacgtcactc agtgcacc 58

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtgcactga gtgacgtctg gagag 25

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgaatgccc tcaccgctca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgaatgctc tcaccgctca 20