一种直接对微小核糖核酸675(microRNA675)进行半定量的试剂盒的制作方法

文档序号:12645199阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种可直接对微小核糖核酸675(microRNA675)进行半定量的试剂盒,用于对总RNA中的某一种微小核糖核酸675(microRNA675)进行半定量检测,其特征在于:所述的一种可直接对微小核糖核酸675(microRNA675)进行半定量的试剂盒包含的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针和一种含DNA链置换酶的杂交缓冲液。

2.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸675(microRNA675)进行半定量的试剂盒,其特征在于:所述的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针由A、B链两条长度不同的寡核苷酸单链组装而成,A链较长,B链较短,其中A链核苷酸序列为SEQ ID NO.1: 5’ROX-GCCTCGGTGAGCGGTGAGGGCATACAGCCGAGGCT(-BHQ2)CTCCAGACGTCACTCAGTGCACC-3’, 序列中的ROX为荧光基团,BHQ2为淬灭基团;B链的核苷酸序列为SEQ ID NO.2:5’-GGTGCACTGAGTGACGTCTGGAGAG-3’;探针初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”不是DNA链置换酶能够催化的空间结构,而变形后的一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构是DNA链置换酶能够催化的空间结构。

3.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸675(microRNA675)进行半定量的试剂盒,其特征在于:所述的一种含DNA链置换酶的杂交缓冲液,杂交温度在55-65 ℃之间,由Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase 32 U、MgSO4 10 mM、dNTP Mix 1 mM/种、Tris-HCl 20 mM、(NH4)2SO4 10 mM、KCl 50 mM组成,其中MgSO4 浓度可以在5-20 mM之间调整;在该杂交条件下,能够触发探针从初始“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”变形为一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构的唯一条件是探针的“多功能茎环结构”中的外环结构与微小核糖核酸675(microRNA675)发生特异性结合。

4.根据权利要求1或2所述的一种可直接对微小核糖核酸675(microRNA675)进行半定量的试剂盒,其特征在于:所述的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针的荧光基团与淬灭基团的修饰位置,荧光基团修饰在探针A链的5’端核苷酸上,淬灭基团修饰在5’端的互补位核苷酸或相邻的核苷酸上;这样修饰后,探针在初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”时,荧光基团与淬灭基团空间距离小于10nm,将会发生荧光共振能量转移,导致荧光被淬灭,故探针在初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”时,因此检测不到荧光。

5.当探针变形为一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构时,荧光基团与淬灭基团之间空间距离远大于10 nm,不能发生荧光共振能量转移,荧光基团不能被淬灭,故可检测到荧光;每当“靶序列的出现→与探针结合→探针变形→链延伸→链置换→靶序列重新游离”循环反应一次,被打开探针的量就增加一个靶序列原始量,靶序列的原始量越大,单位时间内发出荧光的探针量就越大,即荧光强度的累积速率与靶序列浓度成正比;因此,探针具有自身信号放大功能,极微量靶序列的存在也能够被检测到,不需要进行扩增。

6.根据权利要求1所述的一种直接对微小核糖核酸675(microRNA675)进行半定量的试剂盒,其特征在于:所述的一种可直接对微小核糖核酸675(microRNA675)进行半定量的试剂盒用于对总RNA中的某一种微小核糖核酸675(microRNA675)进行半定量检测是通过如下步骤来实现的:

(1) 取浓度为10 μM的探针1 μL,加入到12 μL含DNA链置换酶2μL的杂交缓冲液中,混匀;

(2)向上述液体其中加入5 μL样本,混匀后送realtimePCR仪检测;

(3)检测条件通常为60 ℃恒温30分钟,检测温度及检测时间和可根据具体情况在50-65 ℃、5-30分钟之间调整;

(4)结果分析,荧光强度累积速率与样本中目的微小核糖核酸675(microRNA675)含量成正比,检测结果判定的方法有两种,当待测样本中目的微小核糖核酸675(microRNA675)含量较低时,相同时间内荧光强度值越高的样本,其目的微小核糖核酸675(microRNA675)的含量越高;当待测样本中目的微小核糖核酸675(microRNA675)含量较高时,达到相同荧光强度值所用时间越短的样本,其微小核糖核酸675(microRNA675)的含量越高。

7.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸675(microRNA675)进行半定量的试剂盒,其特征在于:所述的一种可直接对微小核糖核酸675(microRNA675)进行半定量的试剂盒利用这种空间结构的进行微小核糖核酸675(microRNA675)的半定量检测的工作原理是,微小核糖核酸675(microRNA675)启动的自身信号循环放大反应”:初始结构的探针(无荧光信号)→微小核糖核酸675(microRNA675)的出现→与探针结合后引发探针变形(变形后发出荧光信号,非微小核糖核酸675(microRNA675)不引起探针变形)→链延伸→链置换(初始结构探针不会发生链延伸及链置换反应)→微小核糖核酸675(microRNA675)重新游离→再次引起其它初始形态的探针变形(自身信号循环放大)。

当前第2页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1