本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷的方法。
背景技术：
1，2，3-三氯丙烷（tcp）是一种人工合成的氯代有机化合物，是制造油漆涂料和土壤杀虫剂的重要原料，被广泛应用于工业和农业生产。但tcp具有高毒性和难降解的特点，广泛使用造成了该物质在土壤和地下水中的大量积累，对人类健康和生态环境造成了巨大的威胁。
目前降解tcp的方法有：物理、化学和生物方法。物理法包括真空抽滤和活性炭吸附。但tcp易挥发、难吸附，所以物理法不能有效解决tcp污染问题。化学法主要利用强氧化剂和强还原剂处理tcp，具有工艺简单的特点。但强氧化剂和强还原剂的使用会严重破坏生态环境。与物理和化学法相比，生物降解法具有成本低和能够将有害物质完全降解的优点，已成为降解环境污染物的有效方法。目前，有研究利用固定化酶（卤烷脱卤酶、卤醇脱卤酶和环氧化物水解酶）构建体外tcp降解途径，使tcp转化成甘油。但固定化酶存在制作过程复杂、生产成本高和难以重复利用的问题，特别是在低浓度的tcp污染环境中，固定化酶具有明显的局限性。另外，一些研究构建了能降解tcp及其中间产物的工程菌。但构建的菌株存在tcp耐受性差、遗传不稳定和降解效率低的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是克服上述现有tcp降解技术的缺陷和不足，提供一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷的方法。
本发明的另一目的是提供一种降解1，2，3-三氯丙烷的枯草芽孢杆菌工程菌。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种卤烷脱卤酶基因（dhaa31），其核酸序列如seqidno.1所示。
一种卤烷脱卤酶（haloalkanedehalogenase,dhaa31），其氨基酸序列如seqidno.2所示。
一种卤醇脱卤酶基因（hhec），其核酸序列如seqidno.3所示。
一种卤醇脱卤酶（halohydrindehalogenase,hhec），其氨基酸序列如seqidno.4所示。
一种环氧化物水解酶基因（echa），其核酸序列如seqidno.5所示。
一种环氧化物水解酶（epoxidehydrolase,echa），其氨基酸序列如seqidno.6所示。
一种降解1，2，3-三氯丙烷的枯草芽孢杆菌工程菌，构建方法为：首先合成能降解1，2，3-三氯丙烷（tcp）及其中间产物（2，3-二氯-1-丙醇和环氧氯丙烷）的卤烷脱卤酶（dhaa31）基因、卤醇脱卤酶（hhec）基因和环氧化物水解酶（echa）基因，序列分别如seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5所示；然后构建包含上述基因的枯草芽孢杆菌整合载体，载体转化枯草芽孢杆菌，通过基因异位整合及抗性基因敲除的方法，将上述基因整合至枯草芽孢杆菌基因组中。所得枯草芽孢杆菌工程菌分泌表达上述基因编码的卤烷脱卤酶、卤醇脱卤酶和环氧化物水解酶。
具体，优选地，所述枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法包括如下步骤：
（1）基因合成：根据枯草芽孢杆菌的密码子偏好性优化卤烷脱卤酶（dhaa31）、卤醇脱卤酶（hhec）和环氧化物水解酶（echa）基因序列，并合成卤烷脱卤酶基因dhaa31、卤醇脱卤酶基因hhec和环氧化物水解酶基因echa；
（2）利用pgrac启动子和phod信号肽序列，分别构建包含dhaa31基因、hhec基因和echa基因的枯草芽孢杆菌整合载体；
（3）将步骤（2）的整合载体转化枯草芽孢杆菌，通过基因异位整合及抗性基因敲除的方法，将dhaa31基因、hhec基因和echa基因依次整合至枯草芽孢杆菌基因组，构建得到可以分泌表达卤烷脱卤酶、卤醇脱卤酶和环氧化物水解酶的枯草芽孢杆菌工程菌。
更具体地，作为一种可选择的优选方案，所述枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法包括如下步骤：
s1.制备酶基因及构建整合载体所需的相关原件
s11.合成卤烷脱卤酶（dhaa31）基因、卤醇脱卤酶（hhec）基因和环氧化物水解酶（echa）基因，序列分别如seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5所示；
s12.将目的基因卤烷脱卤酶基因、卤醇脱卤酶基因和环氧化物水解酶基因分别插入到质粒pmd18-t中，构建得到重组质粒pmd18t-dhaa31、pmd18t-hhec和pmd18t-echa；
s13.pcr扩增得到构建整合载体所需的启动子和信号肽序列
s131.扩增启动子序列
以质粒pht43为载体，利用引物pgrac-fw和pgrac-rv进行pcr扩增，得到启动子pgrac序列；
引物pgrac-fw的序列如seqidno.7所示，引物pgrac-rv的序列如seqidno.8所示；
s132.扩增信号肽序列
利用引物phod-fw和phod-rv从枯草芽孢杆菌基因组dna上扩增得到phod信号肽序列；
引物phod-fw的序列如seqidno.9所示，引物phod-rv的序列如seqidno.10所示；
s133.用t4dna连接酶将扩增的启动子和信号肽序列连接，构建得到包含启动子和信号肽的dna序列组件（pgrac-phodcassette），如seqidno.13所示；
s2.构建枯草芽孢杆菌整合载体
s21.构建重组质粒pdgief-psphoddhaa31
从genbankdatabase数据库中下载编码质粒pdgief的基因序列（序列号为dq358863.1），将质粒pdgief在genaraycompany合成（shanghaigeneraybiotechco.,ltd），即为宿主广泛性质粒pdgief；
以重组质粒pmd18t-dhaa31为模板，应用引物dhaa31-fw/dhaa31-rv进行pcr扩增获得外源基因dhaa31；扩增产物经过双酶切处理后，插入到质粒pdgief的sali/noti位点，构建得到重组质粒pdgief-dhaa31；
将pgrac-sphodcassette双酶切后插入到重组质粒pdgief-dhaa31的nhei/sali位点，构建得到重组质粒pdgief-psphoddhaa31；
其中，引物dhaa31-fw的序列如seqidno.14所示，引物dhaa31-rv的序列如seqidno.15所示；
s22.构建重组质粒piefvpr-psphodhhec
以pmd18t-hhec为模板，使用引物hhec-fw/hhec-rv进行pcr扩增获得外源基因hhec；扩增产物经过双酶切处理后，插入到vpr基因位点整合质粒piefvpr的sali/noti位点，构建得到重组质粒piefvpr-hhec；
将pgrac-sphodcassette双酶切处理后插入到质粒piefvpr-hhec的nhei/sali位点，构建得到重组质粒piefvpr-psphodhhec；
其中，引物hhec-fw的序列如seqidno.24所示，引物hhec-rv的序列如seqidno.25所示；
s23.构建重组质粒piefepr-psphodecha
以pmd18t-echa为模板，使用引物echa-fw/echa-rv进行pcr扩增获得外源基因echa；扩增产物经过双酶切处理后，插入到epr基因位点整合质粒piefepr的sali/noti位点，构建得到重组质粒piefepr-echa；将pgrac-sphodcassette经双酶切处理后插入到质粒piefepr-echa的nhei/sali位点，构建得到重组质粒piefepr-psphodecha；
其中，引物echa-fw的序列如seqidno.34所示，引物echa-rv的序列如seqidno.35所示；
利用引物扩增外源基因的pcr程序如下：98℃，10min；98℃，10s；55℃，10s；72℃，15s，进行30个循环；72℃，3min；
s3.构建枯草芽孢杆菌工程菌
s31.重组质粒pdgief-psphoddhaa31转化大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒，线性化后重组质粒转化枯草芽孢杆菌感受态细胞，重组质粒与宿主基因组发生双交换同源重组，将目的基因整合至基因组amye位点；从含有壮观霉素的lb平板上挑选阳性克隆，将其接种到lb培养基中，37℃，200rpm培养24h，将培养物稀释，涂布于含有0.1mmiptg的固体lb平板，筛选出iptgs和spcr的单菌落，即为含有外源基因dhaa31的工程菌，命名为b.subtilis168-1；
s32.采用同样的方法，将卤醇脱卤酶基因（hhec）和环氧化物水解酶基因（echa）依次整合到工程菌b.subtilis168-1基因组的vpr和epr位点，最终构建得到含有外源基因dhaa31、hhec和echa的枯草芽孢杆菌工程菌。
另外，本发明还提供了一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷的方法，是利用上述的枯草芽孢杆菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷。
本发明构建的枯草芽孢杆菌工程菌能够耐受8mm的1，2，3-三氯丙烷（tcp），且在30～37℃条件下，在基本盐培养基（mmy）中培养20～30天，工程菌可将2mmtcp完全降解。
因此，枯草芽孢杆菌工程菌在降解1，2，3-三氯丙烷及其中间产物（2，3-二氯-1-丙醇和环氧氯丙烷）的应用，以及在制备1，2，3-三氯丙烷、2，3-二氯-1-丙醇和/或环氧氯丙烷的降解制剂方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
本发明通过分子生物学技术构建含卤烷脱卤酶（dhaa31）基因、卤醇脱卤酶（hhec）基因和环氧化物水解酶（echa）基因的枯草芽孢杆菌整合载体；将上述载体转化枯草芽孢杆菌；通过基因异位整合及抗性基因敲除的方法，将上述基因分别整合至枯草芽孢杆菌168基因组；通过枯草芽孢杆菌工程菌分泌的卤烷脱卤酶、卤醇脱卤酶和环氧化物水解酶，构建1，2，3-三氯丙烷降解途径，将tcp转化成甘油，最终实现1，2，3-三氯丙烷的完全矿化。
本发明具有以下有益效果：
本发明构建的枯草芽孢杆菌工程菌能够分泌表达降解1,2,3-三氯丙烷（tcp）及其中间产物的卤烷脱卤酶、卤醇脱卤酶和环氧化物水解酶，对1，2，3-三氯丙烷（tcp）耐受性好，对tcp及其中间产物具有很好的降解效果和效率，可实现tcp的完全降解，具有降解效率高、tcp耐受性强且遗传稳定等特点，是目前降解tcp最有效的基因工程菌。
附图说明
图1：枯草芽孢杆菌整合载体；p：pgrac启动子；s：phod信号肽；dhaa31：卤烷脱卤酶突变体基因；hhec：卤醇脱卤酶基因；echa：环氧化物水解酶基因。amye-front：amye基因上游同源臂；amye-back：amye基因下游同源臂；vpr-front：vpr基因上游同源臂；vpr-back：vpr基因下游同源臂；epr-front：epr基因上游同源臂；epr-back：epr基因下游同源臂。
图2：卤烷脱卤酶基因（dhaa31）、卤醇脱卤酶基因（hhec）和环氧化物水解酶基因（echa）整合到枯草芽孢杆菌基因组amye、vpr和epr位点。
图3：通过pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳技术验证卤烷脱卤酶基因（dhaa31）、卤醇脱卤酶基因（hhec）和环氧化物水解酶基因（echa）整合到枯草芽孢杆菌基因组amye、vpr和epr位点；m：marker；line1：对照组amye位点基因片段；line2：枯草芽孢杆菌工程菌amye位点基因片段；line3：对照组vpr位点基因片段；line4.：枯草芽孢杆菌工程菌vpr位点基因片段；line5：对照组epr位点基因片段；line6：枯草芽孢杆菌工程菌epr位点基因片段。
图4：卤烷脱卤酶（dhaa31）、卤醇脱卤酶（hhec）和环氧化物水解酶（echa）在枯草芽孢杆菌工程菌中的表达和分泌（枯草芽孢杆菌工程菌培养基上清中的外源蛋白）；m：marker；line1：卤烷脱卤酶；line2：卤醇脱卤酶；line3：环氧化物水解酶。
图5：枯草芽孢杆菌工程菌b.subtilis168-3对1，2，3-三氯丙烷的耐受性。
图6：枯草芽孢杆菌工程菌培养上清粗酶液对1，2，3-三氯丙烷的降解作用。
图7：枯草芽孢杆菌工程局菌对1，2，3-三氯丙烷、2，3-二氯-1-丙醇和环氧氯丙烷的降解作用；a为工程菌对tcp的降解作用；b为工程菌对dcp的降解作用；c为工程菌对ech的降解作用。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1获得酶基因及构建整合载体所需的相关原件
1、根据枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化，设计出了卤烷脱卤酶突变体基因（dhaa31，核酸序列如seqidno.1所示）、卤醇脱卤酶基因（hhec，核酸序列如seqidno.3所示）和环氧化物水解酶基因（echa，核酸序列如seqidno.5所示）。
对应编码得到卤烷脱卤酶（haloalkanedehalogenase,dhaa31）氨基酸序列如seqidno.2所示、卤醇脱卤酶（halohydrindehalogenase,hhec）氨基酸序列如seqidno.4所示、环氧化物水解酶（epoxidehydrolase,echa）氨基酸序列如seqidno.6所示。
2、将合成的上述目的基因插入到质粒pmd18-t中，构建重组质粒pmd18t-dhaa31、pmd18t-hhec和pmd18t-echa。
3、pcr扩增得到构建整合载体所需的启动子和信号肽序列
（1）扩增启动子序列
以质粒pht43(vt2007,miaolingbio,guangzhou,china)为载体，利用引物pgrac-fw和pgrac-rv进行pcr扩增，得到pgrac启动子序列，如seqidno.11所示。
引物pgrac-fw（序列如seqidno.7所示）：
5’-acactagctagcagctattgtaacataatcggtacggg-3’（下划线部分为nhei酶切位点，5’端6位是酶切保护碱基）；
引物pgrac-rv（序列如seqidno.8所示）：
5’-taacgcggatccttcctcctttaattggg-3’（下划线部分为bamhi酶切位点，5’端6位是酶切保护碱基）。
（2）扩增信号肽序列
利用引物phod-fw和phod-rv从枯草芽孢杆菌基因组dna上扩增得到phod信号肽序列，如seqidno.12所示。
引物phod-fw（序列如seqidno.9所示）：
5’-taacgcggatccatggcatacgacagtc-3’（下划线部分为bamhi酶切位点，5’端6位是酶切保护碱基）；
引物phod-rv（序列如seqidno.10所示）：
5’-gcgccggtcgacagcatttacttcaaaggc-3’（下划线部分为sali酶切位点，5’端6位是酶切保护碱基）。
（3）用t4dna连接酶将扩增的启动子和信号肽序列连接，构建得到包含启动子和信号肽的dna序列组件（pgrac-phodcassette），如seqidno.13所示。
实施例2构建枯草芽孢杆菌整合载体
1、构建重组质粒pdgief-psphoddhaa31
（1）从genbankdatabase数据库中下载编码质粒pdgief的基因序列（序列号为dq358863.1），将质粒pdgief在genaraycompany合成（shanghaigeneraybiotechco.,ltd），即为宿主广泛性质粒pdgief。
（2）以重组质粒pmd18t-dhaa31为模板，应用引物dhaa31-fw/dhaa31-rv进行pcr扩增获得外源基因dhaa31；扩增产物经过双酶切处理后，插入到质粒pdgief的sali/noti位点，构建得到重组质粒pdgief-dhaa31。
pcr程序如下：98℃，10min；98℃，10s；55℃，10s；72℃，15s，进行30个循环；72℃，3min。
引物dhaa31-fw（序列如seqidno.14所示）：
5’-atccgcgtcgacatgtcagaaattggcacaggctttccgtttg-3’（下划线部分是sali酶切位点）；
引物dhaa31-rv（序列如seqidno.15所示）：
5’-tattagcggccgcttaatgatggtgatgatgatgcagtgccggc-3’（下划线部分为noti酶切位点）。
（3）应用引物pgrac-fw/phod-rv从pgrac-sphoddna序列组件上pcr扩增得到pgrac-sphodcassette，经双酶切处理后插入到重组质粒pdgief-dhaa31的nhei/sali位点，构建得到重组质粒pdgief-psphoddhaa31（如图1所示）。
2、构建重组质粒piefvpr-psphodhhec
（1）构建重组质粒piefvpr1（重组质粒构建方法详见zhanetal,2006）：
1）以质粒pdgief为载体，应用引物maze-f和amp-rv扩增质粒载体上的maze-amp序列；
其中，引物maze-fw（序列如seqidno.16所示）：
5’-ttggcgcgcccgataaccagaagc-3’（下划线部分为asci酶切位点）；
引物amp-rv1（序列如seqidno.17所示）：
5’-cgtggccaggcgcgccatgagtattcaac-3’（下划线部分为agei酶切位点）。
2）应用引物dr(up)-fw和dr(down)-rv扩增质粒载体上的dr-laci-mazf-spc-dr基因序列组件；
引物dr(up)-fw（序列如seqidno.18所示）：
5’-ggactagtaaaattgaaaaaatggtgg-3’（下划线部分为spei酶切位点）；
引物dr(down)-rv（序列如seqidno.19所示）：
5’-cgacgcgtgatccccctatgcaagggtttattg-3’（下划线部分为mlui酶切位点）。
3）应用引物vpr(front)-fw和vpr(front)-rv从枯草芽孢杆菌基因组dna上扩增vpr基因上游同源臂序列(vpr-front)；
引物vpr(front)-fw（序列如seqidno.20所示）：
5’-cgtggccaggatcattcgctttctgcttg-3’（下划线部分为agei酶切位点）；
引物vpr(front)-rv（序列如seqidno.21所示）：
5’-ggactagtatccgactgtccagccgttcgg-3’（下划线部分为spei酶切位点）。
4）应用引物vpr(back)-fw和vpr(back)-rv从枯草芽孢杆菌基因组dna上扩增vpr基因下游同源臂序列（vpr-back）；
引物vpr(back)-fw（序列如seqidno.22所示）：
5’-cgacgcgtcaataacaaagaagttgagc-3’（下划线部分为mlui酶切位点）；
引物vpr(back)-rv（序列如seqidno.23所示）：
5’-ttggcgcgcccggtcaaaacctggcttgac-3’（下划线部分为asci酶切位点）。
5）将上述扩增的dna片段经限制性内切酶切处理后用t4dna连接酶进行连接，得到重组质粒piefvpr1。
（2）以pmd18t-hhec为模板，使用引物hhec-fw/hhec-rv进行pcr扩增，获得外源基因hhec。pcr反应程序同上。将扩增片段进行双酶切处理后插入到piefvpr1（vpr基因位点整合质粒）的sali/noti位点，构建得到重组质粒piefvpr-hhec。
引物hhec-fw（序列如seqidno.24所示）：
5’-atccgcgtcgacatgtctacagcaatcgttac-3’（下划线部分为sali酶切位点）；
引物hhec-rv（序列如seqidno.25所示）：
5’-taatagcggccgcttaatgatgatgatgatgatgttcc-3’（下划线部分为noti酶切位点）。
（3）应用引物pgrac-fw/phod-rv从pgrac-sphoddna序列组件上pcr扩增得到pgrac-sphodcassette，经双酶切处理后插入到质粒piefvpr-hhec的nhei/sali位点，构建得到重组质粒piefvpr-psphodhhec（如图1所示）。
3、构建重组质粒piefepr-psphodecha
（1）构建重组质粒piefepr2
1）以pdgief为载体，应用引物maze-fw和amp-rv2扩增质粒载体上的maze-amp序列；
引物maze-fw（序列如seqidno.26所示）：
5’-ttggcgcgcccgataaccagaagc-3’（下划线部分为asci酶切位点）；
引物amp-rv2（序列如seqidno.27所示）：
5’-cgacgcgtggcgcgccatgagtattcaac-3’（下划线部分为mlui酶切位点）。
2）应用引物dr(up)-fw2和dr(down)-rv2扩增质粒载体上的dr-laci-mazf-spc-dr基因序列组件；
引物dr(up)-fw2（序列如seqidno.28所示）：
5’-caggacgtccaaaattgaaaaaatggtgg-3’（下划线部分为sbfi酶切位点）；
引物dr(down)-rv2（序列如seqidno.29所示）：
5’-cgaggcctgatccccctatgcaagggtttattg-3’（下划线部分为bspei酶切位点）。
3）应用引物epr(front)-fw和epr(front)-rv从枯草芽孢杆菌基因组dna上扩增epr基因上游同源臂序列(epr-front)；
引物epr(front)-fw（序列如seqidno.30所示）：
5’-cgacgcgttgtatcagtcactctg-3’（下划线部分为mlui酶切位点）；
引物epr(front)-rv（序列如seqidno.31所示）：
5’-caggacgtcctggctccgataatccctgcgac-3’（下划线部分为sbfi酶切位点）。
4）应用引物epr(back)-fw和epr(back)-rv从枯草芽孢杆菌基因组dna上扩增vpr基因下游同源臂序列（epr-back）；
引物epr(back)-fw（序列如seqidno.32所示）：
5’-cgaggcctttcaaagtcttctccaagg-3’（下划线部分为bspei酶切位点）；
引物epr(back)-rv（序列如seqidno.33所示）：
5’-ttggcgcgcccgtcttcaaattggtgctcttcac-3’（下划线部分为asci酶切位点）。
5）将上述扩增的dna片段经酶切处理后用t4dna连接酶进行连接，得到重组质粒piefepr2。
（2）以pmd18t-echa为模板，应用引物echa-fw/echa-rv对外源基因echa进行pcr扩增。pcr扩增程序同上。将扩增产物进行双酶切处理，插入到piefepr2（epr基因位点整合质粒）的sali/noti位点，构建得到重组质粒piefepr-echa。
引物echa-fw（序列如seqidno.34所示）：
5’-atccgcgtcgacatgacgattcgccgccctgaagattttaaac-3’（下划线部分为sali酶切位点）；
引物echa-rv（序列如seqidno.35所示）：
5’-ttatagcggccgcttaatgatgatgatgatgatgtctgaatgc-3’（下划线部分为noti酶切位点）。
（3）应用引物pgrac-fw/phod-rv从pgrac-sphoddna序列组件上pcr扩增得到pgrac-sphodcassette，经双酶切处理后插入到质粒piefepr-echa的nhei/sali位点，构建得到重组质粒piefepr-psphodecha（如图1所示）。
实施例3构建枯草芽孢杆菌工程菌
1、将上述构建的枯草芽孢杆菌整合载体转化大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒（如图2和3所示）：
（1）重组质粒pdgief-psphoddhaa31转化大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒，通过化学转化法将重组质粒pdgief-psphoddhaa31线性化后，转化枯草芽孢杆菌感受态细胞，重组质粒与宿主基因组发生双交换同源重组，将目的基因整合至基因组amye位点。从含有壮观霉素的lb平板上挑选阳性克隆，将其接种到10mllb培养基中，37℃，200rpm培养24h，将培养物稀释，涂布于含有0.1mmiptg的固体lb平板，筛选出iptgs和spcr的单菌落，即为含有外源基因dhaa31的工程菌，命名为b.subtilis168-1。
（2）采用同样的方法，将卤醇脱卤酶基因（hhec）和环氧化物水解酶基因（echa）依次整合到工程菌b.subtilis168-1基因组的vpr和epr位点，构建得到工程菌b.subtilis168-2，工程菌b.subtilis168-3。
2、将上述工程菌在lb培养基中培养24h，收集上清液，用超滤管进行浓缩。
westernblot分析，结果表明上清中含有目的蛋白，其分子量与预测的蛋白分子量大小一致（如图4所示）。该结果证明，以上所述的3种基因在枯草芽孢杆菌中表达并分泌到胞外。
实施例4应用枯草芽孢杆菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷
1、工程菌b.subtilis168-3在lb液体培养基中过夜培养，然后经过5000g，10min离心处理，收集菌体，用mmy培养基洗2次，重悬菌体，将重悬后的菌液接种到含有10mm葡萄糖的50mlmmy培养基中，初始od600=0.05，分别加入1，2，3-三氯丙烷（tcp）、2，3-二氯-1-丙醇（dcp）和环氧氯丙烷（ech）至终浓度为2mm。37℃，220rpm条件下培养。在固定的时间间隔内提取1ml反应液，加入含有0.05mm正己醇的丙酮溶液（1：1），通过gc-ms色谱分析仪检测样品中的化合物成分及浓度。
2、化合物的浓度通过gc-ms色谱分析仪进行检测分析。样品从反应液中提取后加入含有0.05mm正己醇的丙酮溶液（1：1），取1ul样品进行gc分析。所用载气是氦气，升温程序如下：45℃，2min；然后以5℃/min的速度升到100℃，保持1min；再以20℃/min升到220℃，保持2min。用cd-acidwax（30m×0.25mm×0.25um）毛细管柱对化合物进行分离，并通过agilenttechnologies7890a（gcsystem）气象色谱分析仪所配的5975msd质谱检测器进行检测。
3、结果
枯草芽孢杆菌工程菌b.subtilis168-3对1，2，3-三氯丙烷的耐受性如图5所示。枯草芽孢杆菌工程菌培养上清粗酶液对1，2，3-三氯丙烷的降解结果如图6所示。枯草芽孢杆菌工程局菌对1，2，3-三氯丙烷、2，3-二氯-1-丙醇和环氧氯丙烷的降解作用如图7所示。
结果显示，在培养25天后，工程菌可以完全降解培养基中的1，2，3-三氯丙烷、2，3-二氯-1-丙醇和环氧氯丙烷（2mm）。说明构建的枯草芽孢杆菌工程菌可以降解1，2，3-三氯丙烷及其中间产物，实现1，2，3-三氯丙烷的完全矿化。
sequencelisting
<110>中山大学
<120>一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷的方法
<130>
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<213>合成的卤烷脱卤酶基因（dhaa31）
<400>1
atgtcagaaattggcacaggctttccgtttgatccgcattatgttgaagttctgggcgaa60
agaatgcattatgttgatgttggcccgagagatggcacaccggttctgtttctgcatggc120
aatccgacatcatcatatctgtggagaaatattattccgcatgttgcaccgtcacataga180
tgcattgcaccggatctgattggcatgggcaaatcagataaaccggatctggattacttc240
tttgatgatcatgttcgatacctggatgctttcattgaagcactgggcctggaagaagtt300
gttctggttattcatgattggggctcagcactgggctttcattgggcaaaaagaaatccg360
gaaagagttaaaggcattgcttgtatggagtttattagaccgtttccgacatgggatgaa420
tggccggaatttgcaagagaaacatttcaagcgtttagaacagcagatgttggcagagaa480
ctgattattgatcaaaatgcttttattgaaggcgcactgccgaaatatgttgttagaccg540
ctgacagaagttgagatggatcattatagagaaccgtttctgaaaccggttgatagagaa600
ccgctgtggagatttccgaacgagctgccgattgcaggcgaaccggcaaatattgttgca660
ctggttgaagcatatatgaattggctgcatcaatcaccggttccgaaactgctgttttgg720
ggcacaccgggctttattattccgccggcagaagcagcaagactggcagaatcactgccg780
aattgcaaaacagttgatattggccctggcctgcattttctgcaagaagataatccggat840
ctgattggctcagaaattgcaagatggctgccggcactgtaa882
<210>2
<211>293
<212>prt
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<400>2
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gluvalleuglygluargmethistyrvalaspvalglyproarg
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aspglythrprovalleupheleuhisglyasnprothrserser
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tyrleutrpargasnileileprohisvalalaproserhisarg
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cysilealaproaspleuileglymetglylysserasplyspro
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aspleuasptyrphepheaspasphisvalargtyrleuaspala
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pheileglualaleuglyleuglugluvalvalleuvalilehis
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asptrpglyseralaleuglyphehistrpalalysargasnpro
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gluargvallysglyilealacysmetglupheileargprophe
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alapheargthralaaspvalglyarggluleuileileaspgln
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asnalapheilegluglyalaleuprolystyrvalvalargpro
170175180
leuthrgluvalglumetasphistyrargglupropheleulys
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provalasparggluproleutrpargpheproasngluleupro
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ilealaglygluproalaasnilevalalaleuvalglualatyr
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metasntrpleuhisglnserprovalprolysleuleuphetrp
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alagluserleuproasncyslysthrvalaspileglyprogly
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leuhispheleuglngluaspasnproaspleuileglyserglu
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ilealaargtrpleuproalaleu
290
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<212>dna
<213>合成的卤醇脱卤酶基因（hhec）
<400>3
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cttagcgaagcaggacatacggttgcttgtcatgatgagtcttttaaacaaaaagatgaa120
cttgaagcatttgcagaaacgtatcctcaacttaaacctatgtcagaacaagaaccggca180
gaactgatcgaagcagttacgtcagcctacggacaagttgatgttctggtttctaatgac240
atctttgcacctgaatttcaaccgatcgataaatatgcagttgaagattatcgtggagca300
gttgaagcacttcaaattcgcccgtttgcactggttaatgcagttgcatctcagatgaaa360
aaacgcaaatcaggccatattatctttatcacgagcgcaacaccgtttggaccgtggaaa420
gaactgtccacttatacgagcgcacgcgcaggcgcatctacgctggcaaatgcactgtct480
aaagaattaggcgaatataatattccggtttttgcaatcggacctaattacttacatagc540
gaagatagcccttatttttatccgacggaaccgtggaaaacgaatcctgaacatgttgca600
catgttaaaaaagttacagcacttcaacgcttaggcacacaaaaagaattgggcgaactt660
gttgcatttctggcaagcggctcttgcgattatctgacgggccaagtattttggctggct720
ggaggctttcctatgatcgaacgctggccgggaatgccggaataa765
<210>4
<211>254
<212>prt
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<400>4
metserthralailevalthrasnvallyshispheglyglymet
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glyseralaleuargleuserglualaglyhisthrvalalacys
202530
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ileargprophealaleuvalasnalavalalaserglnmetlys
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ccggatctgagaggctttggagattcagaaaaaccggatcttaatgatctgtctaaatat240
agccttgataaagcagcagatgatcaagcagcacttctggatgcactgggaatcgaaaaa300
gcctatgttgttggccatgattttgcagcaatcgttctgcataaattcatccgcaaatat360
agcgatagagttatcaaagcagcaatctttgatcctatccaaccggattttggaccggtt420
tattttggcttaggacatgttcatgaaagctggtattcacaatttcatcaactggatatg480
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cctgatgcagcactgtggacggacctggatcatacaatgagtgacctgccggttacgatg720
atctggggactgggcgatacatgcgttccgtatgcacctcttatcgaatttgttcctaaa780
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<211>294
<212>prt
<213>环氧化物水解酶（epoxidehydrolase,echa）
<400>6
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thrleuleuleuleuhisglytrpproglyphetrptrpglutrp
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alaleuleuaspalaleuglyileglulysalatyrvalvalgly
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trpthraspleuasphisthrmetseraspleuprovalthrmet
230235240
iletrpglyleuglyaspthrcysvalprotyralaproleuile
245250255
gluphevalprolystyrtyrserasntyrthrmetgluthrile
260265270
gluaspcysglyhispheleumetvalglulysprogluileala
275280285
ileaspargilelysthralaphearg
290
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<400>9
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<213>引物phod-rv
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<400>11
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<213>包含启动子和信号肽的dna序列组件pgrac-phodcassette
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agctattgtaacataatcggtacgggggtgaaaaagctaacggaaaagggagcggaaaag60
aatgatggatcactagaaaattttttaaaaaatctcttgacattggaagggagatatgtt120
attataagaatagcggaattgtgagcggataacaattcccaattaaaggaggaaggatcc180
atggcatacgacagtcgttttgatgaatgggtacagaaactgaaagaggaaagctttcaa240
aacaatacgtttgaccgccgcaaatttattcaaggagcggggaagattgcaggactttct300
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