几丁质结合蛋白Bt‑CBP及其编码基因和制备方法与应用与流程

本发明涉及一种来源于苏云金芽胞杆菌的几丁质结合蛋白及其编码基因和制备方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术：

几丁质,俗称甲壳素、甲壳质,是n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)的多聚物,在自然界中，几丁质是含量仅次于纤维素的生物高分子物质。几丁质的降解主要是通过产几丁质酶的微生物完成。

微生物几丁质降解系统主要由内切几丁质酶、外切几丁质酶、乙酞己糖胺酶和与几丁质结合蛋白等组成。其中几丁质结合蛋白(chitin-bindingproteins，cbp)分散几丁质糖链，内切几丁质酶随机切割多糖链，生成几丁质寡糖；外切几丁质酶沿糖链末端降解几丁质，生成的几丁二糖在β-n-乙酰己糖胺酶或壳二糖酶作用下生成单糖。其中几丁质结合蛋白是一类能与几丁质特异结合的蛋白质,能起到分散几丁质糖链束的作用,对于不溶多糖降解起着决定性的作用，广泛存在于各种微生物、动物和植物中。

苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis，简称bt)是目前世界上研究最深入、应用最成功的杀虫细菌，已经广泛用于农业、林业、贮藏以及卫生等多种害虫的防治。它除了能产生杀虫晶体蛋白之外，还能产生包括几丁质酶、几丁质结合蛋白在内的多种活性物质。但是目前人们对于苏云金芽胞杆菌几丁质酶和几丁质结合蛋白的认识还有限,这些因素对于苏云金芽胞杆菌及其几丁质酶、几丁质结合蛋白的应用造成限制。

技术实现要素：

本发明的目的是要解决苏云金芽胞杆菌杀虫性能好，但抑制真菌病害能力较差的问题，提供一种来源于苏云金芽胞杆菌、具有高效抗病原真菌活性且制备方法简单的几丁质结合蛋白bt-bcp及其编码基因和制备方法与应用。

技术方案：

一种几丁质结合蛋白bt-cbp，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。其氨基酸序列如seqidno.2所示，由463个氨基酸组成。

几丁质结合蛋白bt-cbp的制备方法，步骤如下：

(1)dna序列扩增：以苏云金芽胞杆菌atcc-35866菌株基因组为模板,以up1和dn1为上、下游引物，用高保真transstartfastpfudnapolymeras进行pcr扩增；所述上游引物1如seqidno.3所示，下游引物dn1，如seqidno.4所示。所得扩增片段的序列如no.5所示。

(2)一步法构建大肠杆菌表达质粒：使用全式金的无缝连接试剂盒，将所得扩增片段与ncoi和xhoi酶切后的pet28a(+)线性片段，按5:1的比例混合于pcr管中，50℃反应15～30min，之后将重组产物直接用于转化大肠杆菌dh5ɑ，通过菌落pcr、酶切筛选鉴定阳性转化子克隆,得到重组表达质粒pet28(+)bt-cbp；

(3)构建大肠杆菌重组表达菌株：将重组表达质粒pet28(+)bt-cbp转化至大肠杆菌bl21,挑选阳性转化子克隆,得到重组表达菌株e.colibt-cbp；

(4)几丁质结合蛋白bt-cbp的诱导表达：将重组表达菌株e.colibt-cbp接入含30μg/ml卡那霉素的lb培养基中,于37℃过夜培养活化后,然后按1％的接种量接种到含卡那霉素的lb培养基中,当od600达到0.6左右时，加入终浓度为1mm的iptg诱导剂,在25℃，180rpm条件下诱导培养8-12h；

(5)几丁质结合蛋白bt-cbp的纯化：将步骤(4)经诱导的菌液移入干净的离心管中，4℃，离心收集菌体,用缓冲液洗涤菌体,再用缓冲液重悬菌体之后置于冰上超声破碎，破碎后的样品于4℃下离心，收集上清即为粗蛋白；粗蛋白用镍柱进行亲和层析纯化,得到几丁质结合蛋白。

本发明同时提供了上述几丁质结合蛋白在增强几丁质酶酶活性中的应用。

本发明还提供了所述的几丁质结合蛋白单独或与几丁质酶联合使用，在防治真菌病害中的应用。所述的真菌病害为黄瓜灰霉病菌或尖孢镰刀菌等真菌病害。

本发明的优点和积极效果：

本发明的积极效果是：

1.本发明首次从苏云金芽胞杆菌中克隆出几丁质蛋白的编码基因,通过构建原核表达载体获得了具有高活性的表达产物,制备过程简单,为几丁质蛋白的后续研究提供了简便方法。

2.本发明获得的几丁质结合蛋白bt-cbp可以提高几丁质酶btchib的酶活3.6倍。

3.本发明获得的几丁质结合蛋白bt-cbp本身对黄瓜灰霉病菌、尖孢镰刀菌等植物病原真菌具有良好的抑制效果，还能显著增强chib对黄瓜灰霉的抑制效果，具有良好的生物防治功能,为农业领域、抗真菌药物研发的提供新的研究方向，具有广阔应用价值，将产生巨大工业效益和经济价值。

附图说明：

图1重组表达载体pet28a(+)bt-cbp的pcr验证，1：dnamarker，2：ddh2o负对照，3：bt-cbp。

图2重组表达载体pet28a(+)bt-cbp的酶切验证，1：dnamarker，2：ncoi和xhoi双酶切处理的pet28a(+)bt-cbp。

图3sds-page检测纯化的bt-cbp蛋白，1：诱导表达后的e.colibl21bt-cbp细胞破碎上清，2：蛋白分子量marker，3：经镍柱纯化的bt-cbp蛋白。

图4glcnac标准曲线

图5bt-cbp对bt几丁质酶chib降解几丁质的增效作用，bt-cbp：200μlbt-cbp(150μg/ml)，chib：200μlchib(20μg/ml)，chib+bt-cbp：100μlchib(40μg/ml)+100μlbt-cbp(40μg/ml)。

图6bt-cbp增强bt几丁质酶chib抑制黄瓜灰霉的作用,1:180μlbt-cbp(150μg/ml)+20μl黄瓜灰霉孢子悬液(1x10⁶孢子/ml),2:180μl20mm的tris-hcl(ph7.2)缓冲液+20μl黄瓜灰霉孢子悬液(1x10⁶孢子/ml),3:180μlchib(20μg/ml)+20μl黄瓜灰霉孢子悬液(1x10⁶孢子/ml),4:90μlbt-cbp(40μg/ml)+90μlchib(40μg/ml)+20μl黄瓜灰霉孢子悬液(1x10⁶孢子/ml)。

具体实施方式：

实施例1、几丁质结合蛋白bt-cbp的表达与纯化

本发明首先以苏云金芽胞杆菌atcc-35866的基因组为模板，以up1和dn1为上、下游引物，用全式金的高保真transstartfastpfudnapolymerase扩增bt-cbp基因序列。然后，使用全式金的无缝连接试剂盒，将扩增后的片段与ncoi和xhoi酶切后的pet-28a(+)线性片段，按5:1的比例混合于pcr管中，一步法构建重组表达质粒。将重组表达质粒转化至大肠杆菌dh5ɑ，验证正确后，提取重组表达质粒pet28(+)bt-cbp转化至大肠杆菌bl21,得到重组表达菌株e.colibt-cbp。经过培养，iptg诱导剂,超声破碎，离心收集上清即为粗蛋白。粗蛋白用镍柱进行亲和层析纯化,得到几丁质结合蛋白。具体实施方式如下：

(1)bt-cbp基因序列的扩增(见图2)

本发明首先以苏云金芽胞杆菌atcc-35866的基因组为模板，以up1(seqidno.3)和dn1(seqidno.4)为上、下游引物，用全式金公司的高保真transstartfastpfudnapolymerase扩增bt-cbp基因序列，获得1411bp的bt-cbp核酸片断，其序列见(seqidno.5)；

pcr扩增体系如下：

pcr程序：

94℃预变性2min；94℃变性20s，50℃复性20s，72℃延伸1min，每个循环降低1℃，循环5次；然后，94℃变性20s，50℃复性20s，72℃延伸1min，循环25次，共计30个循环；72℃延伸5min。

扩增后片段使用pcr产物纯化回收试剂盒进行纯化回收，电泳检测是否有目的条带及条带大小，进行下一步实验或保存于-20℃。

(2)一步法构建大肠杆菌表达质粒

先将质粒pet-28a(+)用限制性内切酶ncoi和xhoi消化成线性片段，酶切体系如下：

37℃反应8h后，用pcr产物纯化试剂盒进行回收，电泳检测酶切结果，进行下一步实验或保存于-20℃。

使用全式金公司的无缝连接试剂盒，将步骤(1)扩增后片段与ncoi和xhoi酶切后的pet-28a(+)线性片段按5:1的比例混合于pcr管中，反应体系如下：

50℃反应15min。从-80℃冰箱里取出100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞于冰上化冻；在超净工作台中向感受态里加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴45min；将离心管平稳地放入42℃水浴热激90s，再立即冰浴3～5min；而后在超净工作台中向其中加入2倍体积预冷的lb液体培养基，37℃，180rpm恢复培养60min；6000rpm离心1min，留下约200μl液体将菌体重悬，涂布于含卡那霉素的抗性平板，37℃培养24h以上。最后通过pcr、酶切筛选鉴定阳性转化子克隆,得到重组表达质粒pet28a(+)bt-cbp(见图1，2)。

(3)构建大肠杆菌重组表达菌株

重组表达载体质粒转化至大肠杆菌bl21,挑选阳性转化子克隆,得到重组表达菌株e.colibt-cbp。

(4)几丁质结合蛋白bt-cbp的诱导表达和纯化

将重组表达菌株e.colibl21bt-cbp接入含30μg/ml卡那霉素的lb培养基中,于37℃过夜培养后,按1％的接种量接种到含卡那霉素的培养基中,当od600达到0.6左右时，加入终浓度为1mm的iptg诱导剂,在25℃，180rpm条件下诱导培养8-12h。

将经诱导的菌液移入干净的离心管中，4℃，1000rpm，离心20min，收集菌体,用缓冲液a(50mmnah2po4，300mmnacl，ph8.0)洗涤菌体三次,再用适量的缓冲液a重悬菌体(本实验为100ml菌液所获的沉淀用6ml缓冲液a重悬)，再按1％的比例加入100mm的pmsf蛋白酶抑制剂。将离心管置于冰浴中进行超声波细胞破碎(超声波条件：功率300w，工作5s，间隔7s，破碎50-100次，具体破碎次数可根据细胞破碎结果调节)。破碎后的样品4℃，1200rpm，离心30min，收集到的上清即为粗蛋白。

粗蛋白用镍柱进行亲和层析纯化,当平衡柱的缓冲液a流尽时，将粗蛋白液加入预处理好的镍柱中，待结合10min后，调整流速为0.5-1ml/min(1ml柱床体积)，收集流出液，重复2-3次，使his标签更好地与镍柱结合。使用缓冲液a洗涤镍柱4-5次，至a280吸光度达到基线水平；然后用含5mm咪唑的缓冲液a和含10mm咪唑的缓冲液a洗柱各一次，最终用3ml的缓冲液b(50mmnah2po4、300mmnacl、250mm咪唑，ph8.0)洗脱目的蛋白，收集a280蛋白峰洗脱液，超滤除盐后，即为几丁质结合蛋白。蛋白浓度测定采用考马斯亮蓝法，蛋白纯度检测采用sds-page法(见图3)。

实施例2、几丁质结合蛋白bt-cbp对bt几丁质酶chib的增效作用

bt几丁质酶chib的制备：

以苏云金芽胞杆菌atcc-35646的基因组为模板，以up2(seqidno.6)和dn2(seqidno.7)为上、下游引物，用全式金公司的高保真transstartfastpfudnapolymerase扩增bt-chib基因序列，pcr扩增体系和程序与扩增bt-cbp基因的一致。获得2056bp的bt-chib核酸片断，其序列见(seqidno.8)。后续一步法构建大肠杆菌表达质粒pet28a(+)bt-chib、构建重组表达菌株e.coli(bt-chib)和重组表达菌株的诱导、破碎以及蛋白的纯化都和几丁质结合蛋白bt-cbp的制备方法一致，所得bt-chib的氨基酸序列见(seqidno.9)。

几丁质酶活力的测定：

取200μl待试样品，加入200μl含10％胶体几丁质的磷酸盐缓冲液(ph6.0)，50℃水浴1h。加入200μl1％naoh溶液终止反应，混匀后8000rpm离心10min；取上清400μl于新的离心管中，加入等体积的dns试剂溶液，混匀后沸水浴10min；以磷酸盐缓冲液(ph6.0)作对照，测od535值。

一个酶活力单位定义为50℃、ph6.0条件下反应1min产生1μgn-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)所需要的酶量。酶活力测定结果均为3次以上实验结果的平均值。

glcnac标准曲线的制作：

配置glcnac浓度为100～1000μg/ml的标准浓度样本，取200μl标准浓度样本，加入200μl含10％胶体几丁质的磷酸盐缓冲液(ph6.0)，50℃水浴1h。加入200μl1％naoh溶液终止反应，混匀后8000rpm离心10min；取上清400μl于新的离心管中，加入等体积的dns试剂溶液，混匀后沸水浴10min；以磷酸盐缓冲液(ph6.0)作对照，测od535值，绘制标准曲线，见图4。

经过几丁质酶活测定，发现几丁质结合蛋白bt-cbp(150μg/ml)也无明显的酶活。但几丁质结合蛋白bt-cbp就能显著增强bt内切几丁质酶chib的酶活，使chib的酶活提高了3.6倍。(见图5)。

实施例3、几丁质结合蛋白bt-cbp抗真菌作用

制备真菌孢子悬浮液：将供试的黄瓜灰霉菌botrytiscinerea,尖孢镰刀菌fusariumoxysporum,小麦赤霉菌fusariumgraminearum,苹果轮纹病菌physalosporapiricola接种于pda平板,28℃培养2～3d，用3～4ml无菌水将孢子洗下，真菌孢子悬液通过0.45μm孔径滤膜除去菌丝，调整孢子浓度为1x10⁵孢子/ml。

孢子萌发的检测：将1000μg/ml/、800μg/ml、600μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml和50μg/ml的bt-cbp分别与孢子悬液等体积混合，对照组为蒸馏水与孢子悬液等体积混合。加入凹玻片中，用盖玻片密封后，置于28℃，培养48h，用显微镜放大200倍，观察10个不同的视野中孢子萌发的情况。计算半抑制浓度(ic50)，计算结果均为三次试验取平均值。

结果表明几丁质结合蛋白bt-cbp对黄瓜灰霉菌和尖孢镰刀菌有较好的抑制作用，具有潜在的生物防治功能。(见表1)。

表1bt-cbp对4种真菌孢子萌发的半抑制浓度(ic50)

实施例4、几丁质结合蛋白bt-cbp增强chib抑制黄瓜灰霉菌

将灭菌的牛津杯在酒精灯外焰加热3-4s，趁热放置在pda固体平板上。待牛津杯冷却后，向其内加入1x10⁶孢子/ml的黄瓜灰霉孢子悬浮液各20μl。然后在其中一个牛津杯中加入150μg/ml的几丁质结合蛋白bt-cbp180μl，另一个中加入20μg/ml几丁质酶chib180μl，第3个中加入40μg/ml的几丁质结合蛋白bt-cbp90μl和40μg/ml几丁质酶chib90μl。负对照为20μl的黄瓜灰霉孢子悬浮液中加入20mm的tris-hcl(ph7.2)缓冲液180μl，将平板置于25℃的恒温培养箱内，培养3d后，观察真菌生长情况。结果可见，几丁质结合蛋白bt-cbp显著增强chib抑制黄瓜灰霉菌的能力，见图6。

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<110>南开大学

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