一种HTNV抗原表位线性串联多肽及表位肽‑复合物四聚体和应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种htnv抗原表位线性串联多肽及表位肽-复合物四聚体和应用。

背景技术：

肾综合征出血热(hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome,hfrs)是一种由布尼亚病毒科汉坦病毒(hantavirus,htv)感染引起的以发热、出血和肾功能严重损害为特征的急性传染病。在病毒感染性出血热疾病中，hfrs是目前世界上分布最广、发病人数最多且危害极大的一种疾病。截止2010年末，全球累计报告病例1893555例，死亡率高达15％，其中我国报告病例数1585942例，占全球总病例数的83.75％。汉滩病毒(hantaanvirus，htnv)是汉坦病毒属的原型，也是世界《禁止生物武器公约》议定书核查范围中的重要病原微生物之一。1976年李镐汪等首先分离出的htnv76-118株是htnv的代表株，亦是在我国引起hfrs的主要病原体之一。hfrs在我国分布广，发病率和病死率较高，是仅次于病毒性肝炎的危害最大的病毒性传染病，按照《中华人民共和国传染病防治法》，将其规定为乙类传染病。hfrs的主要临床表现包括发热、全身中毒症状、毛细血管损害及急性肾功能损伤，严重者通常出现低血压休克并容易在此阶段死亡。鼠类为htnv的自然宿主和主要传染源，传播方式多种多样，传播途径包括呼吸道、消化道、皮肤粘膜、媒介和垂直传播等多种方式。人群对htnv有较普遍的易感性，在人口密集、带病毒鼠数量多的条件下容易出现爆发和流行。目前hfrs在我国的新疫区仍不断出现，在广大农村、城镇和林区部分疫点还时有爆发，严重危害我国人民的生命和健康，威胁和影响工农业生产、经济开发、外贸及旅游事业的发展，是国家重点防治的传染病之一。

htnv为单股负链rna病毒，基因组位于病毒的核心部分，包括大(l)、中(m)、小(s)三个基因片段，分别编码rna聚合酶、包膜糖蛋白(glycoprotein,gn和gc)以及核蛋白(nucleocapsidprotein，np)。其中s基因全长1.67～2.05kb，编码的htnv-np为非糖基化蛋白，包含429个氨基酸残基，分子量约为50kd。np的一级结构高度保守且具有较强的免疫原性，存在多个抗原表位，能够诱导机体的体液免疫和细胞免疫应答。m基因片段全长3.6～3.7kb，包含1135个氨基酸残基，其中间部位有一个由5个氨基酸残基(waasa)组成的共翻译切割位点，将编码的gn和gc两个前体蛋白在内质网内切割并加工成为gn和gc两个成熟蛋白，未糖基化的gn和gc分子量分别为64kd和54kd。htnv-gn/gc可刺激机体产生特异性中和活性抗体，并且存在t细胞抗原位点，可诱导t细胞免疫应答。

在病毒感染过程中，t细胞通过识别抗原提呈细胞(antigenpresentingcell,apc)表面的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，mhc)-ⅰ类或ⅱ类分子与抗原肽表位形成的复合体，发挥清除病原体的效应。cd8⁺t细胞(细胞毒性t细胞，cytotoxictlymphocyte,ctl)是抗病毒免疫的主要效应细胞，可通过tcr识别已被处理并结合到mhc-ⅰ类分子上并表达于宿主细胞表面的病毒抗原，长度多为8～10个氨基酸，通过分泌颗粒酶和穿孔素杀伤靶细胞，或通过受体-配体相互作用(如fas-fasl)诱导靶细胞程序性死亡，从而清除已被病毒感染的细胞。而cd4⁺t细胞识别与mhc-ⅱ类分子结合的抗原表位后，活化并分化成为th1和th2辅助性t细胞亚群，不仅可通过直接分泌细胞因子来发挥抗病原体感染的作用，而且可分别辅助cd8⁺t细胞活化以及辅助b细胞产生抗体来限制病毒的复制和扩散。在对htnv感染后特异性t细胞免疫应答的研究中，发现htnv感染引起的hfrs患者外周血中同时存在特异性cd8⁺t细胞应答和cd4⁺t细胞应答，hfrs患者肾脏中有浸润淋巴细胞，尤其是cd8⁺t细胞。hfrs患者急性期外周血中活化的ctl数量明显增加，急性期分泌ifn-γ的总体t细胞频率以及表位特异ctl应答水平均与hfrs病情严重程度呈负相关，提示htnv特异性t细胞应答在hfrs疾病发病及预后中发挥着重要的作用。因此，有必要研究和开发能够检测htnv特异性t细胞应答的检测试剂。

近年来，国内外研制了多种针对汉坦病毒的预防性疫苗。我国生产的htnv疫苗均为灭活的全病毒疫苗，分别来源于内蒙沙鼠肾细胞或金色地鼠肾细胞培养，包括小白鼠乳鼠脑纯化疫苗、地鼠肾原代细胞疫苗以及vero细胞纯化疫苗等。这些疫苗在接种后可刺激机体产生中和抗体，从而在预防hfrs发生和流行方面起到积极的作用，但是病毒灭活疫苗刺激机体产生的中和抗体滴度往往不高，诱导产生细胞免疫应答的作用相对较弱，这种现状严重影响了人们对hfrs疾病的有效预防，因此需要进一步探索更为有效的新型疫苗。

多肽疫苗是基于抗原表位氨基酸序列而制备的一种新型分子疫苗，相对于传统的灭活疫苗或减毒活疫苗，多肽疫苗具有纯度高、批次之间稳定、成本低且特异性高等优点，并且安全性好、保护力强、应答类型可以有效调控且可诱导t细胞免疫应答来发挥抗病原微生物的作用，因此具有较高的研究和应用价值。国内外应用联合表位设计的多肽疫苗在抗感染及抗肿瘤等方面已有诸多报道，多种基于多肽表位的合成肽疫苗已进入临床研究阶段或已上市。合成表位肽能够直接与mhc分子结合，而不需要apc的加工处理，它与天然的内源性肽在激活免疫系统方面具有相同的效果。但由于单个抗原表位肽段长度较短、在体内易被降解且免疫原性较弱，通常不能够直接作为疫苗对机体进行免疫。在实际的应用中，为增强表位疫苗的免疫原性，通常需要采用各种方式对表位疫苗进行优化设计或构建成复合多表位疫苗来使用，同时使用安全高效的免疫佐剂，提高其免疫效果。目前常用的多肽疫苗设计方法包括多抗原表位的线性串联、多重抗原多肽空间模式、脂肽模式以及表位基因重组表达模式等。

已知对htnv结构蛋白抗原表位的鉴定是设计更为高效多肽疫苗分子的重要基础，在对htnv结构蛋白上抗原表位的研究中，已有诸多报道鉴定出多个htnv-np和gn/gc一级结构上的t细胞表位及具有中和活性的b细胞表位，如htnv特异性中和抗体3d8识别的b细胞抗原表位肽即糖蛋白⁸⁸²gflcpefpgsfrkkc⁸⁹⁶已被鉴定出，发现htnv-npc末端多肽aa301-aa315,aa355-aa369和aa415-aa429可诱导强烈的cd8⁺t细胞应答等。我们在之前研究工作中鉴定得到5个新的htnv-npcd8⁺t细胞9肽表位及其人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，hla)-ⅰ类分子限制性，利用计算机模拟软件预测并筛选出与hla-a*02具有高亲和力的htnv-gn/gc9肽ctl表位，在hfrs患者外周血中初步鉴定获得7个hla-a*02限制的htnv-gn/gc9肽ctl表位。其中hla-i类分子中等位基因hla-a*02在中国人群中分布最广、频率最高，因此hla-a*02是针对我国人群更为特异有效的疫苗设计研究中首选相关分子，也是进行相关基础研究最方便的模型。

t、b细胞表位的鉴定为多肽疫苗候选分子的设计构建提供了最重要的基础，但表位肽单独免疫往往免疫原性很弱，在多种感染性疾病的多肽疫苗研究中，联合多种、多个抗原表位而设计的表位串联多肽显示出良好的免疫原性，可诱导强烈的长时间的t、b细胞应答。多抗原表位的线性串联是直接将预测或鉴定得到的多个b细胞或t细胞抗原表位首尾相连构建出具有多种表位肽的复合多价表位疫苗，线性组合一般都采用人工合成，其中通用th表位具备不受mhc-ⅱ类分子，尤其是hla-dr分子限制的能力，因此诱导t细胞应答的能力是天然表位的一千倍以上。该方法可以有效增强抗原表位多肽的免疫原性，同时又可做到对各个抗原表位的准确定量。

由于htnv感染引起的hfrs发病率和死亡率高，但迄今为止仍无特异的预防和治疗方法，多肽疫苗已成为防治htnv感染研究的一个新策略，建立在已鉴定出htnv特异性抗原表位的基础之上，设计并合成免疫原性较强的htnv抗原表位串联多肽大分子即成为研究的关键。通过建立htnv表位串联多肽疫苗分子来诱导特异性t细胞应答发挥免疫保护作用，可作为有效预防htnv感染的重要手段。因此迫切需要研发针对中国人群的可用于预防和治疗htnv感染的安全性高且特异性高的表位肽疫苗。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种htnv抗原表位线性串联多肽及其应用，该线性串联多肽能够诱导特异性t细胞应答发挥免疫保护作用。

本发明的目的还在于提供一种hla-a*02/表位肽-复合物四聚体及其应用，该hla-a*02/表位肽-复合物四聚体能够与相应tcr特异性结合并且具有荧光。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种htnv抗原表位线性串联多肽，该串联多肽是由具有中和活性的htnvb细胞表位肽gc15、通用th表位泛dr表位肽以及hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位vv9组成的b+th+ctl线性串联多肽，其氨基酸序列如seqidno：4所示。

所述hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位vv9的氨基酸序列如seq.id.no：1所示；

所述通用th表位泛dr表位肽的氨基酸序列如seq.id.no：2所示；

所述具有中和活性的htnvb细胞表位肽gc15的氨基酸序列如seq.id.no：3所示；

其中，在seqidno：1所示表位肽的n端氨基酸上依次连接seqidno：2所示表位肽和seqidno：3所示表位肽，在seqidno：2所示表位肽和seqidno：3所示表位肽之间以三个丙氨酸作为连接肽，在seqidno：3所示表位肽的n端连接赖氨酸-丝氨酸-丝氨酸形成先导序列。

本发明还公开了上述的htnv抗原表位线性串联多肽在制备抗汉滩病毒的多肽疫苗中的应用。

所述多肽疫苗为诱导cd8⁺t细胞增殖的多肽疫苗。

所述多肽疫苗为分泌ifn-γ的多肽疫苗。

所述多肽疫苗为诱导cd8⁺t细胞表达cd107a的多肽疫苗。

所述多肽疫苗为诱导cd8⁺t细胞表达颗粒酶b的多肽疫苗。

多肽疫苗中htnv抗原表位线性串联多肽的浓度为1μm。

本发明还公开了一种hla-a*02/表位肽-复合物四聚体，包括4个单体，每个单体均为hla-a*02分子重链与β2微球蛋白在体外组装而成；hla-a*02分子重链的碳端接有被活化的生物素分子；hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位vv9通过锚定氨基酸结合至hla-a*02分子重链α1和α2结构域形成的抗原肽结合槽中；其中，所述hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位vv9的氨基酸序列为：vmaslvwpv(如seq.id.no：1所示)；

还包括标记了荧光素pe的亲和素，四个单体的生物素分子均与亲和素结合。

本发明还公开了上述的hla-a*02/表位肽-复合物四聚体在制备检测htnv-gn/gc表位肽特异性t细胞频率的药物试剂中的应用；

将荧光素标记的hla-a*02/表位肽-复合物四聚体与ctl细胞结合后，通过流式细胞仪检测，分辨htnv-gn/gc表位肽特异性t细胞的频率。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的htnv抗原表位线性串联多肽，其是由具有中和活性的htnvb细胞表位gc15、通用th表位padre以及hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位vv9组成的“b+th+ctl”htnv抗原表位线性串联多肽，线性串联多肽n端连接有赖氨酸-丝氨酸-丝氨酸(kss)作为先导序列，在gc15与padre之间通过三个丙氨酸(aaa)作为柔性linker，vv9直接连接在padre的碳端。与单一的hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位vv9相比，表位串联多肽具有诱导表位特异性ctl产生更高水平ifn-γ，更高频率杀伤介质以及更强烈的特异性ctl增殖的能力，并且其诱导的t细胞应答可有效降低htnv感染后hla-a2.1/k^b转基因小鼠体内多脏器中htnv抗原含量。

本发明提供的htnv抗原表位线性串联多肽在制备抗汉滩病毒的多肽疫苗中的应用，所制备的多肽疫苗可以诱导产生更强烈的ctl表位肽特异性的细胞毒性t细胞应答。

本发明提供的hla-a*02/表位肽-复合物四聚体，其标记有荧光素分子并连接有vv9，vv9能够与相应tcr特异性结合，进而使得相应tcr能够被荧光检测出来；还可以借助流式细胞仪检测，能够分辨htnv-gn/gc表位肽特异性t细胞的频率。

附图说明

图1为t2细胞结合试验确定hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位vv9表位的流式细胞术实验结果图。

图2-1为hla-a*02/表位肽-复合物四聚体染色结果散点图。

图2-2为vv9特异的ctl频率与hfrs患者分型关系图。

图3为表位线性串联多肽的设计结果图。

图4为elisopt检测各多肽免疫后hla-a2.1/k^b转基因小鼠脾脏中表位特异性ctl分泌ifn-γ的频率结果图。

图5-1为不同多肽免疫后tg小鼠脾细胞中htnv-gn/gc9肽ctl表位vv9特异性ctl表达cd107a的结果图。

图5-2为不同的多肽免疫后tg小鼠脾细胞中cd8⁺cd107a⁺t细胞频率的统计学比较。

图5-3为不同多肽免疫后tg小鼠脾细胞中htnv-gn/gc9肽ctl表位vv9特异性的ctl表达的颗粒酶b的结果图。

图5-4为不同的免疫后tg小鼠脾细胞中cd8⁺颗粒酶b⁺t细胞频率的统计学比较。

图6为cfse增殖实验检测不同多肽免疫后hla-a2.1/k^b转基因小鼠脾脏中ctl增殖能力结果图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明首先利用t2细胞系结合试验获得htnv76-118株糖蛋白gn/gc序列中hla-a*02最高亲和力htnv-gn/gcctl9肽表位及其氨基酸序列。进一步通过选择hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位、具有中和活性的b细胞表位及通用th表位，利用计算机辅助分子设计技术，设计基于htnv抗原表位的新型串联多肽抗原。通过设计“b+th+ctl”表位串联多肽，并在转基因小鼠体内对其免疫原性以及诱导特异性ctl应答的能力进行了评价，评估htnv表位串联多肽疫苗的有效性和潜在应用价值。

1、获得hla-a*02最高亲和力htnv-gn/gcctl9肽表位

t2细胞为t-b杂交瘤细胞系，其表面hla-a*02分子为阳性表达，但由于t2细胞为tap分子缺陷细胞系，因此不能加工内源性抗原，仅可以提呈外源性抗原肽。但是在无外源性抗原肽存在的条件下，其细胞表面hla-a*02分子表达极不稳定且容易很快降解，当抗原肽与之结合后，其表面hla-a*02分子表达明显增强，并且抗原肽与hla-a*02分子的亲和力越高，t2细胞表面的hla-a*02分子的表达水平就越高。因此，t2细胞系表面hla-a*02分子表达水平的增加可以直观的反映抗原肽与hla-a*02分子的亲和力。具体如下：

t2细胞系复苏后，20％fcsrpmi1640常规培养至对数生长期，使用无血清培养基rpmi1640调整细胞密度为2～4×10⁵/ml，加入无菌24孔细胞培养板中，每孔0.5ml即1～2×10⁵个细胞；向实验孔中分别加入htnv-gn/gc合成9肽，使htnv-gn/gc合成9肽终浓度达到50μm，同时加入β2微球蛋白(β2-m)，终浓度为2.5μg/ml；同时设置空白对照，即设置不加htnv-gn/gc合成9肽仅加入t2细胞系和β2-m的对照孔；设置阳性对照，即加入已鉴定出的hla-a*02限制的htnv-np9肽ctl表位肽；37℃5％co2培养18h；rpmi1640清洗细胞1次，离心后加入pe标记的小鼠抗人hla-a*02(hla-a*02-pe)，15μl/支，4℃孵育45min；fcm洗液洗涤1次，流式细胞仪检测；计算fi值，以fi值>1判定为高亲和力表位，计算公式如下：

fi＝(实验孔的pe平均荧光强度－空白对照孔pe平均荧光强度)/空白对照孔pe平均荧光强度

所得实验结果展示在表1中和图1中。

表1t2细胞结合实验筛选获得最高hla-a*02亲和力htnv糖蛋白9肽

fi：荧光指数.

^cfi＝(加载肽特定肽的平均pe荧光指数-未加载肽肽的平均pe荧光指数)/

(未加载肽肽的平均pe荧光指数).fi≥1为高亲和力表位肽

如表1所示，阳性对照肽即htnv-npctl表位肽aa129-aa137与t2细胞系结合后的fi值大于2，预测候选htnv-gn/gcctl9肽表位aa8-aa16(vmaslvwpv，vv9)fi值为3.67，在候选肽中fi值最高，且明显高于阳性对照fi值，可将其确定为hla-a2最高亲和力表位。

图1为t2细胞结合试验确定hla-a*02最高亲和力htnv-gn/gcctl9肽表位vv9的流式细胞术结果图，包括：同型对照(t2celllinewithoutpeptide)，表示未加载肽段的t2细胞表面表达hla-a*02分子的荧光强度；阳性对照(npaa129-aa137)，即加载了已知htnv-npctl表位肽aa129-aa137后t2细胞表面表达hla-a*02分子的荧光强度；实验肽(gppeptideindicated)，表示加载了预测得到的htnv-gn/gcctl9肽表位vv9后t2细胞表面表达hla-a*02分子的荧光强度。因此实验肽的峰值较同型对照峰值右移越多，表明该条肽vv9与hla-a*02分子结合的亲和力越高，越有可能是hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位。

2、hla-a*02/表位肽-复合物四聚体染色鉴定hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位

2.1从hfrs患者外周血中分离外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)

根据我国肾综合征出血热临床诊断标准(血清抗htnvigm抗体和临床症状)，无菌采集hfrs患者不同病情(轻型、中型、重型和危重型)、不同病期(发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期)的外周血并加入肝素钠抗凝(50u/ml)，对不同的采集情况进行编号。然后将采集的外周血用等量无血清rpmi1640培养液稀释混匀，用弯头吸管将已稀释的抗凝血缓缓叠加在淋巴细胞分离液上(在50ml离心管里预先加入10ml淋巴细胞分离液，购自天津灏洋生物公司)，2000rmp离心20min，小心吸取两层界面处的白色云雾层，用5倍体积的rpmi1640洗涤，1500rpm离心10min，再洗涤2次，获得hfrs患者外周血中pbmc；直接用于后续使用或用冻存液(90％fcs，10％dmso)重悬细胞，液氮冻存备用。

2.2流式细胞术(flowcytometry，fcm)筛选hla-a*02阳性的hfrs患者

复苏hfrs患者pbmc，每支实验管取细胞5×10⁵个，fcm洗液洗涤后加入正常羊血清1μl室温封闭10min；分别加入小鼠抗人hla-a*02-pe(10μl/支)，同时设置对照管即加入小鼠igg1-pe(10μl/支)作为检测hla-a*02的同型对照；4℃孵育30min，fcm洗液洗涤2次，1000rpm离心5min，hla-a*02实验管震荡混匀后加入300μlfcm固定液即可上机检测。

2.3hla-a*02/表位肽-复合物四聚体染色鉴定htnv-gn/gcctl9肽表位vv9并检测其特异的ctl频率

hla-a*02/表位肽-复合物四聚体，是由四个连接有生物素的hla-a*02/表位肽-复合物单体与一个亲和素分子结合所构成的四聚体；

而所述的hla-a*02/表位肽-复合物单体是将c端连接有被活化的生物素分子的hla-a*02分子重链与β2微球蛋白(β2-m)在体外组装，再结合表位肽vv9，而形成hla-a*02/表位肽-复合物单体。

在制备时，将hla-a*02分子重链与β2-m在体外组装(主要通过hla-a*02分子重链及β2-m蛋白的表达与纯化以及hla-a*02/肽-单体复性及纯化来实现)，结合特定的htnv-gn/gcctl9肽表位vv9，形成一个能够与相应tcr特异性结合的hla-a*02/表位肽-复合物单体，再在重链的c端连接1个被活化的生物素分子。将4个单体与1个亲和素分子结合，从而形成四聚体。由于亲和素上标记了荧光素pe，因此这种荧光素标记的四聚体可与htnv-gn/gcctl9肽表位vv9特异的ctl发生特异性结合，通过流式细胞仪即可检测htnv-gn/gcctl9肽表位vv9特异性t细胞的频率，用于特异性ctl频率的研究。

具体的，hla-a*02/表位肽-复合物四聚体委托北京旷博生物技术公司定制。

利用ifn-γ作为检测目标检测鉴定得到的hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位vv9对hfrs患者t细胞的特异性刺激作用，具体如下：

取hla-a*02阳性的hfrs患者或正常人pbmcs，每支实验管3～5×10⁶个，fcm洗液洗涤1次，1000rpm离心5min，弃上清，涡旋混匀；4℃取出hla-a*02/表位肽-复合物四聚体，低温离心14000g离心5min，使用时取上清，避免使用沉淀，以免引起非特异染色。每支实验管加入hla-a*02/表位肽-复合物四聚体10μl，室温避光孵育10min。同时设置无关hla-a*02/表位肽-复合物四聚体对照；设置同型对照管，取pbmc5×10⁵个，fcm洗液洗涤后加入小鼠igg1-pe，igg1-percp-cy5.5及igg1-apc各5μl；fcm洗液洗涤2次，1000rpm离心5min，弃上清，涡旋混匀，向实验管加入小鼠抗人cd8-percp-cy5.5和cd3-apc，涡旋混匀。冰上避光孵育20min；fcm洗液洗涤2次，1000rpm离心5min，弃上清，涡旋混匀。加入300μlfcm固定液混匀，流式细胞仪检测，收集至少5×10⁵个细胞。

hla-a*02/表位肽-复合物四聚体染色结果显示htnv-gn/gcctl9肽表位vv9特异的ctl可在hfrs患者pbmc中检测到(如图2-1所示)，并且发现hfrs轻型/重型患者外周血中htnv-gn/gcctl9肽表位vv9特异性ctl频率比重型/危重型患明显升高(p＝0.028)(如图2-2所示)。

图2-1和图2-2为hla-a*02/表位肽-复合物四聚体染色结果图以及统计学比较hla-a*02阳性的不同病情hfrs患者外周血中htnv-gn/gcctl9肽表位vv9特异的ctl频率。图2-1为应用flowjo软件在ssc和fsc散点图上设门圈出pbmc细胞群，再设门圈出cd3阳性细胞群，最后设门分析cd8⁺(横坐标)四聚体⁺(纵坐标)双阳性的细胞群比例，即为hfrs患者外周血中hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位vv9特异的ctl频率。频率越高，说明该表位在hfrs患者中诱导的ctl应答越强烈。图2-2为根据临床资料，将hfrs患者分为轻型/中型(mild/moderate)和重型/危重型(severe/critical)两组(横坐标)，分别比较hfrs患者外周血中htnv-gn/gcctl9肽表位vv9特异的ctl频率(纵坐标)。结果显示htnv-gn/gcctl9肽表位vv9特异的ctl频率均在轻型/中型患者中明显高于重型/危重型患者(p＝0.028)，提示鉴定得到的hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位vv9特异性ctl应答可能在hfrs疾病过程中发挥着免疫保护作用。

3表位串联多肽的设计以及多肽合成、纯化与鉴定

3.1表位串联多肽的设计

表位串联多肽的设计原理

设计表位串联多肽时，表位的选择和排列组合是构建表位疫苗的关键。选择具有免疫保护作用的t细胞表位和具有中活性的b细胞表位，同时引入通用th细胞表位并加入适当的间隔序列进行设计。t细胞表位可使串联多肽能够有效地引起免疫应答，同时t细胞表位是受mhc分子限制，只有被mhc分子识别后才能引起免疫应答，所以t细胞表位的选择至关重要。加入间隔序列即短而高柔性的铰链区设计有效地分隔表位，避免新表位的产生，保证各表位具有独立的抗原性。在hla的各个等位基因中，hla-a*02是中国人群中分布最广最具多态性的i类分子和基因家族，也是陕西人群hla-a基因座位中的绝对优势基因，因此选择已鉴定出的能够诱导免疫保护性应答的hla-a*02高亲和力htnv-gn/gcctl9肽表位vv9，作为设计针对中国人群的htnv新型表位疫苗的首选表位肽段。同时，htnv特异性中和抗体3d8识别的b细胞抗原表位即htnv-gn/gc⁸⁸²gflcpefpgsfrkkc⁸⁹⁶(gc15)前期已被鉴定出。

选择常用通用th表位泛dr表位(pandrepitope,padre)，其氨基酸序列akxvaawtlkaaa(x＝cyclohexylalanine，环己基丙氨酸)。该十三肽具备不受mhc-ⅱ类分子，尤其是hla-dr分子限制的能力，且诱导t细胞应答的能力是天然表位的一千倍以上。

表位串联多肽的设计方案

构建p1肽为hla-a*02限制性htnv-gn/gcctl9肽表位vv9；p2肽为htnv-gn/gcctl9肽表位vv9的n端连接gn/gc上中和活性b细胞表位；p3肽为在htnv-gn/gcctl9肽表位vv9的n端氨基酸上顺序连接通用th表位padre和gn/gc上中和活性b细胞表位。在两个不同表位间分别引入三个丙氨酸aaa作为柔性linker，每条肽n端连接先导序列即赖氨酸-丝氨酸-丝氨酸(kss)(如图3所示)。

图3为三组表位串联多肽的设计结果图。其中p1多肽为hla-a*02限制性htnv-gn/gcctl9肽表位vv9(vmaslvwpv)，并在其n端连接先导序列kss；p2肽为htnv-gn/gcctl9肽表位vv9的n端通过连接aaa再与gn/gc上中和活性b细胞表位gc15(gflcpefpgsfrkkc)相连，并在gc15的n端连接先导序列kss；p3肽为htnv-gn/gcctl9肽表位vv9的n端氨基酸上顺序连接通用th表位padre(akxvaawtlkaaa)，再通过连接aaa与b细胞表位gc15相连，并在gc15的n端连接先导序列kss。

3.2表位串联多肽的合成、纯化与鉴定

委托上海杰肽生物科技有限公司(synpeptideco.,ltd)进行合成纯化。以鉴定出的hla-a*02限制性htnv-gn/gcctl9肽表位vv9、通用th表位padre以及gn/gc上中和活性b细胞表位氨基酸序列为依据，采用merrifield固相化学合成方案，固定羧基端向氨基端延伸肽链。合成多肽以高效液相色谱(waters600)纯化，质谱(api2000)分析分子质量与电荷分布，纯化产物经低压旋转蒸发及乙醚沉淀，获得多肽纯品，-70℃储存。使用前，先用50μldmso溶解冻干粉，再根据分子量加入pbs，使终浓度(储存浓度)达到1μm。

4多肽免疫hla-a2.1/k^b转基因小鼠检测体内诱导免疫应答能力

4.1多肽免疫hla-a2.1/k^b转基因小鼠方案的确定

为进一步明确表位串联多肽在体内是否可诱导更为有效的免疫保护作用，分别应用不同多肽免疫hla-a2.1/k^b转基因小鼠进行体内实验研究。同时设置已鉴定出的hla-b*35限制性htnv-npctl表位(aa131-aa139，vpillkaly，vy9)作为无关肽对照组，应用商品化双价肾综合征出血热灭活疫苗(浙江天元生物药业有限公司)肌肉注射作为阳性对照。36只hla-a2.1/k^b转基因小鼠(tg)购于第三军医大学免疫学教研室，分组方案如下：

①p1：vv9(vmaslvwpv)+gp96；

②p2：gc15(gflcpefpgsfrkkc)-vv9(vmaslvwpv)+gp96；

③p3：gc15(gflcpefpgsfrkkc)-padre(akxvaawtlkaaa)-vv9(vmaslvwpv)+gp96；

④无关肽vy9(vpillkaly)+gp96；

⑤灭活疫苗+攻毒(阳性对照)；

⑥pbs+攻毒(阴性对照)。

采用htnv9肽表位/gp96/弗氏佐剂免疫方案免疫转基因小鼠，按照随机原则分成两组，实验组6只小鼠，每只小鼠头背部皮下4～5个位置多点注射1：1混合的弗氏完全佐剂(sigma)与多肽(50μg)+gp96(30μg)(每个位点注射量约40～50μl)，分别于初次免疫10天和20天后，不完全弗氏佐剂乳化相同含量多肽和gp96，相同方法免疫小鼠。对照组一相同方法注射1：1混合的弗氏完全或不完全佐剂与pbs缓冲液+gp96(30μg)。对照组二相同方法注射1：1混合的弗氏完全或不完全佐剂与无关9肽(50μg)+gp96(30μg)。即共免疫三次，每次间隔10天，末次免疫后10天，每组各取5只小鼠，摘取小鼠脾脏，制成单细胞悬液，裂解红细胞后用于进一步实验检测。

4.2elispot检测免疫后tg小鼠脾细胞中表位特异性效应ctl分泌ifn-γ的能力

采用商品化ifn-γelispot试剂盒(购自mabtech公司)鉴定htnv-gn/gcctl9肽表位vv9能否刺激pbmc分泌ifn-γ，按照说明书进行操作如下：

从4℃取出商品化预包被elispot板，无菌去离子水清洗3遍；加入10％fcs的rpmi1640，200μl/孔，37℃封闭2h；除去封闭液，每孔加入1×10⁶个免疫后的各组转基因小鼠脾细胞，并加入htnv-gn/gcctl9肽表位vv9(终浓度10μm)，37℃孵育18～24h；同时设阳性和阴性对照，阳性对照孔加入pha(终浓度10μg/ml)或抗cd3mab(终浓度10μg/ml)，阴性对照孔仅加入脾细胞；pbs清洗6次，每孔加入1:200稀释的检测抗体50μl，室温孵育2h；pbs清洗6次，每孔加入bcip/nbt显色液100μl，室温避光显色1h；自来水冲洗板子，自然晾干。

应用ctl公司elispot读数仪计数ifn-γ斑点形成细胞数。根据文献报道，阳性应答定义标准为每孔斑点数≥50sfcs/10⁶效应细胞，且斑点数至少为阴性对照孔斑点数的3倍以上。按照如下公式计算标准化为sfcs/10⁶细胞：sfc/10⁶细胞＝[(阳性实验孔斑点数－阴性对照孔斑点数)/每孔加入的效应细胞总数]×10⁶。

与hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位vv9(p1)相比，表位串联多肽p2与表位串联多肽p3分别免疫tg小鼠后诱导vv9表位特异性ctl分泌ifn-γ的频率明显升高(p<0.001)，尤其是表位串联多肽p2诱导特异性ctl分泌ifn-γ的频率较表位串联多肽p3更高(p<0.001)(如图4所示)，提示通用th表位在辅助ctl表位诱导细胞免疫应答过程中发挥着非常重要的作用。

图4为elisopt检测各表位多肽免疫后hla-a2.1/k^b转基因小鼠脾脏中表位特异性ctl分泌ifn-γ的频率结果图。其中横坐标为各免疫组，依次为p2多肽(kss-gflcpefpgsfrkkc-aaa-vmaslvwpv)、p3多肽(kss-gflcpefpgsfrkkc-aaa-akxvaawtlkaaa-vmaslvwpv)、p1多肽(kss-vmaslvwpv)、无关肽(vpillkaly)、htnv灭活疫苗和pbs免疫组。纵坐标表示各免疫组小鼠脾细胞在多肽刺激条件下分泌ifn-γ的频率。sfc(spotformingcell)即斑点形成细胞数。

4.3不同设计组表位串联多肽体外诱导的多肽特异性效应ctl分泌杀伤介质的频率检测

应用胞内细胞因子染色技术，对各组表位串联多肽体外诱导的多肽特异性效应ctl分泌杀伤介质的频率进行检测，具体操作如下：

将免疫后的tg小鼠脾细胞与相应的串联多肽或单肽以及cd28/cd49d单抗(bd公司，用于协同刺激抗原肽特异性t细胞细胞因子的产生)共同孵育1小时后，再加入胞内蛋白转运抑制剂布雷菲德菌素a(brefeldina，bfa)共同孵育5小时，经破膜，用不同荧光素标记的颗粒酶b(granzymeb)以及cd107a等杀伤介质mab以及cd3mab、cd8mab(bd公司)染色，固定后，流式细胞仪分析脾细胞中htnv-gn/gcctl9肽表位vv9特异性ctl胞内杀伤介质产生的频率。

三条多肽(p1、p2和p3)分别免疫后tg小鼠脾细胞中htnv-gn/gcctl9肽表位vv9特异性的ctl均可不同程度表达cd107a(如图5-1所示)以及颗粒酶b(如图5-3所示)。统计学比较分析发现，与htnv-gn/gcctl9肽表位vv9(p1)免疫后的tg小鼠相比，串联多肽p3免疫后的tg小鼠脾细胞中cd8⁺cd107a⁺t细胞的频率有所升高，但统计学差异不明显；串联多肽p3免疫后的tg小鼠脾细胞中cd8⁺cd107a⁺t细胞的频率较无关肽对照组和pbs组明显升高(p<0.05)(如图5-2所示)。与htnv-gn/gcctl9肽表位vv9(p1)免疫后的tg小鼠相比，串联多肽p2和p3分别免疫后的tg小鼠脾细胞中cd8⁺颗粒酶b⁺t细胞的频率均有不同程度升高，尤其是串联多肽p3免疫小鼠脾细胞中cd8⁺颗粒酶b⁺t细胞频率明显高于htnv-gn/gcctl9肽表位vv9(p1)免疫小鼠(p<0.01)，也高于无关肽(vy9)对照组和pbs组免疫小鼠(p<0.05)(如图5-4所示)。以上结果提示串联多肽p3较p1在tg小鼠体内可能诱导htnv-gn/gcctl9肽表位vv9特异性ctl产生更高频率的杀伤介质和更强烈的杀伤效应。

图5-1、图5-2、图5-3和图5-4为胞内细胞因子染色检测各表位多肽免疫后hla-a2.1/k^b转基因小鼠脾脏中表位特异性ctl分泌杀伤介质的频率结果图，其中图5-1和图5-3为fcm散点图表示结果，第一排从左至右依次为经p1多肽(kss-vmaslvwpv)、p2多肽(kss-gflcpefpgsfrkkc-aaa-vmaslvwpv)和p3多肽(kss-gflcpefpgsfrkkc-aaa-akxvaawtlkaaa-vmaslvwpv)免疫后小鼠脾细胞分泌或表达杀伤介质的水平，第二排从左至右依次为经无关肽(vpillkaly)、htnv灭活疫苗和pbs免疫后小鼠脾细胞分泌或表达杀伤介质的水平，横坐标均为cd8表达荧光强度，图5-1纵坐标为cd107a表达荧光强度，图5-3纵坐标为颗粒酶b表达荧光强度。各组散点图中右上象限即cd8⁺cd107a⁺或cd8⁺颗粒酶b⁺细胞频率为检测和统计指标。图5-2和图5-4横坐标均为各免疫组小鼠，图5-2纵坐标为表达cd107a的cd8⁺t细胞频率，图5-4纵坐标为分泌颗粒酶b的cd8⁺t细胞频率。与p1多肽相比，p3多肽免疫组可诱导cd8⁺t细胞分泌和表达更高水平的颗粒酶b和cd107a。

4.4不同设计组表位串联多肽体外诱导多肽表位特异性效应ctl增殖能力的检测

应用cfse染色对各组表位串联多肽体外诱导的多肽表位特异性效应ctl增殖能力进行检测，具体操作如下：

用5μmcsfe(eugene公司)标记各组多肽表位免疫后的tg小鼠脾细胞(1×10⁶)，洗涤后，加入htnv-gn/gcctl9肽表位vv9共同孵育，不加肽刺激作为阴性对照组，pha刺激作为阳性对照。培养5天后，用cd3和cd8荧光素标记mab染色，固定，流式细胞仪分析csfe阳性峰的位置和峰型，检测脾细胞中htnv-gn/gcctl9肽表位vv9特异性ctl对特定抗原肽刺激的增殖能力。

与未刺激组相比，三条肽(p1、p2和p3)分别免疫后tg小鼠脾细胞htnv-gn/gcctl9肽表位vv9特异性cd8⁺t细胞在多肽刺激下均呈现出不同程度的增殖能力，其中hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位vv9(p1)免疫小鼠后可诱导脾细胞中2.2％的表位特异性cd8⁺t细胞产生增殖效应，而表位串联多肽p2和p3免疫后的tg小鼠脾细胞中分别有11.0％和27.0％的表位特异性cd8⁺t细胞发生明显增殖，同时该增殖频率也远高于无关肽(vy9)对照组(3.9％)、疫苗免疫组(2.7％)和pbs组(1.7％)免疫小鼠(图6)。该结果提示串联多肽p2和p3，尤其是p3，较vv9表位(p1)可在tg小鼠体内诱导更高频率的vv9表位特异性ctl发生增殖。

图6为cfse增殖实验检测各表位串联多肽免疫后hla-a2.1/k^b转基因小鼠脾脏中ctl增殖能力结果图。采用fcm柱状图表示，横坐标为cfse荧光强度，纵坐标为细胞数。其中第一排从左至右依次为经p2多肽(kss-gflcpefpgsfrkkc-aaa-vmaslvwpv)、p3多肽(kss-gflcpefpgsfrkkc-aaa-akxvaawtlkaaa-vmaslvwpv)和p1多肽(kss-vmaslvwpv)免疫后小鼠脾细胞增殖能力，第二排从左至右依次为经无关肽(vpillkaly)、htnv灭活疫苗和pbs免疫后小鼠脾细胞增殖能力。每一组中nostimuli线条表示小鼠脾细胞在没有任何条件刺激的增殖水平，peptideorvaccinestimuli线条表示小鼠脾细胞在各组相应多肽或灭活疫苗刺激条件下的增殖水平，pha线条表示小鼠脾细胞在pha刺激条件下的增殖水平。其中在没有受任何刺激的条件下，cfse标记的小鼠脾细胞平均荧光强度最强，而pha非特异刺激条件下脾细胞增殖分裂最强，因而cfse平均荧光强度明显降低。多肽刺激的各组小鼠脾细胞均发生不同程度的增殖，因而cfse平均荧光强度不同程度的下降，尤其以p3多肽免疫组(27％)最为明显，高于p1多肽和p2多肽免疫组。

通过选择具有中和活性的htnvb细胞表位gc15、通用th表位padre以及hla-a*02限制的htnv-gn/gcctl9肽表位vv9，设计出的表位串联多肽“b+ctl”(kss-gflcpefpgsfrkkc-aaa-vmaslvwp)或“b+th+ctl”(kss-gflcpefpgsfrkkc-aaa-akxvaawtlkaaa-vmaslvwpv)，与vv9单一ctl表位相比，表位串联多肽具有诱导表位特异性ctl产生更高水平ifn-γ，更高频率杀伤介质以及更强烈的特异性ctl增殖的能力。该表位串联肽的序列及构建方案可作为htnv多肽疫苗设计研究的候选疫苗分子，可为设计新型htnv表位肽疫苗提供重要的理论和实验依据，在hfrs特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。

核苷酸序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>一种htnv抗原表位线性串联多肽及表位肽-复合物四聚体和应用

<160>5

<210>1

<211>9

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

valmetalaserleuvaltrpproval

159

<210>2

<211>12

<212>prt

<213>人工合成

<400>2

lysserservalmetalaserleuvaltrpproval

151012

<210>3

<211>30

<212>prt

<213>人工合成

<400>3

lysserserglypheleucysproglupheproglyserphearglys

151015

lyscysalaalaalavalmetalaserleuvaltrpproval

202530

<210>4

<211>43

<212>prt

<213>人工合成

<400>4

lysserserglypheleucysproglupheproglyserphearglys

151015

lyscysalaalaalaalalyschavalalaalatrpthrleulysala

202530

alaalavalmetalaserleuvaltrpproval

354043

<210>5

<211>9

<212>prt

<213>人工合成

<400>5

valproileleuleulysalaleutyr

159