强脉冲光促进衰老成纤维细胞分泌细胞外基质的方法与流程

本发明涉及促进细胞外基质分泌的方法，特别是一种强脉冲光促进衰老成纤维细胞分泌细胞外基质的方法。

背景技术：

衰老(aging，senescence)是一个由遗传和环境因素共同调节的、生物体必然发生的、程序化控制的生理学过程，既是生物体的整体衰老，更是每个器官、组织的老化及功能衰退。衰老的进程包含有多个生理学现象，例如：细胞外基质分泌的减少，细胞数目的减少、组织蛋白的退化、组织的萎缩、代谢率的下降、钙代谢的紊乱等等，这些生理学发生的过程中又可能伴随有各种病理学过程的发生。衰老发生的原因及机制是多方面的，很多方面尚不明确。

皮肤的衰老反映在细胞水平上即为细胞衰老。成纤维细胞是皮肤真皮组织中的主要细胞成分，它可以分泌胶原纤维、弹性纤维及细胞外基质成分，与成纤维细胞一道构成了真皮的主体成分。大量的研究表明，成纤维细胞因其所特有的生物学特性发生改变，在皮肤衰老的过程中扮演着十分重要的角色。并且由于皮肤成纤维细胞容易获取，又易于在体外培养生长，目前皮肤成纤维细胞已在皮肤老化相关研究中得到广泛的运用。

cn101648010a公开了一种促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂，包括组分a)、组分b)和组分c)；其中所述组分a)为禽蛋的蛋清，组分b)为蛋清溶菌酶，组分c)为丙酮酸或丙酮酸盐。

cn105998037a公开了多西环素在制备治疗和/或预防衰老性疾病的药物中的用途，其中所述多西环素以等于或小于2μg/ml的剂量施用；其中所述衰老性疾病包括皮肤老化、神经退行性疾病、2型糖尿病、动脉粥样硬化、冠心病。

cn104473834a公开了蚂蚁提取物作为有效成分在制备化妆品中的应用，所述蚂蚁提取物能够抑制黑色素瘤细胞增殖，具有一定的祛斑美白作用；蚂蚁提取物还能保护皮肤成纤维细胞活力，显著增加皮肤中胶原蛋白和羟脯氨酸的分泌，增强皮肤弹性，具有一定的抗衰老作用；同时蚂蚁提取物能提升超氧化物歧化酶(sod)活力并减少活性氧(ros)的产生，具有一定的抗氧化作用。

cn1661010a公开了一种制备软骨细胞的方法，包括步骤：(a)在适合生长的条件下，将成纤维细胞在含软骨源性形态发生蛋白的成纤维细胞培养液中培养3-30天，从而使成纤维细胞诱导形成软骨细胞；(b)从培养物中分离出软骨细胞。

cn103396982a公开了一种骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞方法的应用，所述的细胞外基质为诱导骨髓间充质干细胞所分泌的并且去除了骨髓间充质干细胞的基质。

cn105274051a公开了一种用于培养间质基质细胞的方法，所述方法包括以下步骤：a.在包括碱性成纤维细胞生长因子bfgf的培养基存在下，允许培养直至第一预定传代的所述间质基质细胞扩增至第二预定传代；其中，当所述细胞实现至少一个预定汇合时，通过使所述细胞与所述培养基接触进行所述扩增；并且其中，当与所述第一预定传代的细胞数目相比，所述方法在所述第二预定传代结束时使所述细胞的数目增加了2000倍。

cn104928237a公开了一种刺激软骨细胞外基质分泌的培养基，该用于刺激软骨细胞分泌软骨细胞外基质包括：基础培养基、骨形成蛋白bmp-2或者其类似物、多西环素和地塞米松。

us2009/059015a公开了一种液体组合物，其含有心脏来源的脱细胞化细胞外基质，其中所述液体组合物是中和溶液，所述脱细胞化细胞外基质在所述溶液中的浓度在2mg/ml～10mg/ml的范围内，且所述液体组合物在体内转变为凝胶形式，且其中所述液体组合物能通过注射导管以合适的阻力输送且不阻塞导管，且其中所述组合物通过以下方法获得，所述方法包括：(a)获取具有细胞外基质组分和非细胞外基质组分的心脏组织样品；(b)以洗涤剂处理组织样品以去除非细胞外基质组分，从而得到脱细胞化细胞外基质；(c)将脱细胞化细胞外基质研磨成粉末；(d)以胃蛋白酶消化步骤(c)的脱细胞化细胞外基质；以及(e)将步骤(d)的经消化的脱细胞化细胞外基质的ph中和以产生所述液体组合物。

“虫草多糖对8-mop/uva诱导光老化皮肤成纤维细胞胶原的影响”，李华等，《上海中医药大学学报》，2009年04期，探讨了虫草多糖(cp)对皮肤成纤维细胞光老化保护作用中对胶原的影响，其中用8-甲氧补骨脂素联合uva(8-mop/uva)诱导皮肤成纤维细胞光老化，用电镜观察、羟脯氨酸含量、丙二醛含量测定及免疫细胞化学等方法观察虫草多糖对成纤维细胞光老化过程中胶原的影响。

然而，在上述文献和其它现有技术中，缺少一种促进衰老成纤维细胞的细胞外基质分泌的有效手段。本领域需要一种能够以高效率方式促进衰老成纤维细胞外基质分泌的方法。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明人经过深入研究和大量实验，提供了以下技术方案。

在本发明的一方面，提供了一种强脉冲光促进衰老成纤维细胞分泌细胞外基质的方法，该方法包括用强脉冲光对衰老成纤维细胞进行辐照。

优选地，所述强脉冲光的波长为600-1000nm，优选700-950nm，更优选800-900nm。

优选地，所述强脉冲光为连续波长的强脉冲光，优选在所述波长范围内的连续波长的强脉冲光。

优选地，所述强脉冲光辐照是在21ms内连续从10j/cm²、15j/cm²、20j/cm²、25j/cm²、30j/cm²、35j/cm²变换到40j/cm²，每种照射能量下平均分配时间，不断循环，共辐照10min-2h，优选1.5h。

在一个优选实施方式中，在分泌促进剂存在下用强脉冲光对衰老成纤维细胞进行辐照。所述分泌促进剂优选为葡糖苷类化合物。

在本发明的另一方面，提供了一种可用于促进衰老成纤维细胞分泌细胞外基质的分泌促进剂，其为葡糖苷类化合物。

本发明还提供了所述分泌促进剂的制备方法，其通过从天然物质提取或提取后进一步改性得到。

在本发明的又一方面，提供了所述分泌促进剂在促进衰老成纤维细胞分泌细胞外基质中的用途，其用于强脉冲光辐照下促进衰老成纤维细胞分泌细胞外基质。

优选地，所述衰老成纤维细胞为人体外或动物体外衰老成纤维细胞。

优选地，所述衰老成纤维细胞为体外培养人或动物正常或衰老纤维细胞。

所述体外培养人正常或动物衰老成纤维细胞通过如下方法得到：

(1)将皮肤组织切除皮下脂肪组织，然后切取1cm×0.3cm大小的一块，置于含青霉素和链霉素各100u/ml的dmem培养基中浸泡15min；

(2)用pbs缓冲液反复冲洗后，剪切成1～2mm的小块，然后加入0.25wt.％胰蛋白酶，于37℃条件下继续消化5～8小时；

(3)在消化的同时进行振荡，随时在显微镜下观察消化结果，当成纤维细胞大部分从包裹的细胞外基质纤维中分离出来时，用含10％小牛血清的dmem培养基终止消化。

(4)用100目不锈钢网过滤，去除大的组织块残渣，将滤液慢速离心(优选800-1000r/5～10min)，取上清液，将上清液以1000rpm离心3～6min，弃上清，加pbs5ml，重悬后以1000rpm再离心5～8min，弃上清，然后加入含20wt.％小牛血清的dmem培养基重悬，细胞计数后以2.5～3×10⁵细胞/50ml一次性培养瓶接种；

(5)然后每隔3天换一次培养液，待细胞融合后，用胰酶消化后传代，体外培养3～6代细胞，即得所需的衰老成纤维细胞。

所述皮肤组织可以例如为人施行眼袋切除术的眼睑周围的正常皮肤，或者为人体耳后切除的皮肤，或者可以为小鼠腹部皮肤。在获得人体相关皮肤组织之前与患者签订了相关知情协议。

通过所述方法获得的成纤维细胞生长状态非常良好，具有良好的活性，适合进行脉冲光促进细胞外基质分泌。可以通过mtt比色法测定对细胞活性进行测量，检测发现该培养方法获得的成纤维细胞比本领域普通方法获得的成纤维细胞生长状态要好很多。

在用强脉冲光对衰老成纤维细胞进行辐照之前，用分泌促进剂将成纤维细胞进行预处理，该预处理可以包括以下步骤：向上述方法获得的成纤维细胞加入含10％小牛血清的emdm培养基，所述培养基预先加入有基于该培养基重量计0.01-1.0wt.％的分泌促进剂。emdm培养基的加入量没有严格限制，可以采用本领域的常规加入量。

将预处理后的成纤维细胞接种于孔板中，然后用强脉冲光照射。

优选地，所述照射调节为：波长范围：600-1000nm，优选700-950nm，更优选800-900nm；光斑面积为25mm×40mm；脉冲宽度：21ms，从1档至7档分别为，能量分别是10j/cm²、15j/cm²、20j/cm²、25j/cm²、30j/cm²、35j/cm²、40j/cm²，每种照射能量下平均分配时间(即，每个档位保持3ms)，不断循环，共辐照10min-2h。

可以采用mtt染色法测定其细胞外基质分泌情况。

优选地，所述分泌促进剂为葡糖苷类化合物。更优选地，所述葡糖苷类化合物为下式(i)所示的化合物：

其中r为-ch3或-oh。

该分泌促进剂含有黄酮结构，可以通过减轻氧化应激反应损伤，保护或修复了dna，促进细胞增殖和基质分泌，抑制损伤细胞凋亡，诱导细胞修复或增殖，其发挥作用的机制在进一步研究中。此外，该黄酮化合物与一般黄酮化合物或多酚化合物相比，由于葡糖基的存在，具有较小的免疫毒性。

所述分泌促进剂的制备方法可以包括以下步骤：

(1)取白菊花(例如来自杭州桐庐的杭白菊)500g，将其在-80℃下冻干，然后研磨成细粉末，装入到具有teflon旋塞的玻璃柱中(80cm长，直径为10cm)，然后依次用正己烷、乙酸乙酯和甲醇(三种溶剂的量均为1.0l)流动萃取，每种溶剂循环3-6次，将所述提取液合并，在减压条件下将上述合并的提取液于30-45℃分别蒸发基本至干，得到浓缩物；

(2)将所述浓缩物溶解在100ml甲醇-水(1∶1v∶v)中，加入活性炭脱色，然后在-80℃下冻干得到固体粉末。再将所述固体粉末溶解在300ml甲醇-水(5∶1v∶v)中，过sephadexlh-20柱，进行柱层析分离，用甲醇作为洗脱液，通过紫外灯下检测收集各个洗脱液部分(例如采用本领域技术人员树脂的硅胶板)，其中具体收集第2和第5部分洗脱液，在30-45℃分别蒸发基本至干，得到浓缩物；

(3)将第2和第5部分洗脱液对应的浓缩物分别溶解在500ml甲醇-水(1∶1v∶v)中，加入活性炭脱色，然后在-80℃下冻干分别得到固体粉末1和2。

固体粉末1为上述式(i)化合物中r为甲基的情形，固体粉末2为上述式(i)化合物中r为羟基的情形。

在本发明中，可以将固体粉末1和2按照1∶5-5∶1的重量比混合使用，也可以单独使用。研究发现，混合使用比单独使用具有更好的效果。

当r为羟基(-oh)时，可以通过常规反应使其与嘌呤上的亚氨基反应而与嘌呤相连，所述亚氨基即下式中9位的氢：

嘌呤基团的引入可以进一步增强该分泌促进剂与成纤维细胞的生物相容性，从而更有利于分泌促进剂进入细胞内和细胞外基质内，且不会引起特异反应。

在本发明的另一方面，提供了一种分泌促进剂，其结构式同上文所述。

在本发明的又一方面，提供了上述分泌促进剂在促进衰老成纤维细胞分泌细胞外基质中的用途。优选地，其用于强脉冲光促进衰老成纤维细胞分泌细胞外基质，其中用所述分泌促进剂将成纤维细胞进行预处理，然后用强脉冲光辐照，促进衰老成纤维细胞分泌细胞外基质。

本发明的方法可以促进成纤维细胞胶原蛋白及弹性蛋白的合成，提高超氧化物歧化酶活力，清除自由基，延缓皮肤老化，为其应用于皮肤老化的防治提供了实验依据。

附图说明

图1是根据本发明实施例2的方法辐照后衰老成纤维细胞的显微镜图；

图2是根据本发明实施例2和对比例1测得的细胞外基质随辐照时间的变化曲线图。

具体实施方案

下面结合以下实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

按照下述方法制备式(i)所示分泌促进剂：取来自杭州桐庐的杭白菊500g，将其在-80℃下冻干，然后研磨成细粉末，装入到具有teflon旋塞的玻璃柱中(80cm长，直径为10cm)，然后依次用正己烷、乙酸乙酯和甲醇(三种溶剂的量均为1.0l)流动萃取，每种溶剂循环3次，将所述提取液合并，在减压条件下将上述合并的提取液于30℃分别蒸发基本至干，得到浓缩物；将所述浓缩物溶解在100ml甲醇-水(1∶1v∶v)中，加入活性炭脱色，然后在-80℃下冻干得到固体粉末。再将所述固体粉末溶解在300ml甲醇-水(5∶1v∶v)中，过sephadexlh-20柱，进行柱层析分离，用甲醇作为洗脱液，通过紫外灯下检测收集各个洗脱液部分，具体收集第2和第5部分洗脱液，在30℃分别蒸发基本至干，得到浓缩物；将第2和第5部分洗脱液对应的浓缩物分别溶解在500ml甲醇-水(1∶1v∶v)中，加入活性炭脱色，然后在-80℃下冻干分别得到固体粉末1和2，将固体粉末1和2按照1∶1的重量比混合，用作分泌促进剂。

实施例2

取大鼠腹部皮肤，按照前文所述方法进行培养，向培养获得的成纤维细胞加入含10％小牛血清的emdm培养基，所述培养基预先加入有基于该培养基重量计0.02wt.％的实施例1分泌促进剂，然后接种于孔板中，用强脉冲光照射。所述照射调节为：波长范围：700nm-900nm；光斑面积为25mm×40mm；脉冲宽度：21ms，从1档至7档分别为，能量分别是10j/cm²、15j/cm²、20j/cm²、25j/cm²、30j/cm²、35j/cm²、40j/cm²，每种照射能量下平均分配时间，不断循环，共辐照1.5h。采用mtt染色比色法测定其细胞外基质分泌情况。

对比例1

重复实施例1的操作，对比例1与实施例1的区别仅在于培养时不加入所述分泌促进剂。

由图1可以看出，本发明的衰老成纤维细胞在经过上述处理后细胞间融合的比较好，衰老成纤维细胞的形态发生了变化，细胞核变大尤其明显。这表明本发明的促进方法能够特别有效促进细胞外基质的分泌。由图2(横坐标为时间，min，纵坐标为细胞外基质的浓度，μg/ml，上面的曲线为根据实施例1测得，下面的曲线为根据对比例1测得)可以看出，当加入本发明的分泌促进剂时，细胞外基质的分泌量增加较多，在90min时仍在持续增加，当不加入分泌促进剂时，从60min到90min，细胞外基质的量几乎没有增长。

研究还发现，本发明的分泌促进剂的加入，可以影响胶原蛋白的合成与分泌。另外，本发明的促进剂容易进入细胞内，这种促进作用更为明显。

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