嘧啶并二氮*类衍生物及其医药用途的制作方法

本发明涉及嘧啶并二氮类衍生物及其在药物学上可接受的盐、前药和药物组合物，还涉及其制备以及其作为药物的应用，特别是作为苯二氮受体拮抗剂的应用。

背景技术：

氟马西尼是第一个特异性苯二氮受体选择性拮抗剂,作用于脑中苯二氮受体,阻滞该受体而不产生苯二氮类药物的作用,临床上用于终止由苯二氮类药物诱导和维持的全身麻醉,以及该类药物中毒的急救，同位素标记的氟马西尼还可以用于癫痫病灶等的pet-ct显像。

技术实现要素：

本发明的化合物具有如权利要求1所描述的含嘧啶环的氟马西尼类似物结构，这种新类型的含嘧啶环的氟马西尼类似物的结构的特点是嘧啶环6位为h或被卤素所取代；另外，二氮杂环中n原子上带有烃基取代基。本发明提供了式ⅰ所示的化合物及其药学可接受的盐、异构体、溶剂化物。

其中：

r为甲基、乙基、三氟乙基、环丙基、异丙基和苄基，

x为氢或氯，

本发明式ⅰ还可以是其盐的形式，一般是与有机或无机碱或酸形成的盐。

本发明优选生理学可接受的盐。本发明化合物的生理学可接受的盐可以是本发明物质与无机酸、羧酸或磺酸的盐，特别优选的是例如与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、扑酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、鞣酸形成的盐。其它的酸，如草酸，虽然其本身并非药学上可接受的，但可以用于制备用作中间体的盐，以获得本发明化合物及其药学上可接受的盐。

生理学上可接受的盐同样可以是具有游离羧基的本发明化合物的金属或铵盐。特别优选的是如钠、钾、镁或钙盐、以及无机氨或有机胺如乙胺、二乙胺、三乙胺、n,n’-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、胆碱、n-甲基葡糖胺和普鲁卡因、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己基胺、二甲基氨基乙醇、精氨酸、赖氨酸或乙二胺的铵盐。

本发明的化合物还可以是其可能的溶剂化物。

本发明还涉及制备本发明式ⅰ化合物的合成方法，包括:

1)将4,6-二氯-2-甲巯基嘧啶-5-甲酸(ⅱ)与草酰氯反应得到相应的酰氯(ⅲ)，然后与取代氨甲基咪唑甲酸酯(ⅳ)反应得到相应的中间体酰胺(ⅴ)。

其中，r、x的定义如权利要求1所述。

2)中间体酰胺(ⅴ)在碱性条件下加热环化得到目标化合物(ⅰ)

其中：r、x的定义如权利要求1所述。

该活性成分还可以适于这些给药途径的给药形式进行给药。

适于口服给药的有可以迅速和/或以改变的方式传递活性成分的公知的给药形式，如片剂(未包衣片或包衣片，如具有肠包衣或莫包衣的片剂)、胶囊、糖衣片、颗粒、小药丸、粉剂、乳剂、混悬液和气雾剂。

采用胃肠外给药可能可避免吸收步骤(静脉内、动脉内、心内、脊柱内或腰髓内给药)或者包含吸收(肌内、皮下、皮内、经皮或腹膜内给药)。适于胃肠外给药的给药形式特别是用于注射和输入的溶液、混悬液、乳剂、冷冻干燥物和无菌粉末形式的制剂。

适于其他给药途径的有例如吸入(特别是粉末吸入、喷雾)的药物、鼻滴剂/溶液、喷雾剂；用于舌、舌下或颊给药的片剂或胶囊、栓剂、用于耳朵和眼睛的制剂、阴道胶囊、水性混悬液(洗剂、振摇混合物)、亲脂性混悬液、软膏、乳膏、乳液、糊剂、撒粉或植入物，如斯腾特固定模。

可以用本身已知的方法将该活性成分转化成所述的给药形式。其可以用惰性无毒的适宜药用赋形剂来实现。其特别是包括载体(例如微晶纤维素)、溶剂(例如液体聚乙二醇)、乳化剂(例如十二烷基硫酸钠)、分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)、合成和天然生物聚合物(例如蛋白质)、稳定剂(例如抗氧剂和抗坏血酸)、着色剂(例如无机颜料如氧化铁)或矫味剂和/或掩味剂。在适宜的情况中，所说的活性成分可以以微囊包封的形式存在于一种或多种上述载体中。

除本发明式ⅰ的化合物外，上述药物制剂还可以包含其他药物活性成分。

关于制备通式i化合物更详尽的资料见实施例，但下面的实施例仅是本发明优选的说明性方案，对本发明不构成任何限制。

实施例1：6-甲基-2-甲硫基-5-氧代-6,7-二氢-5h-咪唑[1,5-a]嘧啶[5,4-f][1,4]二氮杂-8-甲酸乙酯

将0.35g(1.71mmol)4-氯-2-甲硫基嘧啶-5-甲酸溶于20ml二氯甲烷溶剂中，加入0.37g(2.94mmol)草酰氯，1滴dmf，室温搅拌6h后减压蒸除溶剂和过量的草酰氯，得到黄色固体；将其溶于20ml二氯甲烷中，然后加入0.22g(1.21mmol)5-(甲胺甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯，0.21g(2.05mmol)三乙胺，室温搅拌至反应完毕后将其倒入30ml饱和碳酸氢钠溶液中，用二氯甲烷(20ml×2)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸除溶剂得到5-((4-氯-n-甲基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰胺基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯，直接用于下一步反应。将5-((4-氯-n-甲基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰胺基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯溶于20ml乙腈中，加入0.58g(4.22mmol)无水碳酸钾，室温搅拌至反应完毕后减压蒸除溶剂。将其用20ml二氯甲烷溶解，用30ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸除溶剂，柱层析分离(ch2cl2:ch3coch3＝10:1)，得到白色固体，两步产率为60％。mp.192-194℃。¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ9.16(s,1h),8.36(s,1h),4.90(s,2h),4.44(q,j＝7.1hz,2h),3.27(s,3h),2.64(s,3h),1.45(t,j＝7.1hz,3h)。hrms(esi)m/z:334.0967[m+h]⁺。

实施例2:6-乙基-2-甲硫基-5-氧代-6,7-二氢-5h-咪唑[1,5-a]嘧啶[5,4-f][1,4]二氮杂-8-甲酸乙酯

方法同实施例1，将0.35g(1.71mmol)4-氯-2-甲硫基嘧啶-5-甲酸与0.37g(2.94mmol)草酰氯反应得到黄色固体；然后将其在三乙胺条件下与0.24g(1.21mmol)5-(乙胺甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯反应得到5-((4-氯-n-乙基-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酰胺基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯，直接用于下一步反应。向5-((4-氯-n-乙基-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酰胺基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯的乙腈溶液中加入0.58g(4.22mmol)无水碳酸钾，发生环化反应得到白色固体，柱层析分离(ch2cl2:ch3coch3＝10:1)，两步产率为66％。mp.159-161℃。¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ9.16(s,1h),8.37(s,1h),4.88(s,2h),4.44(q,j＝7.1hz,2h),3.70(q,j＝7.1hz,2h),2.63(s,3h),1.44(t,j＝7.1hz,3h),1.25(t,j＝7.1hz,3h)。hrms(esi)m/z:348.1123[m+h]⁺。

实施例3:2-甲硫基-5-氧代-6-(2,2,2-三氟乙基)-6,7-二氢-5h-咪唑[1,5-a]嘧啶[5,4-f][1,4]二氮杂-8-甲酸乙酯

方法同实施例1，将0.35g(1.71mmol)4-氯-2-甲硫基嘧啶-5-甲酸与0.37g(2.94mmol)草酰氯反应得到黄色固体；然后将其在三乙胺条件下与0.30g(1.21mmol)5-((2,2,2-三氟乙胺)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯反应得到5-((4-氯-2-甲硫基-n-(2,2,2-三氟乙基)嘧啶-5-甲酰氨基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯，直接用于下一步反应。向5-((4-氯-2-甲硫基-n-(2,2,2-三氟乙基)嘧啶-5-甲酰氨基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯的乙腈溶液中加入0.58g(4.22mmol)无水碳酸钾，发生环化反应得到白色固体，柱层析分离(ch2cl2:ch3coch3＝10:1)，两步产率为59％。mp.160-162℃。¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ9.17(s,1h),8.40(s,1h),5.07(s,2h),4.45(q,j＝7.1hz,2h),4.25(q,j＝8.6hz,2h),2.66(s,3h),1.45(t,j＝7.1hz,3h)。hrms(esi)m/z:402.0844[m+h]⁺。

实施例4:6-环丙基-2-甲硫基-5-氧代-6,7-二氢-5h-咪唑[1,5-a]嘧啶[5,4-f][1,4]二氮杂-8-甲酸乙酯

方法同实施例1，将0.35g(1.71mmol)4-氯-2-甲硫基嘧啶-5-甲酸与0.37g(2.94mmol)草酰氯反应得到黄色固体；然后将其在三乙胺条件下与0.25g(1.21mmol)5-(环丙胺甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯反应得到5-((4-氯-n-环丙基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰胺基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯，直接用于下一步反应。向5-((4-氯-n-环丙基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰胺基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯的乙腈溶液中加入0.58g(4.22mmol)无水碳酸钾，发生环化反应得到白色固体，柱层析分离(ch2cl2:ch3coch3＝10:1)，两步产率为95％。mp.138-140℃。¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ9.22(s,1h),8.41(s,1h),4.96(s,2h),4.47(q,j＝7.1hz,2h),3.04-3.01(m,1h),2.65(s,3h),1.47(t,j＝7.1hz,3h),0.99-0.83(m,4h)。hrms(esi)m/z:360.1127[m+h]⁺。

实施例5:6-异丙基-2-甲硫基-5-氧代-6,7-二氢-5h-咪唑[1,5-a]嘧啶[5,4-f][1,4]二氮杂-8-甲酸乙酯

方法同实施例1，将0.35g(1.71mmol)4-氯-2-甲硫基嘧啶-5-甲酸与0.37g(2.94mmol)草酰氯反应得到黄色固体；然后将其在三乙胺条件下与0.26g(1.21mmol)5-(异丙胺甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯反应得到5-((4-氯-n-异丙基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰胺基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯，直接用于下一步反应。向5-((4-氯-n-异丙基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰胺基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯的乙腈溶液中加入0.58g(4.22mmol)无水碳酸钾，发生环化反应得到白色固体，柱层析分离(ch2cl2:ch3coch3＝10:1)，两步产率为98％。mp.136-138℃。¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ9.19(s,1h),8.40(s,1h),5.00-4.92(m,1h),4.80(br,2h),4.46(q,j＝7.1hz,2h),2.65(s,3h),1.46(t,j＝7.1hz,3h),1.27(d,j＝6.7hz,6h)。hrms(esi)m/z:362.1281[m+h]⁺。

实施例6:6-苄基-2-甲硫基-5-氧代-6,7-二氢-5h-咪唑[1,5-a]嘧啶[5,4-f][1,4]二氮杂-8-甲酸乙酯

方法同实施例1，将0.35g(1.71mmol)4-氯-2-甲硫基嘧啶-5-甲酸与0.37g(2.94mmol)草酰氯反应得到黄色固体；然后将其在三乙胺条件下与0.31g(1.21mmol)5-(苄胺甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯反应得到5-((4-氯-n-苄基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰胺基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯，直接用于下一步反应。向5-((4-氯-n-苄基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰胺基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯的乙腈溶液中加入0.58g(4.22mmol)无水碳酸钾，发生环化反应得到白色固体，柱层析分离(ch2cl2:ch3coch3＝10:1)，两步产率为89％。mp.144-146℃。¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ9.24(s,1h),8.38(s,1h),7.38-7.29(m,5h),4.84(s,2h),4.81(s,2h),4.38(q,j＝7.1hz,2h),2.65(s,3h),1.41(t,j＝7.1hz,3h)。hrms(esi)m/z:410.1281[m+h]⁺。

实施例7:4-氯-6-甲基-2-甲硫基-5-氧代-6,7-二氢-5h-咪唑[1,5-a]嘧啶[5,4-f][1,4]二氮杂-8-甲酸乙酯

方法同实施例1，将0.49g(2.03mmol)4,6-二氯-2-甲巯基嘧啶-5-甲酸溶于20ml二氯甲烷溶剂中，加入0.52g(4.06mmol)草酰氯，1滴dmf，室温搅拌5h后减压蒸除溶剂和过量的草酰氯，得到黄色固体；将其溶于20ml二氯甲烷中，然后加入0.37g(2.03mmol)5-(甲胺甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯，0.35g(3.45mmol)三乙胺，室温搅拌至反应完毕后将其倒入30ml饱和碳酸氢钠溶液中，用二氯甲烷(20ml×2)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸除溶剂得到5-((4,6-二氯-n-甲基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰氨基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯，直接用于下一步反应。将5-((4,6-二氯-n-甲基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰氨基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯溶于20ml乙腈中，加入0.98g(7.10mmol)无水碳酸钾，室温搅拌至反应完毕后减压蒸除溶剂。将其用20ml二氯甲烷溶解，用30ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸除溶剂，柱层析分离(ch2cl2:ch3coch3＝60:1)，得到白色固体，两步产率为27％。mp.174-176℃。¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ8.31(s,1h),5.26(br,1h),4.49(br,1h),4.43(br,2h),3.21(s,3h),2.62(s,3h),1.43(t,j＝7.1hz,3h)。hrms(esi)m/z:368.0580[m+h]⁺。

实施例8:4-氯-6-乙基-2-甲硫基-5-氧代-6,7-二氢-5h-咪唑[1,5-a]嘧啶[5,4-f][1,4]二氮杂-8-甲酸乙酯

方法同实施例7，将0.49g(2.03mmol)4,6-二氯-2-甲巯基嘧啶-5-甲酸与0.52g(4.06mmol)草酰氯反应得到黄色固体；然后将其在三乙胺条件下与0.24g(1.21mmol)5-(乙胺甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯反应得到5-((4,6-二氯-n-乙基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰氨基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯，直接用于下一步反应。向5-((4,6-二氯-n-乙基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰氨基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯的乙腈溶液中加入0.98g(7.10mmol)无水碳酸钾，发生环化反应得到白色固体，柱层析分离(ch2cl2:ch3coch3＝60:1)，两步产率为43％。mp.152-154℃。¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ8.34(s,1h),5.37(d,j＝16.2hz,1h),4.47-4.42(m,2h),4.38(br,1h),3.68(q,j＝7.0hz,2h),2.64(s,3h),1.45(t,j＝7.1hz,3h),1.24(t,j＝7.0hz,3h)。hrms(esi)m/z:382.0735[m+h]⁺。

实施例9:4-氯-2-甲硫基-5-氧代-6-(2,2,2-三氟乙基)-6,7-二氢-5h-咪唑[1,5-a]嘧啶[5,4-f][1,4]二氮杂-8-甲酸乙酯

方法同实施例7，将0.49g(2.03mmol)4,6-二氯-2-甲巯基嘧啶-5-甲酸与0.52g(4.06mmol)草酰氯反应得到黄色固体；然后将其在三乙胺条件下与0.30g(1.21mmol)5-((2,2,2-三氟乙胺)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯反应得到5-((4,6-二氯-2-甲硫基-n-(2,2,2-三氟乙基)嘧啶-5-甲酰氨基)甲基)-1h-咪唑-4-羧酸乙酯，直接用于下一步反应。向5-((4,6-二氯-2-甲硫基-n-(2,2,2-三氟乙基)嘧啶-5-甲酰氨基)甲基)-1h-咪唑-4-羧酸乙酯的乙腈溶液中加入0.98g(7.10mmol)无水碳酸钾，发生环化反应得到白色固体，柱层析分离(ch2cl2:ch3coch3＝60:1)，两步产率为41％。mp.163-165℃。¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ8.34(s,1h),5.11(s,2h),4.54(q,j＝8.3hz,2h),4.43(q,j＝7.1hz,2h),2.54(s,3h),1.44(t,j＝7.1hz,3h)。hrms(esi)m/z:436.0453[m+h]⁺。

实施例10:4-氯-6-环丙基-2-甲硫基-5-氧代-6,7-二氢-5h-咪唑[1,5-a]嘧啶[5,4-f][1,4]二氮杂-8-甲酸乙酯

方法同实施例7，将0.49g(2.03mmol)4,6-二氯-2-甲巯基嘧啶-5-甲酸与0.52g(4.06mmol)草酰氯反应得到黄色固体；然后将其在三乙胺条件下与0.25g(1.21mmol)5-(环丙胺甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯反应得到5-((4,6-二氯-n-环丙基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰氨基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯，直接用于下一步反应。向5-((4,6-二氯-n-环丙基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰氨基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯的乙腈溶液中加入0.98g(7.10mmol)无水碳酸钾，发生环化反应得到白色固体，柱层析分离(ch2cl2:ch3coch3＝60:1)，两步产率为45％。mp.152-154℃。¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ8.34(s,1h),5.42(br,1h),4.45(q,j＝7.0hz,2h),4.35(br,1h),2.99-2.94(m,1h),2.63(s,3h),1.48(t,j＝7.1hz,3h),0.99(br,1h),0.80(br,1h)。hrms(esi)m/z:394.0735[m+h]⁺。

实施例11:4-氯-6-异丙基-2-甲硫基-5-氧代-6,7-二氢-5h-咪唑[1,5-a]嘧啶[5,4-f][1,4]二氮杂-8-甲酸乙酯

方法同实施例7，将0.49g(2.03mmol)4,6-二氯-2-甲巯基嘧啶-5-甲酸与0.52g(4.06mmol)草酰氯反应得到黄色固体；然后将其在三乙胺条件下与0.26g(1.21mmol)5-(异丙胺甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯反应得到5-((4,6-二氯-n-异丙基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰氨基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯，直接用于下一步反应。向5-((4,6-二氯-n-异丙基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰氨基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯的乙腈溶液中加入0.98g(7.10mmol)无水碳酸钾，发生环化反应得到白色固体，柱层析分离(ch2cl2:ch3coch3＝60:1)，两步产率为32％。mp.140-142℃。¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ8.37(s,1h),5.49(d,j＝16.5hz,1h),4.95-4.88(m,1h),4.46(q,j＝7.1hz,2h),4.15(q,j＝16.5hz,1h),2.64(s,3h),1.46(t,j＝7.1hz,3h),1.37(d,j＝6.8hz,3h),1.15(d,j＝6.8hz,3h)。hrms(esi)m/z:396.0895[m+h]⁺。

实施例12:4-氯-6-苄基-2-甲硫基-5-氧代-6,7-二氢-5h-咪唑[1,5-a]嘧啶[5,4-f][1,4]二氮杂-8-甲酸乙酯

方法同实施例7，将0.49g(2.03mmol)4,6-二氯-2-甲巯基嘧啶-5-甲酸与0.52g(4.06mmol)草酰氯反应得到黄色固体；然后将其在三乙胺条件下与0.31g(1.21mmol)5-(苄胺甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯反应得到5-((4,6-二氯-n-苄基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰氨基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯，直接用于下一步反应。向5-((4,6-二氯-n-苄基-2-甲硫基嘧啶-5-甲酰氨基)甲基)-1h-咪唑-4-甲酸乙酯的乙腈溶液中加入0.98g(7.10mmol)无水碳酸钾，发生环化反应得到白色固体，柱层析分离(ch2cl2:ch3coch3＝60:1)，两步产率为47％。mp.167-169℃。¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ8.34(s,1h),7.36-7.31(m,5h),5.33(d,j＝16.2hz,1h),5.11(d,j＝14.5hz,1h),4.45(br,1h),4.39(q,j＝7.1hz,2h),4.27(d,j＝16.2hz,1h),2.64(s,3h),1.41(t,j＝7.1hz,3h)。hrms(esi)m/z:444.0894[m+h]⁺。

实施例13：化合物对地西泮镇静催眠效应的拮抗作用

1)药物溶液的制备

地西泮(dzp)溶于dmso/tw-80(2:1)混合溶剂中，制成50mg/ml储液。氟马西尼(flu)及新化合物溶于dmso，制成10mg/ml储液。所有药物储液均在实验当天配置。实验开始前，用去离子水将各储液稀释至工作浓度。地西泮终浓度为3mg/ml，flu及新化合物终浓度为1mg/ml，对照溶剂为15％dsmo溶液。

2)小鼠翻正反射行为模型

取已适应实验环境3天的昆明小鼠(spf级)，称重并编号后置于干净的饲养笼内，每笼1只。按10ml/kg标准计算各小鼠给药体积。先采用尾静脉注射方式给予flu或新化合物工作液，随后采用腹腔注射方式给予dzp工作液，两次给药间隔不超过1min。第二次给药后将小鼠放回饲养笼内，将该时间点计为零点(t0)。观察小鼠活动情况，当小鼠停止活动时将其翻转成仰卧位姿态。若小鼠在2min内不能自主翻正说明其翻正反射行为消失，记录小鼠开始出现翻正消失的时间(t1)。若小鼠在翻正反射消失一段时间后能够在1min内自主翻正3次则说明其翻正反射行为恢复，记录小鼠翻正反射行为恢复的时间(t2)。t1与t0的差值即为翻正反射消失的潜伏期；t2与t1的差值即为翻正反射消失的持续期。

3)不同化合物对地西泮诱导翻正反射消失的影响

采用小鼠翻正反射行为模型研究flu及新化合物对dzp镇静催眠效应的影响。设control组、flu组及新化合物组，其中control组先给与对照溶剂(15％dmso溶液)，flu组先给与flu工作液(10mg/kg)，新化合物组先给与新化合物工作液(10mg/kg)，随后给与各组小鼠dzp工作液(30mg/kg)。观察120min内各组小鼠翻正反射行为的变化情况。

4)数据分析

实验数据应用graphpadprism5.0软件进行统计分析，结果均以平均数±标准误表示。各实验组与control组的比较采用t-test进行检验，p<0.05表示具有显著的统计学差异。

5)试验结果

注：control和flu组的动物数量为18只，其他组的动物数量均为6只。