一种杂合抗菌肽及其制备方法和应用与流程

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种新型杂合抗菌肽其制备方法与应用。

背景技术：

目前在水产品加工和养殖领域使用了大量的抗生素和防腐剂。虽然能起到良好的效果，但是会使细菌产生耐药性，影响水产品的品质。虽然天然抗菌类蛋白是抗生素和防腐剂的良好替代者，但是其在生物体中含量较低，从生物体内直接分离提取纯化的难度较大；并且对抗外源微生物的效果有限。尤其是目前还没有水产来源的商品化抗菌类蛋白。《gb2760-2014》中规定鸡蛋白溶菌酶不能使用在水产品中。美国fda规定的可以使用在水产品中的饲料用抗生素也只有3种(人用抗生素不能用于养殖动物中，批准用作治疗鱼病的抗生素不得作为生长激素，也不得用于疾病预防。在美国仅有6种药品被准许使用在水产养殖业上，包括麻醉剂、驱虫剂及催产激素各1种，以及3种抗生素。而批准的抗生素中有一种已不再生产使用。所有的药品必须根据商标说明来使用。氧四环霉素及磺胺剂是被许可用于治疗鱼病的抗生素，但仅限于特定水产鱼种(如氧四环霉素仅能用在鲶鱼、鲑鱼及龙虾)或特定疾病上。)。因此以鱼类来源的天然抗菌肽为基础，在分子水平上设计杂合抗菌肽基因，并通过dna重组技术进行大量制备，获得的杂合抗菌肽将具有增强的抗菌作用，以满足目前水产品养殖和保鲜的需求。但是目前有关鱼类来源抗菌肽开发利用的报道很少，有关鱼类来源杂合抗菌肽的报道更是鲜有耳闻。

巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)表达系统是一种能高效表达外源蛋白的真核表达系统，但用于表达抗菌肽这种外源基因时，常常会出现表达水平低的问题。例如蔡晶晶等(蔡晶晶，杨明，蔡灵，郭庆，潘瑞珍，王克坚。黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达，厦门大学学报，2009，48(5)：738-743)在毕赤酵母中表达黑鲷抗菌肽hepcidin，其表达量在120h达到最高为1.1mg/l。vasilikikoliaraki等人(vasilikikoliaraki,marthamarinou,martinasamiotaki,georgepanayotou,kostaspantopoulos,avgimamalaki.ironregulatoryandbactericidalpropertiesofhumanrecombinanthepcidinexpressedinpichiapastoris.biochimie2008；90:726-735)在毕赤酵母中表达得到人hepcidin，其在培养液中的表达量为5-7mg/l。leiwang等人(leiwang,chun-elai,qifengwu,junliangliu,maojunzhou,zhenghuaren,dandansun,shangwuchen,anlongxu.productionandcharacterizationofanovelantimicrobialpeptidehkabfbypichiapastoris.processbiochem2008；43:1124-1131.)在毕赤酵母中表达黄金海马抗菌因子hkabf，其表达量为15mg/l。影响毕赤酵母表达量的因素有核苷酸序列(密码子的偏爱性、at含量和二级结构)、基因拷贝数、分泌信号肽的特点、胞内蛋白酶的活性、甲醇利用表现型、宿主菌的生理状态和培养情况等。在这些因素中，基因拷贝数是最关键的一点。单拷贝基因表达蛋白时往往基因的转录水平是表达的限制步骤，因此，重组基因的多拷贝插入可能获得更高的蛋白产量，可以通过构建多拷贝表达盒表达载体来解决这个问题。

一个表达盒(expressioncassette)是包含目的基因和所需表达元件的独立单元，其表达产物是目的肽单体。构建多拷贝表达盒载体是在体外通过位于表达盒两侧的同尾酶bglii和bamhi，在整合型表达载体上构建出携带多个同向排列的表达盒的多聚体(multimers)。da等通过构建8拷贝表达盒载体，使得真菌防御素plectasin在毕赤酵母中的表达量提高了1.63倍(datenga,dixia,junzhang,xiuminwang,ruoyumao,yongzhang,jianhuawang.multiplecopiesofthetargetgeneenhancesplectasinsecretioninpichiapastorisx-33.processbiochem.2015；50:553-560.)。目前通过该方法已明显提高水通道蛋白、转化酶、猪胰岛素前体pip、b型肝炎表面抗原等蛋白在毕赤酵母中的表达量。相比通过高浓度抗生素的筛选从成千上万的转化子中获得高拷贝酵母转化子的传统方法，该方法既经济又省时。

防御素是一类可杀死细菌、真菌或者病毒等微生物并有抗肿瘤活性的多肽，是抗菌肽家族的重要成员。鱼类β-防御素是有6个保守的半胱氨酸残基组成分子内二硫键(c1-c5，c2-c4，c3-c6)的阳离子小分子抗菌肽。我们的前期研究发现，斑马鱼defensin,beta-like3(defbl3)具有明显的抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的活性。但是defbl3作为一种对细胞有强杀伤性的小肽，对宿主细胞毕赤酵母也有一定的伤害作用，在提高表达量的同时，可能会出现工程菌“自杀”现象，这样反而会使表达量下降。而与大分子的伴侣蛋白融合，是高效生产抗菌肽的策略之一。c型溶菌酶是机体重要的先天性免疫物质，参与水解细菌的细胞壁，具有抑制外源微生物生长的作用。斑点叉尾鮰(ictaluruspunctatus)c型溶菌酶(lyc)有125个氨基酸，分子量有14.0kda，研究已表明它在体外对细菌有明显的抑制作用(juliaw.pridgeon,philliph.klesius,paulj.dominowski,robertj.yancey,micheles.kievit.chicken-typelysozymeinchannelcatfish:expressionanalysis,lysozymeactivity,andefficacyasimmunostimulantagainstaeromonashydrophilainfection.fishshellfishimmunol.2013；35:1309–1319.)。chen等人已发现β-防御素和c型溶菌酶有协同作用(xuejunchen,niyonsaba,hirokoushio,daijuokuda,isaonagaoka,shigakuikeda,kookumura,hideokiogawa.synergisticeffectofantibacterialagentshumanbeta-defensins,cathelicidinll-37andlysozymeagainststaphylococcusaureusandescherichiacoli.j.dermatol.sci.2005,40:123-32.)。综上所述，lyc是与defbl3融合的良好候选者。迄今为止，关于在毕赤酵母中进行小分子抗菌肽与溶菌酶串联表达的研究只有斑点叉尾鮰parasinⅰ与人溶菌酶的表达(huazhao,jiayongtang,leicao,gangjia,dingbiaolong,guangmangliu,xiaolingchen,jingyicai,haiyingshang.characterizationofbioactiverecombinantantimicrobialpeptideparasinifusedwithhumanlysozymeexpressedintheyeastpichiapastorissystem.enzymemicrob.tech.2015,77:61-67.)，但是所用的溶菌酶基因来源于人类，而人源c型溶菌酶抑菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有活性。而鱼类来源的c型溶菌酶对革兰氏阴性和阳性菌都有抑菌活性。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种杂合抗菌肽及其制备方法和应用。

本发明的另一目的是提供编码上述杂合抗菌肽的基因。

本发明的再一目的是提供含有上述编码杂合抗菌肽的基因的多拷贝表达盒重组表达载体及其构建方法。该重组表达载体有效地增加了目的基因在酵母基因组中的拷贝数，提高了目的蛋白的表达水平。

本发明的再一目的是提供含有高拷贝编码杂合抗菌肽的基因的酵母宿主细胞。

为实现上述目的，发明人对斑点叉尾鮰c型溶菌酶lyc和斑马鱼β-防御素defbl3进行了杂合，获得一种新型的杂合抗菌肽，命名为ld。该杂合抗菌肽包括斑点叉尾鮰c型溶菌酶lyc的氨基酸序列、斑马鱼β-防御素defbl3的氨基酸序列和将它们连接在一起的4个甘氨酸和肠激酶酶切位点。该杂合抗菌肽的氨基酸序列如seqidno:6所示。该杂合抗菌肽设计策略如下：在斑点叉尾鮰c型溶菌酶lyc和斑马鱼β-防御素defbl3之间加入4个甘氨酸柔性linker，将融合蛋白彼此分开，不要彼此形成高级结构而影响功能的发挥；添加肠激酶酶切位点，使杂合蛋白在动物肠道内被酶水解，形成两个独立的单体，各自发挥作用；将肠激酶酶切位点添加在甘氨酸柔性linker后，是考虑到这样有利于暴露肠激酶酶切位点，以便酶水解；而肠激酶酶切位点位于赖氨酸后面，使酶水解以后得到的β-防御素是一个没有额外氨基酸的肽段，防止多余的氨基酸影响小肽defbl3的活性。

本发明还提供了一种编码上述杂合抗菌肽的基因(以下称“基因ld”)。该基因是根据毕赤酵母的密码子偏爱性对斑点叉尾鮰c型溶菌酶基因lyc和斑马鱼β-防御素基因defbl3进行了优化改造后，通过soe-pcr(splicingbyoverlappingextensionpcr)串联得到，以期适合在酵母中表达，并增加其编码的杂合抗菌肽的表达量和抑菌效果。该基因序列除了包括两段目的基因：优化的斑点叉尾鮰c型溶菌酶cdna序列(seqidno:4)和优化的斑马鱼β-防御素cdna序列(seqidno:2)之外，还包括4个甘氨酸linker和肠激酶酶切位点的编码序列。该基因具有核苷酸序列如seqidno:5所示，或者与seqidno:5所示的核苷酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性且编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明参考genbank中公布的斑马鱼β-防御素(genbank:nm_001081555)的cdna序列(其核苷酸序列如seqidno:1所示)，预测其成熟肽的氨基酸序列，在不改变其氨基酸序列的前提下，根据毕赤酵母的密码子偏爱性对原来的aca、gtg、cag、aca、tgc、gga、cga、gga、cta、tgc、agg、tgc、tat、gca、cgg、gag、tat、att、tat、cgt、ggc、tgc、cct、cgc、agg、tgc、cga、ttt等密码子进行了优化，优化后的对应密码子分别为act、gtt、caa、act、tgt、ggt、aga、ggt、ttg、tgt、aga、tgt、tac、gct、aga、gaa、tac、atc、tac、ttc、ggt、tgt、cca、aga、aga、tgt、aga、ttc。参考斑点叉尾鮰c型溶菌酶(genbank:nm_001200789)的cdna序列(其核苷酸序列如seqidno:3所示)，预测其成熟肽的氨基酸序列，在不改变其氨基酸序列的前提下，根据毕赤酵母的密码子偏爱性对原来的tat、gat、cgg、gag、ctg、gca、gcc、aaa、gca、aat、ggc、ggc、tat、cat、ggc、agt、ctg、tgc、gcc、aaa、cat、tcc、gat、acc、aaa、gcc、gat、gga、tca、acg、tat、ggc、att、cag、cgt、agc、aat、agc、cgt、agc、gcg、ggg、aaa、tcc、tgc、aat、cag、ctt、ctt、gca、cgc、tat、tgc、cgg、cgt、gat、gta、agc、gca、ggc、cag、gcc、acc、ata、gtg、cag、cag、ggc、att、gca、gtg等密码子进行优化，优化后对应的密码子分别为tac、gac、aga、gaa、ttg、gct、gct、aag、gct、aac、ggt、ggt、tac、cac、ggt、tct、ttg、tgt、gct、aag、cac、tct、gac、act、aag、gct、gac、ggt、tct、act、tac、ggt、atc、caa、aga、tct、aac、tct、aga、tcc、gct、ggt、aag、agt、tgt、aac、caa、ttg、ttg、caa、gct、act、atc、gtt、caa、caa、ggt、atc、gct、gtt、gct、aga、tac、tgt、aga、aga、gac、gtt、tct、gct、ggt。

本发明还提供包含一拷贝、二拷贝或四拷贝表达盒的重组表达载体ppiczαa-ldn(n＝1、2或4)，其中所述表达盒各自包含上述编码杂合抗菌肽的基因ld。

本发明还提供含有上述编码杂合抗菌肽的基因ld、或含有上述重组表达载体的酵母宿主细胞。

本发明的酵母包括能够表达杂合抗菌肽ld的常用酵母的任一种。选择用于表达杂合抗菌肽ld的合适酵母是所述领域的普通技术人员的能力范围之内。在选择用于表达的酵母宿主中，合适的宿主可以包括展示具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好的可溶蛋白产生和总体稳定的酵母。这些酵母包括但不限于产子囊酵母(内胞霉目(endomycetales))、担孢子酵母和属于半知菌(芽孢纲(blastomycetes))类的酵母。上述产子囊酵母分为两科，即蚀精霉科(spermophthoraceae)和酵母菌科(saccharomycetaceae)。后者包含四个亚科，schizosaccharomycoideae(例如裂殖酵母属(schizosaccharomyces))、克鲁维酵母属(kluyveromyces)和酵母属(saccharomyces))。担孢子酵母包括leucosporidium属、红冬孢酵母属(rhodosporidium)、锁掷酵母属(sporidiobolus)、filobasidium属和线黑粉菌属(filobasidiella)。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两科，即掷孢酵母科(sporobolomycetaceae)(例如掷孢酵母属(sporobolomyces)和布勒弹孢酵母属(bullera)和隐球酵母科(cryptococcaceae)(例如假丝酵母属(candida)。优选地，本发明的酵母为毕赤酵母(pichiapastoris)。更优选地，本发明的酵母为毕赤酵母x-33。

本发明还提供了一种制备上述杂合抗菌肽的方法，该方法包括将上述重组表达载体转化酵母宿主细胞，筛选阳性酵母转化子，诱导表达目的肽，并分离纯化表达产物。

优选地，该酵母是毕赤酵母，更优选地，该毕赤酵母是毕赤酵母x-33。

将本发明的编码杂合抗菌肽的基因ld引入到酵母宿主中的方法对所属领域的普通技术人员是众所周知的。举例而言，酵母转化可根据以下文献中描述的方法进行：hsiaoetal.，proc.natl.acad.sci.usa(1979)76:3829和vansolingenetal.，j.bact.(1977)130:946。然而，也可如通常在sambrooketal.，molecularcloning,alabmanual(2001)中所述，使用诸如通过核注射、电穿孔或原生质体融合等方式，将外源dna引入细胞。一旦建立重组宿主细胞菌株(即将重组酵母表达载体引入酵母细胞中并分离具有合适表达载体的重组酵母宿主细胞)，则在适于产生重组杂合抗菌肽ld的条件下培养重组宿主细胞菌株。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素或抗真菌剂以防止不希望的微生物生长和/或含有包括但不限于抗生素的化合物以选择含有表达载体的宿主细胞。优选地，本发明制备杂合抗菌肽过程中使用包含无氨基酵母氮源的培养基。

本发明的杂合抗菌肽ld于重组系统中表达之后进行纯化，可以采用多种所属领域中已知的方法从宿主细胞中纯化。任何以下方法或手段都可用于纯化本发明重组杂合抗菌肽ld，例如：亲和色谱、阴离子或阳离子交换色谱(使用包括但不限于deaesepharose)、硅胶色谱、反相hplc、凝胶过滤(使用包括但不限于sephadexg-75)、疏水相互作用色谱、大小排除色谱、金属螯合色谱、超滤/透滤、乙醇沉淀、硫酸铵沉淀、色谱聚焦、置换色谱、电泳程序(包括但不限于制备型等电聚焦)、差别溶解性(包括但不限于硫酸铵沉淀)、sds-page或萃取。

采用本发明的方法可以大量、高效地制备上述杂合抗菌肽。

本发明还提供了上述杂合抗菌肽在制备抗菌药物、饲料添加剂中的应用。

优选地，该饲料添加剂是水产饲料添加剂。

本发明提供的杂合抗菌肽对单增李斯特菌(listeriamonocytogenes)和铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)具有良好的抗菌效果，并耐高温处理。

本发明首次通过构建含目的基因的多拷贝表达盒表达载体的毕赤酵母表达系统，实现重组杂合抗菌肽ld的表达，并进一步对获得的重组蛋白的抗菌活性进行验证，对其应用提供了依据。发明人通过体外构建多拷贝表达盒重组表达载体，在毕赤酵母中以较高的量(17.6mg/l)表达了重组杂合抗菌肽ld，从而方便地从表达产物中纯化到了目的蛋白(参见图11，其中很清晰地显示了目的蛋白条带)。本发明的表达量明显高于背景技术中述及的黑鲷hepcidin、人hepcidin和黄金海马抗菌因子hkabf在毕赤酵母中的表达量。另外，本发明得到的重组蛋白的抑菌活性良好(参见图12、13，发酵上清不需要浓缩就展现出抑菌活性，其中发酵上清有17.6mg/l重组杂合抗菌肽ld)，该活性大大地优于背景技术提到的大肠杆菌表达的斑点叉尾鮰c型溶菌酶(40mg/l)产生的抑菌效果；并且，本发明得到的重组蛋白耐高温，具有良好的稳定性(参见图14，100℃处理后仍然显示抑菌活性)。

另外，本发明的杂合抗菌肽更加适合于毕赤酵母表达。参见图10a，x-33/ppiczαa-ldn(n＝1，2或4)在诱导的120h中菌体量不断增多，并且菌体颜色和气味正常。而x-33/ppiczαa-defbl3在诱导72h以后，菌体量开始下降，即细胞开始死亡；诱导120h后菌体颜色变黑，有腐败气味产生。

可见，本发明的杂合抗菌肽与其母源斑点叉尾鮰c型溶菌酶lyc和斑马鱼β-防御素defbl3相比，其优点为对宿主酵母细胞的毒性小、表达量更高、抑菌效果更明显。

另外，本发明首次成功构建了有多拷贝表达盒的重组表达载体ppiczαa-ldn(n＝1、2或4)，并通过实时定量pcr证明获得了高拷贝酵母转化子。结果证明多拷贝表达盒的构建的确可以增加目的基因整合到酵母基因组的拷贝数。

防御素和溶菌酶可以促进动物肠道的健康，并且两者有协同作用(zixinpeng,anruwang,qiuyuefeng,zhaoyuewang,iskravitanovaivanova,xiupinghe,borunzhang,weipingsong.high-levelexpression,purificationandcharacterisationofporcineβ-defensin2inpichiapastorisanditspotentialasacost-efficientgrowthpromoterinporcinefeed.appl.microbiol.biot.2014；98:5487-5497.y.chen,x.zhu,y.yang,d.han,j.jin,s.xie.effectofdietarylysozymeongrowth,immuneresponse,intestinemicrobiota,intestinemorphologyandresistancetoaeromonashydrophiliaingibelcarp(carassiusauratusgibelio).aquacult.nutr.2014；20:229-241.)。肠激酶是在动物体内主要的消化酶，广泛存在于鱼类消化道中，发明人设计杂合抗菌肽ld时，在斑点叉尾鮰c型溶菌酶lyc与斑马鱼β-防御素defbl3之间添加肠激酶酶切位点，使其在鱼类消化道内被肠激酶消化，释放出斑点叉尾鮰c型溶菌酶lyc和斑马鱼β-防御素defbl3，从而更好地实现它们的生物学功能。另外杂合抗菌肽ld富含二硫键，对酸和热有良好的耐受性，适合于作为绿色饲料添加剂在水产饲料中应用。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或者已经用作重组载体或其他转移dna的接受体的酵母。所述术语包括已经接收重组载体或其他转移dna的原始酵母宿主细胞的后代。应了解，由于偶然或有意的突变，单个亲本细胞的后代可不必在形态上或与原始亲本互补的基因组或总dna上完全一致。

术语“宿主细胞”意指包括外源性多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其他方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“表达”指外源基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。

术语“转化”指将外源基因引入到宿主细胞中的方法。

术语“外源基因”指对特定的宿主细胞而言，该基因序列是属于外来的来源，或是来自相同的来源但其原始序列进行了修饰或改造。

附图说明

图1是通过soe-pcr合成基因ld的策略图。

图2是基于soe-pcr扩增的串联基因ld的电泳图。泳道m为dna分子量标准；泳道1为基因片段defbl3l；泳道2为基因片段lycl；泳道3为目的基因ld。

图3是用于连接至ppiczαa的目的基因ld的核苷酸及推断的氨基酸序列图。斜体表示xhoi和xbai酶切位点；下划线表示6×his标签；黑色方框表示kex2蛋白酶识别位点；阴影表示4×glylinker；双下划线表示肠激酶酶切位点；虚线框为保守的cys残基；*表示终止密码子。

图4是多拷贝表达盒重组表达载体的构建策略图。

图5是重组表达载体ppiczαa-ld的菌落pcr(a)和双酶切鉴定(b)。泳道m1为1kbplusdna分子量标准；泳道1～2为pcr扩增的产物；泳道m2为100bpdna分子量标准；泳道3为双酶切产物。

图6是重组表达载体ppiczαa-ldn(n＝1，2或4)的双酶切(a)和单酶切鉴定(b)。泳道m为1kbplusdna分子量标准；泳道1～3为用bglii和bamhi双酶切鉴定1-，2-和4-copy基因ld表达盒表达载体；泳道4～6为用bglii单酶切鉴定1-，2-和4-copy基因ld表达盒表达载体。

图7是酵母转化子的pcr鉴定。泳道m为1kbplusdna分子量标准；泳道1～3为引物5'aox1和3'aox1pcr鉴定产物；泳道4～6为引物5'aox1和ld-p5的pcr鉴定产物；泳道1和4的模板为1-copy基因ld表达盒酵母转化子；泳道2和5的模板为2-copy基因ld表达盒酵母转化子；泳道3和6的模板为4-copy基因ld表达盒酵母转化子。

图8是实时定量pcr的标准曲线和溶解曲线图。

图9是经甲醇诱导表达120h后的酵母培养菌液经离心后上清的sds-page分析图。(a)酵母培养液sds-page分析。泳道m为蛋白质分子量标准；泳道1为含ppiczαa的酵母转化子的培养液上清；泳道2为含ppiczαa-ld的酵母转化子的培养液上清。(b)不同拷贝数基因ld表达盒酵母转化子培养液的sds-page分析。泳道m为蛋白质分子量标准；泳道1～3分别为含1-，2-和4-copy基因ld表达盒表达载体的酵母转化子的培养液上清。

图10是不同拷贝数基因ld表达盒酵母转化子的表达分析图。(a)酵母转化子x-33\ppiczαa、x-33\ppiczαa-ldn(n＝1，2或4)和x-33\ppiczαa-defbl3随时间变化的细胞湿重变化曲线。(b)酵母转化子x-33\ppiczαa-ldn(n＝1，2或4)随时间变化的总蛋白浓度变化曲线。

图11是上清经ni-ida亲和层析纯化后重组蛋白ld的tricine-sds-page和westernblot分析图。泳道m为蛋白质分子量标准；泳道1为tricine-sds-page分析纯化的重组蛋白ld；泳道2为westernblot检测纯化的重组蛋白ld的条带。

图12是检测含重组蛋白ld的表达上清的抑菌活性结果。图ln和pn：含ppiczαa的酵母转化子的培养液上清分别对单增李斯特菌和铜绿假单胞菌的抑菌结果(阴性对照)；图ls和ps：含ppiczαa-ld的酵母转化子的培养液上清分别对单增李斯特菌和铜绿假单胞菌的抑菌结果。

图13是不同拷贝数基因ld表达盒酵母转化子上清对单增李斯特菌的抑菌活性图。图ld1～ld4分别为1-，2-和4-copy基因ld表达盒表达载体的酵母转化子的培养液上清抑菌活性；图n为含ppiczαa载体的酵母转化子上清的抑菌活性(阴性对照)。

图14是转化有ppiczαa-ld4的酵母发酵上清经100℃保温30分钟后的抑菌活性，1是铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)，2是单增李斯特菌(l.monocytogenes)，3是含ppiczαa载体的酵母转化子上清(阴性对照)。

图15是转化有ppiczαa-ld4的酵母发酵上清经肠激酶消化后的混合液的抑菌活性，1是铜绿假单胞菌，3是单增李斯特菌，2是含ppiczαa载体的酵母转化子上清(阴性对照)。

具体实施方式

发明人设计了含有斑点叉尾鮰c型溶菌酶lyc和斑马鱼β-防御素defbl3的杂合抗菌肽，对编码斑点叉尾鮰c型溶菌酶的基因(lyc)和斑马鱼β-防御素的基因(defbl3)进行了密码子优化和筛选，得到了特别适合在毕赤酵母中表达的优化序列，在此基础上完成了本发明。

优化前斑马鱼β-防御素cdna序列，来源于genbank:nm_001081555

优化后斑马鱼β-防御素cdna序列(defbl3)

优化前斑点叉尾鮰c型溶菌酶cdna序列，来源于genbank:nm_001200789

优化后斑点叉尾鮰c型溶菌酶cdna序列(lyc)

编码杂合抗菌肽ld的基因

杂合抗菌肽ld的氨基酸序列

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russe11dw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

下面的实施例中，毕赤酵母x-33、表达载体ppiczαa、zeocin(博来霉素)购自invitrogen公司(美国)。克隆质粒pmd19-tsimple购自takara公司(日本)。重组表达质粒ppiczαa-defbl3为本实验室构建保存。用于抑菌活性鉴定的革兰氏阳性菌单增李斯特菌(listeriamonocytogenes)atcc19115和革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌株(pseudomonasaeruginosa)atcc27853及大肠杆菌(escherichiacoli))dh5α为本实验室保存。

实施例1

杂合抗菌肽ld基因工程菌的构建

1.1通过soe-pcr得到串联基因ld

以ppiczαa-defbl3载体(本实验前期构建保存)为模板，根据巢式pcr原理，使用分别添加4×glylinker、肠激酶酶切位点核苷酸序列和xbai酶切位点的ld-p3、ld-p4和ld-p5引物(表1)进行pcr扩增，得到含有优化的斑马鱼β-防御素cdna序列(seqidno:2)的基因片段defbl3l。根据斑点叉尾鮰lyc基因序列(来源genbank:nm_001200789)，利用网站软件(http://www.jcat.de/start.jsp)对其优化。设计优化后的基因序列(seqidno:4)在5′端添加了6×his标签序列和限制性内切酶xhoi酶切位点，及3′端添加4个甘氨酸柔性linker和肠激酶酶切位点核苷酸序列，设计得到含有优化的斑点叉尾鮰c型溶菌酶cdna序列的基因片段lycl。设计好的基因片段lycl委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并亚克隆至克隆质粒puc57，构建重组质粒puc57-lycl。用pfudna聚合酶以puc57-lycl为模板pcr得到基因片段lycl。

利用基因片段defbl3l与基因片段lycl有27bp的重叠区，故可以采用soe-pcr进行串联，得到串联基因ld(图1)。反应体系如下：ld-p1和ld-p5(10μmol/l)各0.8μl、2×pfupcrmastermix(0.1upfupolymerase/μl)7.0μl、模板基因片段defbl3l1.2μl、模板基因片段lycl0.2μl，无菌水将反应液调至20μl。pcr反应条件：94℃预变性3min、94℃变性40s、54.9℃退火30s、72℃延伸60s、最终72℃终延伸5min，保温10min，反应进行30个循环。纯化后的目的基因ld与pmd-19t质粒连接、转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，37℃培养过夜；经菌落pcr鉴定后，挑选阳性克隆由生工生物工程(上海)股份有限公司进行dna测序。图2泳道1和泳道2分别为pfudna聚合酶pcr得到的基因片段defbl3l和基因片段lycl，泳道3为串联基因ld。图3是用于连接至ppiczαa的目的基因的核苷酸及推断的氨基酸序列图。

表1引物序列

1.2重组表达载体ppiczαa-ld的构建及鉴定

将上述目的基因ld与经xhoi和xbai消化的ppiczαa载体相连(图4，step1)，连接条件：目的基因ld3.5μl、载体ppiczαa1.5μl、solutioni5.0μl，终体积10μl，37℃连接1h。重组表达载体ppiczαa-ld构建完成后，转化至大肠杆菌中进行增殖，使用载体ppiczαa上的通用引物5′aox1(5′-gactggttccaattgacaagc-3′)和3′aox1(5′-gcaaatggcattctgacatcc-3′)进行菌落pcr进行筛选(无菌水14.1μl、10×taqbuffer2.0μl、dntp(2.5mmol/l)1.6μl、5′aox1(10μmol/l)0.8μl、3′aox1(10μmol/l)0.8μl、taqdna聚合酶(2.5u/μl)0.2μl，终体积20μl；反应条件：94℃预变性10min、94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min、30个循环，最终72℃延伸5min)。收集筛选得到的阳性转化子分离纯化ppiczαa-ld后，对其进行双酶切处理(重组表达载体ppiczαa-ld14.4μl、10×mbuffer2.0μl、0.1％bsa2.0μl、xhoi(15u/μl)0.8μl、xbai(10u/μl)0.8μl，终体积20μl，37℃反应5h。结果见图5，a图为菌落pcr结果，在理论分子量位置1068bp处有明显条带；b图为双酶切结果，右边泳道在567bp处有明显条带，与理论分子量相符，证明目的基因ld已成功连接至表达载体ppiczαa。

1.3重组多拷贝表达盒表达载体ppiczαa-ldn(n＝2或4)的构建和鉴定

用同尾酶bglii和bamhi双酶切构建的重组表达载体ppiczαa-ld，得到两端有相同粘性末端的单拷贝表达盒。该表达盒从aox启动子到aoxtt终止子，中间插入有目的基因ld。双酶切的体系如下：重组质粒ppiczαa-ld70.0μl、10×hbuffer10.0μl、ddh2o10.0μl、bglii(10u/μl)5.0μl、bamhi(15u/μl)5.0μl，终体积100μl，37℃过夜酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，割胶回收双酶切片段中较大片段，即单拷贝表达盒(单拷贝表达盒有2.1kb，剩下的片段为1.9kb)。用bamhi酶切重组表达载体ppiczαa-ld，得到与单拷贝表达盒用相同粘性末端的线性化载体。酶切体系如下：重组质粒ppiczαa-ld70.0μl、10×kbuffer10.0μl、ddh2o15.0μl、bamhi(15u/μl)5.0μl，终体积100μl，30℃过夜酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，割胶回收片段。将线性化的重组表达载体与单拷贝表达盒进行连接(图4，step2)，连接体系如下：线性化ppiczαa0.5μl，单拷贝表达盒5.0μl，solutioni5.0μl，终体积10.5μl，37℃连接1h，转入大肠杆菌dh5α感受态细胞。将适当体积复苏菌液，涂布于有25μg/mlzeocin低盐lb平板，37℃倒置培养，至长出单菌落。用bglii和bamhi双酶切筛选鉴定阳性克隆。此时，连接方向正确的二拷贝表达盒只有各一个bglii和bamhi酶切位点，bglii/bamhi双酶切时会产生一个与二拷贝表达盒片段相同大小的片段。

提取筛选得到的质粒ppiczαa-ld2，bamhi单酶切制备线性化重组表达载体ppiczαa-ld2；bglii和bamhi双酶切，割胶回收二拷贝表达盒，之后连接转化大肠杆菌dh5α感受态细胞(图4，step3)。用bglii和bamhi双酶切筛选鉴定阳性克隆，得到四拷贝表达盒重组表达载体。

将构建得到的载体分别用bglii/bamhi双酶切和bglii单酶切，琼脂糖凝胶电泳验证不同拷贝数质粒的大小。双酶切释放的片段分别是2.1kb、4.2kb和8.4kb(图5a)；单酶切得到的片段大小大约分别为4.1kb、6.2kb和10.4kb(图5b)，都与理论序列的大小相当。该结果显示本实验成功构建了目的基因ld的单拷贝、二拷贝和四拷贝表达盒表达载体。

1.4ppiczαa-ldn(n＝1，2或4)转化毕赤酵母x-33及酵母转化子的鉴定

采用bglii分别对ppiczαa-ldn(n＝2或4)进行线性化处理(ppiczαa-ldn84μl、10×hbuffer10μl、bglii(10u/μl)6μl，37℃8h)后，转化至感受态的毕赤酵母x-33(感受态细胞80μl、线性ppiczαa-ldn10μl，2000v、25μf、200ω、5ms)。通过zeocin筛选阳性酵母转化子，对其基因组dna提取纯化后，以不同拷贝数ld表达盒转化子酵母基因组dna为模板进行目的基因的pcr鉴定(无菌水14.1μl、10×taqbuffer2.0μl、dntp(2.5mmol/l)1.6μl、5′aox1(10μmol/l)0.8μl、3′aox1或ld-p5(10μmol/l)0.8μl、酵母基因组dna0.5μl、taqdna聚合酶(2.5u/μl)0.2μl，终体积20μl；反应条件：94℃预变性3min、94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min、30个循环，最终72℃延伸5min)。结果见图7，其中泳道m左边是以引物5′aox1和3′aox1进行pcr的结果，其中1069bp处为扩增的含目的基因的条带，2200bp处为毕赤酵母x-33中因存在醇氧化酶基因aox1自身的引物结合位点而扩增的条带；泳道m右边是以引物5′aox1和ld-p5pcr扩增结果，结果显示了一个898bp的明显条带，与理论值相符。由此看出不同拷贝数表达盒重组表达载体ppiczαa-ldn(n＝1，2或4)都已成功整合到毕赤酵母基因组。

1.5实时定量pcr鉴定阳性转化子的拷贝数

根据基因片段ld序列设计引物如下：

ld-f:5′-aggtatcactgcttgggttgcttg-3′

ld-r:5′-tacatcatcaccaccaccaccaac-3′

单拷贝表达盒重组表达载体ppiczαa-ld作为单拷贝标准品建立标准曲线。根据公式:

计算得到起始质粒拷贝数为1.15×10¹¹。将其依次进行10倍稀释，共5个梯度，每个梯度三个平行样品作扩增的标准曲线。将提取的不同拷贝数ld表达盒酵母转化子的酵母基因组稀释成50ng/μl作为qpcr模板，每个样品三个平行。实时定量pcr使用appliedbiosystems7500real-timepcrsystem，操作程序为7500softwarev2.0.6。反应体系如下：2×sybrpremixextaqii25μl，ld-f(10μmol/l)和ld-r(10μmol/l)各2μl，roxpeferencedyeii1μl，template2μl，无菌水将反应液调至50μl。反应条件：50℃启动2min，95℃预变性1min，95℃变性10s，60℃延伸60s，反应40个循环。反应结束后做溶解曲线，验证反应的特异性。

结果见图8a，标准曲线的斜率为-3.36，r²为0.992，扩增效率为98.447％。单拷贝至四拷贝的三个平行样品ct值的平均值分别为：20.70、17.35和16.69。该结果证明ld单拷贝，二拷贝和四拷贝酵母转化子的ct值存在正相关关系，即后者总比前者早达到荧光信号阈值。转化多拷贝表达盒重组表达载体，可以使整合到酵母基因组上的目的基因的拷贝数增加。本研究中所有样品中的ct值的标准偏差都不超过0.19。并且从所有样品的熔解曲线都呈现单一的融解峰(图8b)，可以看出，样品中都不存在非特异性扩增，表明这引物特异性好，结果准确可靠。

实施例2

重组杂合抗菌肽ld的表达、纯化及其抑菌活性和稳定性

2.1甲醇诱导表达重组杂合抗菌肽ld

阳性酵母转化子接种至100mlbmg培养基(0.1mol/l山梨醇，0.1mol/l磷酸钾缓冲液ph6.0，1.34％ynb，4×10^-5生物素，1％甘油)中，8层纱布封口，29℃、250r/min摇床振荡培养至od6004.0左右；将菌体从bmg培养基中转移至相同体积的bmm培养基(0.1mol/l磷酸钾缓冲液ph6.0，1.34％ynb，4×10^-5生物素，0.75％甲醇)中，29℃、250r/min诱导表达目的蛋白；每隔24h补加甲醇至终体积的0.75％。0.75％甲醇诱导表达x-33/ppiczαa酵母转化子和x-33/ppiczαa-ld4酵母转化子120h后，离心后上清用3kda的超滤离心管浓缩，12％sds-page分析蛋白条带。结果显示(图9a)，x-33/ppiczαa-ld4发酵上清在20.7kda处有明显目的条带，但x-33/ppiczαa发酵上清中并未发现相应的目的条带。

对确定拷贝数的单拷贝、二拷贝和四拷贝表达盒酵母转化子进行甲醇诱导表达120h。表达上清经3kda超滤离心管浓缩后，与2×蛋白上样缓冲液混合，取25μl上样，进行电泳。电泳结果显示，随基因拷贝数增多，目的蛋白的浓度增加(图9b)。从诱导0h开始，每隔24h取1ml培养物，离心得到菌体沉淀和上清，称菌体沉淀湿重和测上清总蛋白浓度。如图10a，结果发现随着诱导时间的延长，菌体不断增长，x-33\ppiczαa-ldn(n＝1，2或4)，即整合有目的基因的酵母菌株，和x-33/ppiczαa，即整合有空质粒的酵母菌株在细胞生长方面区别不大，但是x-33\ppiczαa-defbl3，即整合有防御素defbl3基因的酵母菌株72h后菌体量就不再增长，反而下降。而用folin酚法测得发酵上清总蛋白浓度也随时间的增加而增加，四拷贝表达盒酵母转化子x-33\ppiczαa-ld4表达的总蛋白比较多(图10b)。

2.2分离纯化重组杂合抗菌肽ld

在重组蛋白ld的n端有6×his标签，因此可以用固化金属离子亲和层析(imac)分离纯化ld。100ml发酵上清通过0.22μm滤膜处理后，与预平衡缓冲液混合，通过profinia蛋白纯化系统，经1mlni²⁺(bio-scaleminiprofinityimaccartridges)捕获、不同浓度咪唑洗脱和5ml脱盐柱(bio-scaleminibio-gelp-6desaltingcartridges)脱盐，获得纯化的目的重组蛋白ld。纯化后样品经浓缩后用15.5％tricine-sds-page和westernblot分析。

经folin酚法测定纯化蛋白质浓度为0.44mg/ml，推算出表达量约为17.6mg/l。(推算过程：100ml的发酵液经纯化得到4ml纯品，纯品的蛋白质浓度0.44mg/ml，100ml的发酵液中的蛋白质总量为1.76mg，所以1l样品的蛋白浓度为17.6mg/l)。该结果明显高于背景技术中述及的黑鲷hepcidin、人hepcidin和黄金海马抗菌因子hkabf在毕赤酵母中的表达量。图11是对纯化的重组杂合肽的tricine-sds-page分析结果，其中泳道m为蛋白质分子量标准，泳道1的20.7kda处为亲和层析纯化后的重组杂合肽。

采用抗6×his鼠单克隆抗体对纯化的重组蛋白ld进行westernblot分析，结果如图11泳道2所示，右边箭头处为纯化的重组蛋白ld经抗体捕获的单一条带。进一步证明了目的重组蛋白ld在毕赤酵母中的表达。

2.3抑菌实验

用微量液体-菌落计数法(microliquid-bacterialcolonynotation)检验重组蛋白ld的抑菌活性。选取革兰氏阳性细菌单增李斯特菌(l.monocytogenes)、和革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)作为指示菌。用液体lb培养基过夜培养上述指示菌到对数生长期(od6001.4左右)。将转化有ppiczαa-ldn(n＝1，2或4)的酵母发酵上清和指示菌悬液50:1混合，37℃孵育4h，充分混合后取30μl涂营养琼脂板，37℃恒温箱过夜培养。用转化有空质粒的酵母x-33/ppiczαa的发酵上清作阴性对照。

如图12所示，ln和pn平板上长满了菌落，而ls和ps则只有几个菌落。该抑菌试验结果表明，含有重组蛋白ld的发酵上清对革兰氏阳性的单增李斯特菌和革兰氏阴性的铜绿假单胞菌都有很好的抑制效果。同时，x-33/ppiczαa发酵上清对两种指示菌没有抑制效果。不同拷贝数转化子发酵上清对单增李斯特菌的抑制效果不同。二拷贝和四拷贝转化子上清的抑制效果明显强于单拷贝转化子发酵上清(图13)，从而也证明了二拷贝和四拷贝转化子中含有的目的蛋白ld浓度要高于单拷贝转化子，即增加目的基因的拷贝数可以增加其的表达量。

综上所述，重组蛋白ld成功地在构建的毕赤酵母表达系统中表达，并且x-33/ppiczαa-ld4的表达量最高(图9b，图10a和图13)。摇瓶中用0.75％甲醇诱导表达120h时，x-33/ppiczαa-ld4转化子表达的总蛋白量和目的蛋白量分别是x-33/ppiczαa-ld转化子的1.10倍和1.67倍。该效果优于背景技术中提到的构建真菌防御素plectasin的8拷贝表达盒载体的例子。也证明了体外构建多拷贝表达盒表达载体来增加目的蛋白的产量的策略是有效的。

2.4耐高温实验

将转化有ppiczαa-ld4的酵母发酵上清在100℃水浴中保温30分钟，通过琼脂糖扩散法测定其对单增李斯特菌(l.monocytogenes)和铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)的抑菌活性。结果如图14所示，经高温处理后的发酵上清仍然显示了对该两种菌的抑菌活性，间接证明了其可以作为添加剂在水产饲料制作(高温压片)中使用。

2.5体外肠激酶消化实验

将转化有ppiczαa-ld4的酵母发酵上清与肠激酶按总蛋白质量:酶量为50μg:1u的比例，在25℃、一定的溶液(5mmtris-hcl、50mmnacl、2mmcacl2)中反应10小时，通过琼脂糖扩散法测定其对单增李斯特菌和铜绿假单胞菌的抑菌活性。结果如图15所示，肠激酶消化后的混合液显示了对该两种菌的抑菌活性，预示了本发明的杂合抗菌肽在鱼类消化道内被肠激酶消化后确实能发挥良好的抑菌作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>上海海洋大学

<120>一种杂合抗菌肽及其制备方法和应用

<130>2017

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>123

<212>dna

<213>斑马鱼β-防御素

<400>1

acagacgtgcagagatggacatgcggataccgaggactatgcaggaagcactgctatgca60

cgggagtatatgattggttatcgtggctgccctcgcagatacaggtgctgtgctttgcga120

ttt123

<210>2

<211>123

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

actgacgttcaaagatggacttgtggttacagaggtttgtgtagaaagcactgttacgct60

agagaatacatgatcggttacagaggttgtccaagaagatacagatgttgtgctttgaga120

ttc123

<210>3

<211>375

<212>dna

<213>斑点叉尾鮰c型溶菌酶

<400>3

tatgatcggtgtgagctggcaagagccatgaaagcaaatggcttggacggctatcatggc60

atcagtctggctaactgggtttgcttggccaaacatgaatccgattacaacaccaaagcc120

atcaaccacaacactgatggatcaacggactatggcattttccagatgaacaaccgttgg180

tggtgtagcaatggcagcttccgtagcgcgaacgggtgtaaaatctcctgcaatcagctt240

cttactgataacatctaccaagctgctcagtgtgccaagaccatagtgagacagcagggc300

attactgcatgggtggcatggcgcagatattgccggggtcgtgatgtaagctcttacact360

gcaggctgtggagtt375

<210>4

<211>375

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tacgacagatgtgaattggctagagctatgaaggctaacggtttggacggttaccacggt60

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<210>5

<211>525

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

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<210>6

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<212>prt

<213>人工序列

<400>6

tyraspargcysgluleualaargalametlysalaasnglyleuasp

151015

glytyrhisglyileserleualaasntrpvalcysleualalyshis

202530

gluserasptyrasnthrlysalaileasnhisasnthraspglyser

354045

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505560

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100105110

glyargaspvalsersertyrthralaglycysglyvalglyglygly

115120125

glyaspaspaspasplysthraspvalglnargtrpthrcysglytyr

130135140

argglyleucysarglyshiscystyralaargglutyrmetilegly

145150155160

tyrargglycysproargargtyrargcyscysalaleuargphe

165170175