用于构建人类线粒体DNA文库的预捕获引物、捕获探针及构建方法、测序方法和应用与流程

本发明涉及基因组学
技术领域：
，尤其是涉及一种用于构建人类线粒体dna文库的预捕获引物、捕获探针及构建方法、测序方法和应用。
背景技术：
：线粒体是真核生物细胞内非常重要的细胞器，是真核生物进行氧化代谢的主要部位，是糖类等物质在细胞中最终氧化释放能量的场所。线粒体自身具有一套独立的基因组，它只在卵母细胞中进行分裂，因此具有母系遗传的特点，即只通过女性向下一代进行传递。线粒体dna基因突变的传递有一定数量上的特点。每个细胞中含有大量线粒体，如果细胞内所有的线粒体dna上的某一位点均为同一类型的碱基，即全部都是正常基因或同为突变基因，则该细胞为纯质的；如果细胞内所有的线粒体dna上的某一位点同时存在正常基因和突变基因，则该细胞为异质的。当异质率到达一定的水平后，就有可能对细胞的正常功能产生影响。研究显示，线粒体基因的突变会导致：kss综合症，leigh氏病或称亚急性坏死性脑肌病，elas综合症，merrf综合症，leber氏遗传性视神经萎缩症，alper综合症，慢性进行性外眼肌麻痹，线粒体神经消化道脑肌病，pearson综合症等。目前对人类线粒体基因组进行测序的方法主要有以下几种：1)使用多对引物扩增线粒体序列后，用一代测序方法进行检测。该方法需要引物序列从16-24对引物不等，需要将每对引物进行扩增后，进行一代测序。用该方法进行检测耗时长，对于低异质性突变不能有效进行检测。2)使用nimblegen芯片杂交系统、agilent液相杂交系统或其他杂交系统进行杂交后进行高通量检测。使用液相杂交系统需要合成大规模探针，合成价格较高的分子探针、均一性较差、难以对一些区域较大的基因组序列进行捕获等缺点。同时进行杂交捕获需要试剂组份较多，步骤繁杂，操作流程长，仪器要求严格。通过高通量测序仪进行检测，能对突变频率较低的异质性突变进行有效检测，但不能有效排除基因组dna对线粒体dna信息的干扰。因此，开发一种能够快速、准确、操作简单、省时省力的针对人类线粒体基因组进行测序的方法尤为重要。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供用于构建人类线粒体dna文库的预捕获引物，本发明的第二个目的在于提供用于构建人类线粒体dna文库的捕获探针，本发明的第三个目的在于提供一种人类线粒体dna文库的构建方法，本发明的第四个目的在于提供一种人类线粒体dna文库的测序方法，本发明的第五个目的在于提供上述方法在分析人类线粒体dna异质性中的应用，以缓解现有技术中存在的步骤繁杂，操作流程长，仪器要求严格，且检测效率低的技术问题。本发明提供的用于构建人类线粒体dna文库的预捕获引物，包括如下引物对：引物对1：包括e1fa和e1ra，所述e1fa具有如seqidno.1所示序列，e1ra具有如seqidno.2所示序列；引物对2：包括e2fa和e2ra，所述e2fa具有如seqidno.3所示序列，e2ra具有如seqidno.4所示序列；引物对3：包括e3fa和e3ra，所述e3fa具有如seqidno.5所示序列，e3ra具有如seqidno.6所示序列；引物对4：包括e4fa和e4ra，所述e4fa具有如seqidno.7所示序列，e4ra具有如seqidno.8所示序列；引物对5：包括e5fa和e5ra，所述e5fa具有如seqidno.9所示序列，e5ra具有如seqidno.10所示序列；引物对6：包括e6fa和e6ra，所述e6fa具有如seqidno.11所示序列，e6ra具有如seqidno.12所示序列。本发明还提供了用于构建人类线粒体dna文库的捕获探针，包括如下探针组：探针组1：e1f具有如seqidno.13所示序列，e1r具有如seqidno.14所示序列，e8f具有如seqidno.15所示序列，e8r具有如seqidno.16所示序列，e15f具有如seqidno.17所示序列，e15r具有如seqidno.18所示序列，e22f具有如seqidno.19所示序列，e22r具有如seqidno.20所示序列，e29f具有如seqidno.21所示序列，e29r具有如seqidno.22所示序列，e36f具有如seqidno.23所示序列，e36r具有如seqidno.24所示序列，e43f具有如seqidno.25所示序列，e43r具有如seqidno.26所示序列，e50f具有如seqidno.27所示序列，e50r具有如seqidno.28所示序列，e57f具有如seqidno.29所示序列，e57r具有如seqidno.30所示序列；探针组2：e2f具有如seqidno.31所示序列，e2r具有如seqidno.32所示序列，e9f具有如seqidno.33所示序列，e9r具有如seqidno.34所示序列，e16f具有如seqidno.35所示序列，e16r具有如seqidno.36所示序列，e23f具有如seqidno.37所示序列，e23r具有如seqidno.38所示序列，e30f具有如seqidno.39所示序列，e30r具有如seqidno.40所示序列，e37f具有如seqidno.41所示序列，e37r具有如seqidno.42所示序列，e44f具有如seqidno.43所示序列，e44r具有如seqidno.44所示序列，e51f具有如seqidno.45所示序列，e51r具有如seqidno.46所示序列，e58f具有如seqidno.47所示序列，e58r具有如seqidno.48所示序列；探针组3：e3f具有如seqidno.49所示序列，e3r具有如seqidno.50所示序列，e10f具有如seqidno.51所示序列，e10r具有如seqidno.52所示序列，e17f具有如seqidno.53所示序列，e17r具有如seqidno.54所示序列，e24f具有如seqidno.55所示序列，e24r具有如seqidno.56所示序列，e31f具有如seqidno.57所示序列，e31r具有如seqidno.58所示序列，e38f具有如seqidno.59所示序列，e38r具有如seqidno.60所示序列，e45f具有如seqidno.61所示序列，e45r具有如seqidno.62所示序列，e52f具有如seqidno.63所示序列，e52r具有如seqidno.64所示序列，e59f具有如seqidno.65所示序列，e59r具有如seqidno.66所示序列；探针组4：e4f具有如seqidno.67所示序列，e4r具有如seqidno.68所示序列，e11f具有如seqidno.69所示序列，e11r具有如seqidno.70所示序列，e18f具有如seqidno.71所示序列，e18r具有如seqidno.72所示序列，e25f具有如seqidno.73所示序列，e25r具有如seqidno.74所示序列，e32f具有如seqidno.75所示序列，e32r具有如seqidno.76所示序列，e39f具有如seqidno.77所示序列，e39r具有如seqidno.78所示序列，e46f具有如seqidno.79所示序列，e46r具有如seqidno.80所示序列，e53f具有如seqidno.81所示序列，e53r具有如seqidno.82所示序列，e60f具有如seqidno.83所示序列，e60r具有如seqidno.84所示序列；探针组5：e5f具有如seqidno.85所示序列，e5r具有如seqidno.86所示序列，e12f具有如seqidno.87所示序列，e12r具有如seqidno.88所示序列，e19f具有如seqidno.89所示序列，e19r具有如seqidno.90所示序列，e26f具有如seqidno.91所示序列，e26r具有如seqidno.92所示序列，e33f具有如seqidno.93所示序列，e33r具有如seqidno.94所示序列，e40f具有如seqidno.95所示序列，e40r具有如seqidno.96所示序列，e47f具有如seqidno.97所示序列，e47r具有如seqidno.98所示序列，e54f具有如seqidno.99所示序列，e54r具有如seqidno.100所示序列，e61f具有如seqidno.101所示序列，e61r具有如seqidno.102所示序列；探针组6：e6f具有如seqidno.103所示序列，e6r具有如seqidno.104所示序列，e13f具有如seqidno.105所示序列，e13r具有如seqidno.106所示序列，e20f具有如seqidno.107所示序列，e20r具有如seqidno.108所示序列，e27f具有如seqidno.109所示序列，e27r具有如seqidno.110所示序列，e34f具有如seqidno.111所示序列，e34r具有如seqidno.112所示序列，e41f具有如seqidno.113所示序列，e41r具有如seqidno.114所示序列，e48f具有如seqidno.115所示序列，e48r具有如seqidno.116所示序列，e55f具有如seqidno.117所示序列，e55r具有如seqidno.118所示序列，e62f具有如seqidno.119所示序列，e62r具有如seqidno.120所示序列；探针组7：e7f具有如seqidno.121所示序列，e7r具有如seqidno.122所示序列，e14f具有如seqidno.123所示序列，e14r具有如seqidno.124所示序列，e21f具有如seqidno.125所示序列，e21r具有如seqidno.126所示序列，e28f具有如seqidno.127所示序列，e28r具有如seqidno.128所示序列，e35f具有如seqidno.129所示序列，e35r具有如seqidno.130所示序列，e42f具有如seqidno.131所示序列，e42r具有如seqidno.132所示序列，e49f具有如seqidno.133所示序列，e49r具有如seqidno.134所示序列，e56f具有如seqidno.135所示序列，e56r具有如seqidno.136所示序列，e63f具有如seqidno.137所示序列，e63r具有如seqidno.138所示序列。本发明还提供了一种人类线粒体dna文库的构建方法，所述构建方法包括：以待测dna为模板，使用上述的预捕获引物预捕获得到预捕获产物，以所述预捕获产物为模板，使用上述的捕获探针捕获得到捕获产物，在所述捕获产物两端连接接头序列，构建所述人类线粒体dna文库。进一步地，所述构建方法还包括在接头序列上引入标签序列，所述标签序列用于标记不同来源样品dna。进一步地，所述标签序列位于所述接头序列的末端。进一步地，所述待测dna为由家系成员外周静脉血中提取的血液全基因组dna。进一步地，所述接头序列可根据不同测序平台进行替换。本发明还提供了上述构建方法构建得到的人类线粒体dna文库的测序方法，所述测序方法包括：将构建得到的人类线粒体dna文库在测序平台，采用边合成边测序的方法进行序列的测定，得到测序数据。进一步地，所述测序方法还包括对所述测序数据进行分析。另外，本发明还提供了上述构建方法和测序方法在分析人类线粒体dna异质性中的应用。本发明提供的用于构建人类线粒体dna文库的预捕获引物和捕获探针，能够实现对人类线粒体序列的快速捕获。本发明提供的构建方法，能够降低基因组dna中同源序列影响线粒体序列分析的干扰，在构建文库时，只需要进行三步pcr的方法即可完成从目标序列筛选，到目标序列捕获，到接头序列引入的过程，降低了操作难度和提高了实验效率，并且，由于本发明的主要流程均在pcr仪上完成，使用试剂便捷，价格低廉，在普通实验室内即可完成。附图说明图1为本发明提供的人类线粒体dna文库的构建方法及测序方法的流程图；图2为本发明实施例3提供的预捕获步骤后e1-e5引物的捕获产物电泳结果图；图3为本发明实施例3提供的预捕获步骤后e6引物的捕获产物电泳结果图；图4为本发明实施例3提供的捕获步骤后7组探针的捕获产物电泳结果图。具体实施方式下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供的一种人类线粒体dna文库的构建方法，包括：以待测dna为模板，分别使用本发明提供的6对预捕获引物预捕获得到预捕获产物，进行初步富集；将预捕获产物混合并纯化后，以预捕获产物为模板，分别使用本发明提供的捕获探针捕获得到捕获产物，进行再次富集；在捕获产物两端连接接头序列，构建人类线粒体dna文库。其中，预捕获产物为大片段的线粒体基因组。在本发明中，构建方法还包括在接头序列上引入标签序列，用于标记不同来源样品dna。其中，标签序列位于所述接头序列的末端。在本发明中，待测dna为由家系成员外周静脉血中提取的血液全基因组dna。在本发明中，接头序列可根据不同测序平台进行替换。其中，替换方法为将本发明提供的捕获探针序列中的:“ctttccctacacgacgctcttccgatct”和“tggagttcagacgtgtgctcttccgatct”序列根据测序平台进行更改替换。例如可以为，但不限于将“ctttccctacacgacgctcttccgatct”替换为“ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag”，将“tggagttcagacgtgtgctcttccgatct”替换为“cctctctatgggcagtcggtgat”，即可用于iontorrent平台检测。只需要更换为所使用测序平台提供的对应接头探针序列，即可适用于illumina、roche454或iontorrent等第二代测序平台，有较广的应用前景。本发明还提供了上述的构建方法构建得到的人类线粒体dna文库的测序方法，包括：将构建得到的人类线粒体dna文库在测序平台，采用边合成边测序的方法进行序列的测定，得到测序数据。在本发明中，测序方法还包括对所述测序数据进行分析。其中，分析所用的方法或软件例如可以为，但不限于spades、gapcloser、gapfiller、prinses-g或samtools。另外，本发明还提供了上述构建方法和测序方法在分析人类线粒体dna异质性中的应用。为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。实施例1设计引物和探针根据发明所需，设计预捕获引物如表1所示：表1预捕获引物名称序列序号e1fagggagctctccatgcatttgseqidno.1e2fagcacacccgtctatgtagcaseqidno.3e3fatcctactcctcattgtacccaseqidno.5e4faccatccttaccaccctcgttseqidno.7e5fagaaaaccccacaaaccccattseqidno.9e6faaaggactgcaaaaccccactseqidno.11e1racaggcggtgcctctaatactseqidno.2e2racctgcggcgtattcgatgttseqidno.4e3ragtgggtttaagtcccattggtseqidno.6e4ratggtcgtggttgtagtccgtseqidno.8e5raggatgaggcaggaatcaaagacseqidno.10e6raaaggtggatgcgacaatggaseqidno.12根据发明所需，设计捕获探针和分组如下所示：探针组1：e1f具有如seqidno.13所示序列，e1r具有如seqidno.14所示序列，e8f具有如seqidno.15所示序列，e8r具有如seqidno.16所示序列，e15f具有如seqidno.17所示序列，e15r具有如seqidno.18所示序列，e22f具有如seqidno.19所示序列，e22r具有如seqidno.20所示序列，e29f具有如seqidno.21所示序列，e29r具有如seqidno.22所示序列，e36f具有如seqidno.23所示序列，e36r具有如seqidno.24所示序列，e43f具有如seqidno.25所示序列，e43r具有如seqidno.26所示序列，e50f具有如seqidno.27所示序列，e50r具有如seqidno.28所示序列，e57f具有如seqidno.29所示序列，e57r具有如seqidno.30所示序列；探针组2：e2f具有如seqidno.31所示序列，e2r具有如seqidno.32所示序列，e9f具有如seqidno.33所示序列，e9r具有如seqidno.34所示序列，e16f具有如seqidno.35所示序列，e16r具有如seqidno.36所示序列，e23f具有如seqidno.37所示序列，e23r具有如seqidno.38所示序列，e30f具有如seqidno.39所示序列，e30r具有如seqidno.40所示序列，e37f具有如seqidno.41所示序列，e37r具有如seqidno.42所示序列，e44f具有如seqidno.43所示序列，e44r具有如seqidno.44所示序列，e51f具有如seqidno.45所示序列，e51r具有如seqidno.46所示序列，e58f具有如seqidno.47所示序列，e58r具有如seqidno.48所示序列；探针组3：e3f具有如seqidno.49所示序列，e3r具有如seqidno.50所示序列，e10f具有如seqidno.51所示序列，e10r具有如seqidno.52所示序列，e17f具有如seqidno.53所示序列，e17r具有如seqidno.54所示序列，e24f具有如seqidno.55所示序列，e24r具有如seqidno.56所示序列，e31f具有如seqidno.57所示序列，e31r具有如seqidno.58所示序列，e38f具有如seqidno.59所示序列，e38r具有如seqidno.60所示序列，e45f具有如seqidno.61所示序列，e45r具有如seqidno.62所示序列，e52f具有如seqidno.63所示序列，e52r具有如seqidno.64所示序列，e59f具有如seqidno.65所示序列，e59r具有如seqidno.66所示序列；探针组4：e4f具有如seqidno.67所示序列，e4r具有如seqidno.68所示序列，e11f具有如seqidno.69所示序列，e11r具有如seqidno.70所示序列，e18f具有如seqidno.71所示序列，e18r具有如seqidno.72所示序列，e25f具有如seqidno.73所示序列，e25r具有如seqidno.74所示序列，e32f具有如seqidno.75所示序列，e32r具有如seqidno.76所示序列，e39f具有如seqidno.77所示序列，e39r具有如seqidno.78所示序列，e46f具有如seqidno.79所示序列，e46r具有如seqidno.80所示序列，e53f具有如seqidno.81所示序列，e53r具有如seqidno.82所示序列，e60f具有如seqidno.83所示序列，e60r具有如seqidno.84所示序列；探针组5：e5f具有如seqidno.85所示序列，e5r具有如seqidno.86所示序列，e12f具有如seqidno.87所示序列，e12r具有如seqidno.88所示序列，e19f具有如seqidno.89所示序列，e19r具有如seqidno.90所示序列，e26f具有如seqidno.91所示序列，e26r具有如seqidno.92所示序列，e33f具有如seqidno.93所示序列，e33r具有如seqidno.94所示序列，e40f具有如seqidno.95所示序列，e40r具有如seqidno.96所示序列，e47f具有如seqidno.97所示序列，e47r具有如seqidno.98所示序列，e54f具有如seqidno.99所示序列，e54r具有如seqidno.100所示序列，e61f具有如seqidno.101所示序列，e61r具有如seqidno.102所示序列；探针组6：e6f具有如seqidno.103所示序列，e6r具有如seqidno.104所示序列，e13f具有如seqidno.105所示序列，e13r具有如seqidno.106所示序列，e20f具有如seqidno.107所示序列，e20r具有如seqidno.108所示序列，e27f具有如seqidno.109所示序列，e27r具有如seqidno.110所示序列，e34f具有如seqidno.111所示序列，e34r具有如seqidno.112所示序列，e41f具有如seqidno.113所示序列，e41r具有如seqidno.114所示序列，e48f具有如seqidno.115所示序列，e48r具有如seqidno.116所示序列，e55f具有如seqidno.117所示序列，e55r具有如seqidno.118所示序列，e62f具有如seqidno.119所示序列，e62r具有如seqidno.120所示序列；探针组7：e7f具有如seqidno.121所示序列，e7r具有如seqidno.122所示序列，e14f具有如seqidno.123所示序列，e14r具有如seqidno.124所示序列，e21f具有如seqidno.125所示序列，e21r具有如seqidno.126所示序列，e28f具有如seqidno.127所示序列，e28r具有如seqidno.128所示序列，e35f具有如seqidno.129所示序列，e35r具有如seqidno.130所示序列，e42f具有如seqidno.131所示序列，e42r具有如seqidno.132所示序列，e49f具有如seqidno.133所示序列，e49r具有如seqidno.134所示序列，e56f具有如seqidno.135所示序列，e56r具有如seqidno.136所示序列，e63f具有如seqidno.137所示序列，e63r具有如seqidno.138所示序列。实施例2样本制备dna提取1.采集标本：经伦理委员会批准、家系成员签署知情同意书后收集家系成员外周静脉血2ml，用于基因检测。2.全基因组dna的抽提：按血液基因组dna抽提试剂盒操作说明进行操作，试剂盒为dneasyblood&tissuekit。实施例3人类线粒体dna文库的构建(1)预捕获以实施例2中提取的dna为模板，分别使用本发明实施例1提供的6对预捕获引物(表1所示)捕获pcr，获得靶序列预捕获产物。预捕获反应体系参见表3。表3预捕获体系试剂体积10×pcrbufferwithmg2+2.5μldntpmixture(2.5mmeach)2μltaqdna聚合酶(5u/μl)0.125μl上游引物(10μm)1μl下游引物(10μm)1μl模板dna2μlddh2o16.375μl反应条件为95℃，3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸5min，共扩增30循环；最终72℃延伸10min。结果如图2和图3所示，从图2和图3中可以看出，使用预捕获引物捕获的片段完成，特异性良好，说明预捕获引物能有效发挥去除基因组dna干扰，富集线粒体dna片段的作用。(2)预捕获样本混合将步骤(1)获得的样本混合后，使用磁珠纯化后，作为模板进行捕获。(3)捕获捕获探针配比如本发明实施例1所示，分为7组，每组探针分别进行捕获。获反应体系参见表4。表格4捕获反应体系试剂体积10×pcrbufferwithmg2+2.5μldntpmixture(2.5mmeach)2μltaqdna聚合酶(5u/μl)0.125μl捕获探针1μl步骤(2)获得模板2μlddh2o16.375μl反应条件为95℃，3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共扩增30循环；最终72℃延伸10min。结果如图4所示，从图4中可以看出，7组探针捕获产物结果均一，说明捕获质量良好。将7组探针捕获产物混合后，使用磁珠纯化捕获产物。(5)pcr扩增捕获文库pcr扩增捕获产物，使用接头为illumina提供序列。pcr体系如表5所示：表5pcr扩增体系试剂体积来自步骤(4)模板21μlhifimix25μlann公共引物(10pmol/μl)2μlannindex(10pmol/μl)2μltotal50μl反应条件为95℃，3min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸60s，共扩增8个循环；最终72℃延伸10min。(6)pcr产物用磁珠纯化，最后溶于30μl纯水中。实施例4人类线粒体dna文库的测序将样品于illumina测序平台中进行双末端测序，同时对样品上的标签序列也进行测序。通过数据分析测序数据的样品来源，并对样品的捕获效果进行分析统计，捕获样本拼接结果如下：all_length:16696；n_num:0；max_len:16696；average_len:16696；contig_num:1；n50:16696；gap_num:0；gc_content:44.49。捕获样本突变注释结果如表7所示。表7捕获样本突变注释结果综上所述，通过对结果进行分析，使用本方法能有效捕获线粒体序列全长，并进行拼接，覆盖度达到100％，平均测序深度3500x以上，结合二代测序的大数据量优势，能有效对人类线粒体序列进行分析。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。<110>杭州祥音生物医药科技有限公司<120>用于构建人类线粒体dna文库的预捕获引物、捕获探针及构建方法、测序方法和应用<160>138<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gggagctctccatgcatttg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2caggcggtgcctctaatact20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gcacacccgtctatgtagca20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4cctgcggcgtattcgatgtt20<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5tcctactcctcattgtaccca21<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<400>6gtgggtttaagtcccattggt21<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7ccatccttaccaccctcgtt20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8tggtcgtggttgtagtccgt20<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9gaaaaccccacaaaccccatt21<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列<400>10ggatgaggcaggaatcaaagac22<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11aaggactgcaaaaccccact20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12aaggtggatgcgacaatgga20<210>13<211>48<212>dna<213>人工序列<400>13ctttccctacacgacgctcttccgatctgggagctctccatgcatttg48<210>14<211>50<212>dna<213>人工序列<400>14tggagttcagacgtgtgctcttccgatctaaagtgcataccgccaaaaga50<210>15<211>50<212>dna<213>人工序列<400>15ctttccctacacgacgctcttccgatctctgccaaaccccaaaaacaaag50<210>16<211>51<212>dna<213>人工序列<400>16tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttcgtggtgatttagagggtgaa51<210>17<211>48<212>dna<213>人工序列<400>17ctttccctacacgacgctcttccgatctttagacgggctcacatcacc48<210>18<211>49<212>dna<213>人工序列<400>18tggagttcagacgtgtgctcttccgatctacgccggcttctattgactt49<210>19<211>49<212>dna<213>人工序列<400>19ctttccctacacgacgctcttccgatctctaaccccagggttggtcaat49<210>20<211>49<212>dna<213>人工序列<400>20tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgagcaagaggtggtgaggtt49<210>21<211>48<212>dna<213>人工序列<400>21ctttccctacacgacgctcttccgatctggcggtgcttcatatccctc48<210>22<211>50<212>dna<213>人工序列<400>22tggagttcagacgtgtgctcttccgatctatacttgaggagggtgacggg50<210>23<211>49<212>dna<213>人工序列<400>23ctttccctacacgacgctcttccgatctgggtcgaaggtggatttagca49<210>24<211>49<212>dna<213>人工序列<400>24tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttgcgccaggtttcaatttct49<210>25<211>48<212>dna<213>人工序列<400>25ctttccctacacgacgctcttccgatcttgagctaaacctagccccaa48<210>26<211>49<212>dna<213>人工序列<400>26tggagttcagacgtgtgctcttccgatctatcaccaggctcggtaggtt49<210>27<211>48<212>dna<213>人工序列<400>27ctttccctacacgacgctcttccgatctgcacacccgtctatgtagca48<210>28<211>49<212>dna<213>人工序列<400>28tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttgggtgtgaggagttcagtt49<210>29<211>48<212>dna<213>人工序列<400>29ctttccctacacgacgctcttccgatctggcctaaaagcagccaccaa48<210>30<211>49<212>dna<213>人工序列<400>30tggagttcagacgtgtgctcttccgatctcaggcggtgcctctaatact49<210>31<211>50<212>dna<213>人工序列<400>31ctttccctacacgacgctcttccgatctcaggcatgctcataaggaaagg50<210>32<211>50<212>dna<213>人工序列<400>32tggagttcagacgtgtgctcttccgatctagtttaggacctgtgggtttg50<210>33<211>49<212>dna<213>人工序列<400>33ctttccctacacgacgctcttccgatctgcgggcataacacagcaagac49<210>34<211>52<212>dna<213>人工序列<400>34tggagttcagacgtgtgctcttccgatctcctggattactccggtctgaact52<210>35<211>47<212>dna<213>人工序列<400>35ctttccctacacgacgctcttccgatctcgatggtgcagccgctatt47<210>36<211>49<212>dna<213>人工序列<400>36tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgttggggcctttgcgtagtt49<210>37<211>49<212>dna<213>人工序列<400>37ctttccctacacgacgctcttccgatcttcctactcctcattgtaccca49<210>38<211>50<212>dna<213>人工序列<400>38tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttcagggcgtagtttgagtttg50<210>39<211>49<212>dna<213>人工序列<400>39ctttccctacacgacgctcttccgatctcctcaacctaggcctcctatt49<210>40<211>49<212>dna<213>人工序列<400>40tggagttcagacgtgtgctcttccgatctcctgcggcgtattcgatgtt49<210>41<211>48<212>dna<213>人工序列<400>41ctttccctacacgacgctcttccgatctctccacactagcagagacca48<210>42<211>50<212>dna<213>人工序列<400>42tggagttcagacgtgtgctcttccgatctatgctagggtgagtggtagga50<210>43<211>48<212>dna<213>人工序列<400>43ctttccctacacgacgctcttccgatctcatacccccgattccgctac48<210>44<211>49<212>dna<213>人工序列<400>44tggagttcagacgtgtgctcttccgatctagtgtgcctgcaaagatggt49<210>45<211>46<212>dna<213>人工序列<400>45ctttccctacacgacgctcttccgatctcgggcccataccccgaaa46<210>46<211>49<212>dna<213>人工序列<400>46tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgggtgccttgggtaacctct49<210>47<211>49<212>dna<213>人工序列<400>47ctttccctacacgacgctcttccgatctccggacaatgaaccataacca49<210>48<211>51<212>dna<213>人工序列<400>48tggagttcagacgtgtgctcttccgatctagttgagtagtaggaatgcggt51<210>49<211>51<212>dna<213>人工序列<400>49ctttccctacacgacgctcttccgatctaccgtacaaccctaacataacca51<210>50<211>49<212>dna<213>人工序列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