与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记、方法及应用与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记、方法及应用。

背景技术：

辣椒利用cms育性基因(cytoplasmicmalesterility)三系配套制种可以省去人工去雄，提高种子纯度，同时有利于知识产权的保护。但是，如果父本的育性恢复力不强，则会严重影响f1的果形和产量。因此，选育恢复性强、配合力高、农艺性状优良的恢复系(父本)成为辣椒cms在杂种优势利用中急需解决的主要问题之一。传统的辣椒cms育性基因选择是根据测交组合的育性表现进行筛选。分子标记辅助选择可直接反映不同材料dna的多态性差异，并且选择不受时间和环境的影响。通过育性紧密连锁的分子标记直接进行育性基因的选择，可以有效加快恢复系的筛选进程。目前，分子标记辅助育种技术已在多种作物的cms恢复系选育中得到应用，在杂交后代(或花药再生植株)苗期鉴定有rf基因的个体，短时间内即可在室内检测大量样品，显著提高育种的选择效率。众多研究认为辣椒育性恢复是由主效恢复基因rf控制，另外还受修饰基因和环境因素的影响。

现有技术中，与辣椒性状相关的分子标记研究主要包括：(1)采用rapd技术发现位于rf基因两侧的标记op131400(0.37cm)和ow19800(8.12cm)；已经有研究学者将分子标记opp131400转化为更容易操作的opp13-caps(hinfi)标记，此opp13-caps标记为显性标记且通用性较强。(2)利用与rf基因连锁的rapd标记opt-02/570(5cm)开发出的一个sts标记crf-scar。(3)将aflp标记afrf8转化成一个与rf基因紧密连锁的共显性caps标记afrf8caps(1.8cm)。(4)在辣椒中存在部分可育(pr)现象，利用aflp-bsa方法开发出1个与pr基因连锁的分子标记pr-caps(1.8cm)，可用于部分育性材料的去除。(5)利用bsa分析法筛选得到pcr标记s4181515，并证明其能用于候选育性材料的初筛。(6)利用aflp技术开发了3个与rf基因连锁的标记afrf1、afrf3和afrf4，并转化为可用于pcr的标记类型。(7)发现af208834标记与rf基因连锁，遗传距离为20.8cm。(8)利用矮牵牛rf基因筛选辣椒bac文库开发出连锁标记bac13t7scar(1.4cm)。(9)以甜椒为试材，利用srap分子标记技术筛选得到一个与甜椒恢复基因相关的分子标记，并成功地将此srap标记转化为简单、稳定的scar标记。(10)利用36份已知基因型(rfrf或rfrf)的辣椒自交系对11对已报道的辣椒恢复基因连锁标记进行适用性检验，发现显性标记crf3s1s和crf-scar的适用性最广，其准确率分别为91.67％、88.89％；在6对共显性标记中carf-fl-m2的适用性最广，其准确率为80.56％。育种实际应用中可以首先利用显性标记crf3s1s或者crf-scar对辣椒材料进行初次鉴定，对其中含有rf基因的辣椒材料利用共显性标记carf-fl-m2再次进行鉴定。(11)利用已报道的9个与辣椒恢复基因连锁的标记对加工型辣椒cms不育系83-3a、恢复系812、f1(83-3a×812)、f1'(f1×83-3b)与保持系83-3b回交群体进行试验，发现crf-scar、pr-caps和opp13-caps标记与cms育性恢复基因rf紧密连锁，但标记crf-scar不需要酶切，通过pcr产物电泳就能鉴定加工型辣椒材料中是否含有恢复基因，且对回交群体辣椒育性鉴定准确度可以达到100％。

随着辣椒基因组参考序列数据库的公布，为开发辣椒恢复基因分子标记和图位克隆辣椒恢复基因提供了便利。尽管已经有如此多的分子标记被公开，但是目前尚未发现与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记。

技术实现要素：

本发明提供的一种与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记、方法及应用，可以有效鉴定辣椒材料中的细胞质雄性不育恢复基因。

本发明的第一个目的是提供一种与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记的分子标记，所述分子标记为scd06-17，包括seqidno.1所示的核苷酸序列和seqidno.2所示的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供一种利用上述分子标记与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记的方法，包括以下步骤：

s1，提取待检测辣椒材料的基因组dna；

s2，pcr扩增：

a.反应体系：10μl体系，各组分物质的含量分别为:1μl基因组dna、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物、5μl2×taqmastermix、ddh2o补齐10μl，混匀；

其中，上游引物的序列如seqidno.3所示，下游引物的序列如seqidno.4所示；

b.扩增程序：

94℃预变性5min；94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸10min；最后4℃保存；

s3，电泳

聚丙烯酰胺电泳；

s4，银染和显影

电泳结束后，将凝胶片进行银染和显影，并进行观察；

s5，结果判定

若电泳图中可观察到342bp的条带，则说明该待测辣椒材料含有细胞质雄性不育恢复基因；若电泳图中不可观察到342bp的条带，只能观察到321bp的条带，则说明该待测辣椒材料不含有细胞质雄性不育恢复基因。

优选的，上述鉴定辣椒雄性不育恢复基因的方法，所述基因组dna的浓度为30ng/μl，上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/l。

本发明的第三个目的是提供一种上述与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记在辣椒细胞质雄性不育恢复材料的分子标记辅助选育中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种上述鉴定辣椒雄性不育恢复基因的方法在辣椒细胞质雄性不育恢复材料的分子标记辅助选育中的应用。

与现有技术相比，本发明提供一种与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记、鉴定方法及应用，具有以下有益效果：

本发明在现有研究基础上，进一步开发了与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记scd06-17，并在不同遗传背景的分离群体中验证了该分子标记scd06-17的有效性，鉴定成功率在90％以上，结果稳定可靠，且为共显性分子标记，实现了在辣椒苗期对辣椒材料是否含有细胞质雄性不育恢复基因进行鉴定，提高育种效率，加速育种进程。相比较国内外已公布的其它辣椒恢复基因分子标记，该分子标记作为ssr共显性分子标记，可以同时检测杂交后代的三种基因型，揭示显隐性关系，不需要进行酶切环节，直接利用pcr进行大规模批量检测，在辣椒三系杂交制种和恢复材料分子标记辅助选择育种上更加快速和便利，因此具有重要意义。这为利用分子标记辅助选择转育辣椒恢复基因，为辣椒三系杂交制种奠定基础。

附图说明

图1为32个辣椒材料的电泳结果；

图2为32个辣椒细胞质雄性不育恢复基因的遗传分离群体的电泳结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供的一种与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记的分子标记，所述分子标记为scd06-17，包括seqidno.1所示的核苷酸序列和seqidno.2所示的核苷酸序列。

所述分子标记scd06-17是由seqidno.3所示的上游引物(scd06-17f)序列和seqidno.4所示的下游引物(scd06-17r)序列扩增的到的，其中在含有细胞质雄性不育恢复基因的辣椒材料中可扩增的到一条342bp的特异性片段，而在不含细胞质雄性不育恢复基因的辣椒材料无法扩增到。

上述分子标记scd06-17的获得方法：

首先，对目前应用比较广泛、准确度较高的辣椒恢复基因分子标记在获得其序列后，对辣椒参考基因组数据库进行blast检索发现，这些标记都位于辣椒的第六号染色体上，随后合成了已公布的辣椒chr06染色体遗传图谱上的引物(https://vegmarks.nivot.affrc.go.jp/)，鉴定与辣椒cms恢复基因连锁的分子标记；并构建了由384株组成的三系杂交种新科8号f2群体。田间表型鉴定发现，384株f2后代中，雄性不育株93株，可育株291株，卡方检验发现可育对不育的比例符合3:1的孟德尔遗传规律，说明辣椒雄性不育恢复基因为一对显性基因控制。在辣椒恢复基因初步定位的基础上，利用辣椒品种遵辣2号的参考基因组序列开发更多的ssr分子标记用于辣椒恢复基因的定位。结果发现ssr引物scd06-17f/scd06-17r与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁，可以用于辣椒恢复材料的分子标记鉴定和选择。

由于该分子标记scd06-17为共显性分子标记，可以提取植株少量dna后直接进行pcr扩增，再对pcr产物进行page胶检测，不但操作方便、实验成本低，而且还能得到辣椒单株准确的基因型，进而有效地加快辣椒恢复系的筛选进程。

下面提供一种利用上述分子标记scd06-17鉴定待测辣椒材料是否含有细胞质雄性不育恢复基因的方法，包括以下步骤：

s1，采用ctab法提取待检测辣椒材料的基因组dna。

s2，pcr扩增：

a.反应体系：10μl体系，各组分物质的含量分别为:1μl基因组dna、0.5μl上游引物(scd06-17f)、0.5μl下游引物(scd06-17r)、5μl2×taqmastermix、ddh2o补齐10μl，混匀；

其中，上游引物(scd06-17f)的序列如seqidno.3所示，下游引物(scd06-17r)的序列如seqidno.4所示；

其中基因组dna是待检测辣椒材料的基因组dna，浓度为30ng/μl，上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/l。

b.扩增程序：

94℃预变性5min；94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸10min；最后4℃保存；

s3.电泳

用小垂直板进行聚丙烯酰胺(page胶)电泳，胶浓度9％，2-10v/cm电压，电泳1h；

s4.银染和显影

电泳结束后，将凝胶片进行银染和显影，并进行观察，具体为：

电泳结束后，将两块玻璃板剥开，将凝胶片置于到1000ml固定液中(纯酒精100ml+900ml蒸馏水+5ml冰乙酸)并在摇床上轻轻晃动10min。固定结束之后，迅速将凝胶放入1000ml银染液(1000ml蒸馏水+2g硝酸银)中于摇床上染色10min。染色结束之后，将凝胶置于1000ml显影液中(3ml的甲醛+9g的naoh+1000ml蒸馏水)，放于摇床上轻轻摇晃，直至条带清晰。倒掉显影液，用蒸馏水小心将凝胶水洗2-3次即可；

在观片灯下读带，将读带结果输入电脑保存，并对胶片拍照保存；

s5，结果判定

若电泳图中可观察到342bp的条带，则说明该待测辣椒材料含有细胞质雄性不育恢复基因；若电泳图中不可观察到342bp的条带，只能观察到321bp的条带，则说明该待测辣椒材料不含有细胞质雄性不育恢复基因。

我们利用本发明所述的分子标记scd06-17和相应的上、下游引物scd06-17f/r鉴定32个辣椒材料是否含有细胞质雄性不育恢复基因，pcr产物的电泳图如图1所示，图1中m泳道为marker，其他泳道均为辣椒材料，其中，1、3、5、15、16、17、18、20、21、22、25、26、27、31号样品均可检测到342bp的条带，其含有细胞质雄性不育恢复基因；而其余样品检测不到342bp的条带，只能检测到321bp的条带，其不含有细胞质雄性不育恢复基因。

另外，我们利用本发明所述的分子标记scd06-17和相应的上、下游引物scd06-17f/r对32个辣椒细胞质雄性不育恢复基因的遗传分离群体进行检测，结果如图2所示，图2中m泳道为marker，其他泳道均为辣椒材料，17、19、23、24样品检测到321bp的条带，18、25、29、30检测到342bp的条带，其余样品同时检测到321bp和342bp两个条带，表明scd06-17作为一个共显性分子标记，与细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁。

需要说明的是，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<120>与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记、方法及应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>321

<212>dna

<213>辣椒

<400>1

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<210>2

<211>342

<212>dna

<213>辣椒

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<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tcaacacaagcagaatcacaac22

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

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