专利名称：利用愈伤组织诱导培育转基因辣椒的方法
技术领域：
本发明涉及一种培育转基因辣椒植物的方法，特别是一种利用愈伤组织诱导来大规模生产转基因辣椒植物的方法，该方法的特征在于以下步骤预培养辣椒外植体；将该预培养的辣椒外植体与引入了靶基因的土壤杆菌(Agrobacterium)共同培养；选择愈伤组织；以及形成幼芽。
背景技术：
辣椒是世界上的主要农作物之一，广泛的用作食品或调味品。同时，辣椒还用在工业染料中，特别是用作化妆品唇膏的一种主要原料。在韩国，辣椒产品的年总销售额大约在两万亿韩元并形成了韩国最大的种子市场。辣椒是在利用生物技术能够创造高附加值方面最适合的农作物。
在生物技术方面利用辣椒的第一种方式是进行转化。然而，众所周知，辣椒作为一种农作物由于以下两个原因很难被转化。第一，转基因辣椒植物再生成功的可能性根据种系不同而有很大差异(Christopher，Tet al.，Plant Cell Tiss.Org.Cult.，46245，1996；Kim，JY et al.，J.PlantBiotechnol.，4129，2002)。由于高转化率只能通过具有高再生率的种系获得，因而低再生率的种系很难进行转化。第二，土壤杆菌的感染率根据农作物的不同而不同。据推断，对于难以进行转化的农作物来说，土壤杆菌的菌毛不能透过外植体的组织细胞或不能充分地接种到组织细胞上。
世界上成功进行辣椒转化的例子仍然很少。利用土壤杆菌转化辣椒植物的方法首先在美国被报道(美国专利No.5,262,316)，韩国的Sung-Han Son等人也有所研究(韩国专利注册号No.344573)。然而，这些方法的缺点在于，它们的转化率非常低，不可再生而且很难大规模生产转基因辣椒植物。
发明公开内容在我们对大规模高效率生产转基因辣椒植物的广泛研究过程中，本发明者们发现，当辣椒外植体通过在愈伤组织诱导培养基中预培养，然后与土壤杆菌共同培养而进行再生时，可以很容易获得转基因辣椒，从而完成本发明。
因此，本发明的主要目标是提供一种大规模生产转基因辣椒植物的方法，该方法的特征在于在愈伤组织诱导培养基中预培养辣椒外植体，接着与土壤杆菌共同培养。
为了完成上述目标，本发明提供了一种大规模生产转基因辣椒植物的方法，该方法包括步骤(a)在愈伤组织诱导培养基中预培养辣椒外植体；(b)将所述预培养的外植体与引入了靶基因的土壤杆菌共同培养；(c)在选择培养基中培养所述共同培养的外植体以便形成愈伤组织并选择所形成的愈伤组织；以及(d)切取所述愈伤组织并在幼芽诱导培养基中培养所切取的愈伤组织以形成幼芽。
这里所用到的术语“外植体”指的是从植物上切下的组织片断，包括子叶或胚轴。
在下文中，将详细描述本发明。
本发明中的方法包括以下步骤(a)辣椒外植体的预培养；(b)转化(与引入了靶基因的土壤杆菌共同培养)，(c)愈伤组织选择；以及(d)形成幼芽。同时，本发明的方法还可以另外包括形成根系和适应土壤的步骤。特别地，本发明的方法的特征在于所述辣椒外植体在愈伤组织诱导培养基中预培养和转化从而人工形成愈伤组织，并且由所形成的愈伤组织诱导植物的再生。现在将详细地描述本发明方法的每一个步骤。
(a)用于愈伤组织诱导的外植体的预培养在本发明方法中，辣椒的外植体首先在愈伤组织诱导培养基中预培养。此时，优选损伤该外植体以便促进愈伤组织诱导。此外，子叶或胚轴可以作为辣椒外植体用在本发明中。优选使用通过灭菌和洗涤辣椒种子并使洗涤的种子在MS培养基中发芽从而获得的子叶。
本发明方法的预培养步骤中所用的愈伤组织诱导培养基指的是一种含有能够诱导愈伤组织的植物激素的植物培养基(例如，MS培养基和1/2的MS培养基)。可用于愈伤组织诱导的植物激素可以从玉米素、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、吲哚-3-乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)和苄氨基嘌呤(BA)构成的组中选择一种。
每种植物激素可以按下列浓度添加0.01-5mg/l的2，4-D，0.01-5mg/l的IAA，0.01-5mg/l的玉米素，0.01-5mg/l的NAA和0.01-5mg/l的BA。最优选地，可使用1mg/l的2，4-D或1mg/l的IAA。也可以使用上述激素的混合物。优选地，可以使用0.01-2mg/l的玉米素与选自0.1-5mg/l的2，4-D、0.1-5mg/l的IAA、和0.01-2mg/l的NAA的组中之一的混合物。预培养步骤优选在22-28℃下进行20-60小时。在预培养步骤过程中，愈伤组织通过激素的影响而在外植体的损伤部分被诱导。
(b)转化(与引入了靶基因的土壤杆菌共同培养)为了转化在愈伤组织诱导培养基中预培养后的所述外植体，将该预培养的外植体与土壤杆菌共同培养。在共同培养之前，需要将要被引入辣椒植物的靶基因引入土壤杆菌中。士壤杆菌的转化可以通过本领域所知的任何方法进行。例如可以使用冻融法(Glevin et al.，Plant molecularbiology.Kluwer Academic Publishers A3/7，1988)。之后，将引入了靶基因的土壤杆菌接种到预培养的辣椒外植体中10-20分钟，然后进行共同培养。这时，优选使用如步骤(a)中所使用的愈伤组织诱导培养基一样的培养基作为共同培养基。此外，共同培养步骤优选在22-28℃下进行40-80小时。
(c)愈伤组织选择将与土壤杆菌共同培养后的辣椒外植体在选择培养基下培养以选择转基因的愈伤组织。所述选择培养基优选不仅包含用于选择转基因愈伤组织的抗生素，还包含用于诱导愈伤组织发育的玉米素和IAA。作为IAA的替换物，也可以使用NAA。而且，用于选择愈伤组织的抗生素优选是一种与引入土壤杆菌的重组载体中所存在的抗生素抗性基因相对应的抗生素。同样，玉米素优选使用浓度为0.1-5mg/l，IAA和NAA分别优选使用浓度为0.01-1mg/l。更为优选地，可使用2mg/l的玉米素和0.3mg/l的IAA的混合物。在与土壤杆菌共同培养的外植体被转移至所述选择性培养基4-5周后，愈伤组织开始生长。然后，优选将该愈伤组织再培养5-8周。
(d)形成幼芽将步骤(c)中获得的转化愈伤组织切成小片。将该切片的愈伤组织片转移到幼芽诱导培养基中以诱导幼芽形成。所述幼芽诱导培养基优选包括单独的玉米素或玉米素与IAA和NAA之一的混合物。玉米素优选的使用浓度为0.5-10mg/l，IAA和NAA分别优选的使用浓度为0.01-0.2mg/l。更为优选地，可使用2mg/l的玉米素和0.01mg/l的IAA的混合物。在愈伤组织转移至幼芽诱导培养基一个月之后，形成了幼芽。然后，优选将该幼芽在相同的培养基中再培养大约两个月，以使幼芽伸长。
(e)根系形成和土壤适应将伸长的幼芽转移到根系诱导培养基中进行培养。所述根系诱导培养基优选不包含植物激素。优选地，可用含有少量抗生素的MS基础培养基作为根系诱导培养基。转移到根系诱导培养基大约4-5周后，形成了根系。当根系长到大约4-10cm时，彻底去除培养基并将根系种植在盆中。
本发明用于转化辣椒植物的方法具有以下优点。
第一，根据现有土壤杆菌介导的转化方法，从辣椒外植体直接诱导幼芽很少或不能进行转化，而本发明的方法表现出非常高的转化率。
第二，本发明方法不限于辣椒植物的特定种系(种系非特异性)。因而，本发明的方法能够稳定地转化各种辣椒植物种系第三，与现有技术的方法相比，本发明的方法能够在较短时间内大规模生产转基因植物，因为在预培养外植体步骤中添加了愈伤组织诱导激素以便缩短愈伤组织诱导时间。
因此，各种有用的基因，例如与植物防御机制相关的基因或与有用的代谢物的生物合成相关的基因，都可以通过本发明的转化方法引入到辣椒植物中，从而能够高效率大规模地生产各种功能性转基因辣椒植物。
可用于本发明的与植物防御机制相关的基因的例子优选为，编码选自以下组的蛋白质的基因核糖体失活蛋白(RIP)，茉莉酸羧甲基转移酶，海藻糖合成酶，植物防御素1.2，硫堇合成酶，葡聚糖酶，几丁质酶，苯丙氨酸解氨酶，查尔酮合酶，谷胱苷肽巯基转移酶，邻氨基苯甲酸合成酶，储存蛋白，钙调蛋白，色氨酸合成酶，蛋白酶抑制素II，氮氧化物合成酶，半胱胺(cystemine)，脂肪酸过氧化酶，丙二烯氧化合酶，辣椒-PMMV相互作用1转录因子(PPI1)，WRKY域转录因子，病原体响应蛋白和病毒外壳蛋白，但不仅限于此。编码病毒外壳蛋白的基因实例包括TMV-CP，CMV-CP和PepMoV-CP基因。
此外，与有用代谢物的生物合成相关的基因优选选自与生物合成以下物质相关的基因的群组丹宁酸，芥子酸胆碱，皂苷，蒜素，酸枣黄酮碳甙，肉桂酸，类黄酮，萜类，儿茶素，维生素，青霉素，吲哚，胰岛素，前列腺素，紫杉醇，泽泻醇，蓖麻毒蛋白，类胡萝卜素和蕃椒，但不仅限于此。
本发明的转化方法可以应用于所有的番椒(Capsicum)属辣椒，而且优选甜椒(Capsicum annuum L)。甜椒(Capsicum annuum L)的例子包括红辣椒(Capsicum annuum L.var.acuminatum)、甜椒或灯笼椒(Capsicum annuum L.var.grossum)，尖椒(Capsicum annuum L.var.conoides)，樱桃辣椒(Capsicum annuum L.var.cerasiforme)，朝天椒(Capsicum annuum L.var.fasciculatum)，长辣椒(Capsicum annuum L.var.longum)等等。
在本发明的一个实施例中，将辣椒的外植体在含有玉米素和NAA的混合物或玉米素和IAA的混合物的培养基中预培养，然后用引入了TMV-CP基因或PPI1基因的土壤杆菌(Agrobacterium)进行转化。之后，与辣椒再生过程中幼芽直接从转化外植体的损伤部分形成(直接形成幼芽)的通常情况不同，可以观察到在损伤部分中已经诱导出愈伤组织，然后幼芽在此处形成(间接形成幼芽；愈伤组织介导的幼芽形成)(见
图1和图2)。
测定上述两种情况的转化率，结果显示，在直接形成幼芽的情况下，直接幼芽形成的几率很高，但是从幼芽形成根系的几率很低而且没有一个幼芽进行了转化(见表1和表3)。另一方面，在通过愈伤组织介导间接形成幼芽的情况下，尽管从外植体的损伤部分诱导出愈伤组织的几率非常低，但是从诱导的愈伤组织形成幼芽和从幼芽形成根系的几率都很高(见表2)。此外，检测了从愈伤组织形成幼芽的转化率，结果显示，P915种系的辣椒转化率为0.19％，P409种系辣椒的为0.03％(3/37，500)(见表4)。通过这些结果，本发明者们发现，在从转化愈伤组织诱导形成幼芽的情况下，可获得辣椒的高转化效率。这是本发明首次发现的。
因此，本发明提供了由编码PPI1蛋白的基因转化的转基因辣椒植物，以及由编码TMV-CP的基因转化的TMV-抗性辣椒植物。
在本发明的另一个实施例中，为了更为有效地从辣椒外植体中诱导愈伤组织，将该辣椒外植体在含有一种或多种不同植物激素的培养基中进行预培养，然后与引入了GFP基因的土壤杆菌共同培养。这里，用2，4-D、IAA或者玉米素和2，4-D的混合物作为植物激素。之后，将转化外植体在选择性培养基中培养以选择转基因愈伤组织(见图3和图4)。将愈伤组织切成小片，之后转移到幼芽诱导培养基中以形成幼芽(见图5)。之后，从幼芽中诱导根系然后通过适当的步骤再生成为完整的植物(见图6)。
当辣椒外植体在含有2，4-D和玉米素混合物，2，4-D或IAA的培养基中进行预培养时，测定愈伤组织的诱导率。结果表明，尽管愈伤组织诱导率在辣椒种系之间会有微小的差异，但通常愈伤组织诱导率约为13％(见表6)。该愈伤组织诱导率比外植体在含有玉米素和NAA(或IAA)的培养基中培养情况下的约高10倍。而且，根据用于转化的外植体总数，从愈伤组织形成幼芽的转化率大约为1％(见图7)。这个值比外植体在含有玉米素和NAA(或IAA)的培养基中培养情况下愈伤组织介导的幼芽转化率(0.19％)的约高5倍。而且，当外植体在含有2，4-D和玉米素，2，4-D或IAA的混合物的培养基中进行预培养时，发现测试的所有8个种系的辣椒都稳定地进行了转化(见表6和图7到图9)。上面所描述的本发明的方法通过在愈伤组织诱导培养基中预培养辣椒外植体，可以使转化时间比现有技术方法有所缩短。
附图简述
图1是表示直接形成幼芽的再生过程各步骤图。虚线表示切下用于后续步骤中培养的部分(A直接形成幼芽；B多个幼芽形成；C多个幼芽伸长；D一个幼芽从多个幼芽中伸长；以及E根系形成)。
图2是表示通过愈伤组织介导间接形成幼芽的再生过程各步骤图。虚线表示切下用于后续步骤中培养的部分(A愈伤组织形成；B愈伤组织发育；C幼芽形成；D单个幼芽伸长；E根系形成)。
图3是表示根据本发明在选择性培养基中生长两周的愈伤组织(箭头所表示)的图片。
图4表示了通过本发明的方法转化的愈伤组织在其生长过程中连续表达GFP的状态。
图5表示了通过本发明的方法转化的愈伤组织形成幼芽的过程。
图6表示了根据本发明的转基因辣椒植物外观，其在根系形成后种植于盆中一个月。
图7表示了从表达GFP(泳道1-9)的愈伤组织和不表达GFP(泳道10-15)的愈伤组织中提取的基因组DNA的PCR扩增的结果，(+GFP克隆；M分子量标记)。
图8表示了从表达GFP的愈伤组织再生的幼苗植物叶片中提取的基因组DNA的PCR扩增结果(+GFP克隆；M分子量标记；泳道1-9P410种系；泳道10-15P915种系；泳道16-21P318种系；泳道22-28P319种系；以及-非转基因植物)。
图9表示了本发明方法制备的转基因辣椒植物中所获得的基因组DNA的Southern印迹分析结果(泳道1-2P915种系；泳道3-6P318种系；泳道7-14P319种系；泳道15非转基因植物)。
发明详述下面将通过实施例对本发明进行进一步详细的描述。然而对于本领域的技术人员来说显然本发明并不限于或受限于这些实施例。
实施例1培育TMV-CP基因或PPI1基因转化的辣椒植物1-1外植体的制备和预培养实验中使用四种近交系(P915，P409，P410和P101)的红辣椒种子(Nongwoo Bio Co.，Korea)。种子表面用95％的酒精消毒30秒，然后用50％的漂白剂处理10分钟。之后，用无菌水清洗种子3次。将该消毒后的种子转移到1/2MS培养基中(1/2MS，1.5％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.8)，并在25℃的光照条件下生长。将子叶和胚轴从8-10天的植物上切下用作外植体。用刀损伤大约190,000株外植体，之后将其转移到预培养基中(含有2mg/l的玉米素和0.05mg/l的NAA或0.1mg/l的IAA的MS基础培养基)，并在22-28℃的光照条件下培养2-36小时。
1-2与土壤杆菌共同培养将编码TMV-CP基因(GenBank accession NoL35074；Park et al.，1997)或PPI1基因(GenBank accession NoAF430372；Lee et al.，2002)的DNA片段插入pCAMBIA2300载体(CAMBIA，Australia)中。将得到的重组载体引入到土壤杆菌LBA4404株系或EHA105株系中。将转化的土壤杆菌株系在含有50mg/l的卡那霉素，50mg/l的利福平和100μM乙酰丁香酮的YEP培养基中培养。离心培养液并在MS基础培养基中稀释到OD6000.3-0.5。将培养悬液与含有100μM乙酰丁香酮的MS基础培养基混合，并将混合物接种到上述实施例1-1中预培养的外植体中10-20分钟。之后，将该外植体与土壤杆菌株系在与上述实施例1-1中所使用预培养基具有相同成分的培养基中、在黑暗条件下共同培养38-96小时。用含有500-800mg/l氨噻肟头孢菌素或lilacilline的1/2MS液体培养基洗涤所述与土壤杆菌株系共同培养后的外植体3次。
1-3幼芽形成为了选择转基因植物，将上述实施例1-2中与土壤杆菌株系共同培养的外植体在含有2mg/l玉米素，0.05mg/l的NAA(或0.1mg/l的IAA)，80-100mg/l卡那霉素，300mg/l头孢噻肟(或0.1mg/l lilacilline)的MS基础培养基(选择性培养基)中培养6-8周。在培养的4-5周后，可以观察到类似于愈伤组织的组织在一些外植体的损伤部分周围形成。之后，为了诱导幼芽，将外植体转移到含有2mg/l玉米素，0.01mg/l NAA(或0.01mg/l IAA)，60-100mg/l卡那霉素和300mg/l头孢噻肟的MS基础培养基(伸长培养基)中培养7-10周。
1-4根系形成和土壤适应将伸长的幼芽转移到含有20-30mg/l卡那霉素和200mg/l头孢噻肟的MS基础培养基(根系诱导培养基)中培养6-8周。将再生的植物转移进轻便的盆中，在16hr光照的条件下以25℃培养2周。
在上述的实验中，可以确定外植体中形成了两种形式的幼芽。一种是普通形式，幼芽(或多个幼芽)直接从外植体的损伤部分形成(直接形成幼芽)，另一种形式是愈伤组织在外植体的损伤部分周围形成，之后，幼芽从愈伤组织处形成(间接形成幼芽；愈伤组织介导的幼芽形成)。
大多数情况下观察到的是直接形成幼芽的再生过程。如
图1所示，再生过程包括5个步骤幼芽形成，多幼芽形成，多幼芽伸长，单幼芽伸长和根系形成。另一方面，通过愈伤组织介导的间接形成幼芽的再生过程则很少观察到，据信这是由于愈伤组织不容易从子叶损伤部位自然诱导形成的原因。如图2所示，通过间接幼芽形成的再生过程包括5个步骤愈伤组织形成，愈伤组织发育，幼芽形成，单个幼芽伸长和根系形成。
实施例2幼芽形成几率的检测2-1直接形成幼芽的几率从四个株系的辣椒外植体中获得了总共151,700个外植体，将其通过与实施例1中相同的方式转化，之后检测从外植体损伤部分直接形成幼芽的几率。在幼芽诱导培养基上直接形成幼芽的几率是5.3％(8,089/151,700)(见表1)。然而，在根系诱导培养基上存活的幼芽的比率为17.4％(1,407/8,089)。表1和2中列出的每种植物株系的数值表示了使用各种激素的全部结果。
表1直接形成幼芽的几率
2-2通过愈伤组织介导的间接形成幼芽的几率从四个株系的辣椒植物中获得的外植体总共为37,500株，将其通过与上述实施例1中相同的方式转化，之后检测愈伤组织介导的幼芽形成几率。从外植体形成愈伤组织的几率处于非常低的水平，为1.2％(459/37,500)(见表2)。然而，从愈伤组织发育成幼芽的几率是11.6％(53/459)，并且从幼芽形成根系的几率为52.8％(28/53)。这些值大大高于通过直接形成幼芽在再生过程中形成幼芽和根系的比率。
表2愈伤组织发育和从愈伤组织形成幼芽的几率
上述结果表明，一旦在辣椒外植体的再生过程中形成愈伤组织，就能高效地形成幼芽和根系。
实施例3转化率测定从实施例1中的外植体损伤部分直接形成了总共1,407个幼芽，以及从愈伤组织间接形成了总共28个幼芽，将其通过PCR试验测定其转化率。
首先，根据Lee et al.，Plant Mol.Biol.，46661，2001中所描述的方法分离辣椒植物的基因组DNA。为了检测TMV-CP基因的插入，用SEQID NO1和SEQ ID NO2表示的引物进行PCR。此外，为了检测PPI1基因的插入，用SEQ ID NO3和SEQ ID NO4表示的引物进行PCR。PCR重复进行35个循环，每个循环包括在94℃下1分钟、在55℃下1分钟和在72℃下1分钟。
PCR试验结果表明，从外植体损伤部分直接形成的1,407个幼芽中没有插入TMV-CP基因或PPI1基因(见表3)。下表3和4中列出的转化率是PCR试验中呈阳性的幼芽数量除以使用的外植体数量所获得的值。
表3从外植体损伤组织直接形成幼芽的转化率
另一方面，愈伤组织间接形成幼芽的转化率的检测结果显示，P915系植物为0.19％(15/37,500)，P409系植物为0.03％(3/37,500)(见表4)。在PCR试验中呈阳性的幼芽数量与从愈伤组织形成的幼芽的数量的比例为34％(18/53)。
表4 从愈伤组织间接形成的幼芽的转化率
上述结果表明，如果幼芽从转化后的愈伤组织处形成，则辣椒植物的转化可能性大大提高。
实施例4转基因辣椒植物的TMV抗性测定为了检测上述实施例1中通过愈伤组织介导的间接形成幼芽过程引入了TMP-CP基因的转基因辣椒植物是否对TMV具有抗性，进行以下实验。将T0植物进行自交获得T1植物。两次(间隔两周)将408株单个的T1植物叶片接种上TMV。第二次接种后两周，用TMV-CP抗体(Shin，R.et al.，Mol.Plant Microbe.Interact.，15983，2002)进行ELISA.。结果表明408株T1植物个体中有28株个体能抵抗TMV感染(见表5)。易感植物的叶片中观察到了花叶病斑点，但抗性植物中没有观察到。
另外，将从植物叶片中分离的基因组DNA模版按照与实施例3中相同的方式进行PCR。PCR试验结果表明TMV-CP基因插入所有的28个抗性植物个体中(数据未示出)。
表5TMV抗性测定
实施例5制备GFP转化的辣椒植物5-1外植体的制备和预培养为了确定从辣椒外植体高水平地诱导愈伤组织的最佳条件，将该外植体在含有一种或多种各种植物激素的培养基中预培养。
首先，实验中使用了八种近交系(P915，P318，P319，P409，P410，P784，P2377和PMAL)的红辣椒种子(Nongwoo Bio Co.，Korea)。种子表面用95％的酒精消毒30秒，然后用50％的漂白剂(Yuhanrocks。YuhanCorp.，Korea)处理10分钟。然后，用无菌水清洗种子3次。将该消毒后的种子转移到1/2MS培养基中(1/2MS+1.5％蔗糖+0.8％琼脂，pH5.8)，然后在25℃的光照条件下生长。接着，将子叶从8-10天的植物上切下。用刀损伤该子叶，之后将其转移到含有一种或多种各种植物激素的愈伤组织诱导培养基中(含有1mg/l的2，4-D，1mg/l IAA或1mg/l的2，4-D和0.2mg/l的玉米素的MS基础培养基)并进行预培养。预培养在光照条件下的温控培育箱(22-28℃)中进行20-60小时。
5-2与土壤杆菌共同培养将GFP基因(GenBank accession NoAY508125；Haseloff et al.，PNAS，942122，1997)引入pCAMBIA2300载体中。将得到的重组载体引入到土壤杆菌LBA4404株系中。将转化的土壤杆菌株系在含有50mg/l的卡那霉素，50mg/l的利福平和100μM乙酰丁香酮的YEP培养基中培养。离心培养液并在MS基础培养基中稀释到OD6000.3-0.6。将培养悬液与含有100μM乙酰丁香酮的MS基础培养基混合，并将混合物接种到上述实施例5-1中预培养的子叶中20分钟。之后，将该子叶与土壤杆菌株系在与实施例5-1中所使用预培养基具有相同成分的培养基中、在黑暗条件下共同培养48-70小时。用含有500-800mg/l氨噻肟头孢菌素的1/2MS液体培养基洗涤所述与土壤杆菌株系共同培养后的子叶3次。
5-3愈伤组织选择为了选择转基因愈伤组织，将上述实施例5-2中与土壤杆菌株系共同培养的子叶转移到含有2mg/l玉米素，0.3mg/l的IAA，80mg/l卡那霉素，100mg/l头孢噻肟和300mg/l lilacilline)的MS基础培养基(选择性培养基)中，并在16-hr光照/6-hr黑暗周期条件的培养箱中培养4-5周。在该培养过程中，愈伤组织开始生长。图3是表示在转移到选择性培养基后生长了两周的愈伤组织图片。在UV显微镜下可以观察到按照培养时间不同的转基因愈伤组织生长形态，结果如图4中所示。如图4所示，可以肯定表达GFP的转基因愈伤组织在其生长过程中表现出连续的GFP表达，从而表明其在基因上是稳定的。
5-4根系形成和土壤适应将成熟愈伤组织切成小片，然后转移到含有2mg/l玉米素，0.01mg/lIAA，30-60mg/l卡那霉素和300mg/l头孢噻肟的MS基础培养基(幼芽诱导培养基)中并培养大约一个月。之后，将形成的幼芽再培养大约两个月以使所形成的幼芽伸长。从转化愈伤组织形成幼芽的过程如图5中所示。
5-5根系形成和土壤适应为了从幼芽中诱导根系，将幼芽在含有20-30mg/l卡那霉素和200mg/l头孢噻肟的MS基础培养基中培养。大约4-5周之后，从幼芽处形成了根系。当根系长到大约10cm时，彻底去除培养基并将剩余的根系种植到进轻便的盆中。将其在培养箱中培养数天，然后在温室中培养。将根系种植于轻便盆中之后一个月得到的转基因辣椒植物的外观如图6中所示。
实施例6通过PCR试验证实转基因植物从上述实施例5中获得的转基因植物当中，在UV下分别从表达GPF的愈伤组织和不表达GPV的愈伤组织提取基因组DNA。为了检测GFP基因的插入情况，用SEQ ID NO5和SEQ ID NO6表示的引物对所提取的DNA模板分别进行PCR。PCR重复进行35个循环，每个循环包括在60℃下1分钟、在94℃下1分钟和在72℃下1分钟。如图7中所示，PCR试验结果表明，对应于GFP基因的大约720bp大小条带只在表达GFP的愈伤组织中检测到。
另外，从表达GFP的愈伤组织中再生成的一些幼芽株系的叶片中提取了基因组DNA，然后按照上面所述的相同方式进行PCR。如图8中所示，PCR试验结果表明GFP基因被稳定地引入了所有P410、P915、P318和P319品系。这表明根据本发明的转化方法是非品系特异性的。
实施例7测定引入转基因植物中GFP基因的复制数量从上面实施例5中获得的转基因辣椒植物(T0)的14个个体中提取基因组DNA，然后进行Southern印记分析，从而测定插入转基因植物中的GFP基因复制数量。
用BamHI和XbaI酶切各个基因组DNA30μg，然后在0.8％的琼脂糖凝胶中20V下电泳20小时。接着，将DNA转移到硝酸纤维素膜上，并与32P-dCTP标记的GFP基因混合，在65℃下杂交16小时。如图9所示，分析结果表明，14个个体当中有4个个体的基因组中存在两个GFP基因，剩余个体中存在一个。而且，转基因植物的条带位置彼此不同，从而表明转基因植物的愈伤组织来源彼此不同。
实施例8转化率测定8-1检测愈伤组织诱导率尝试以与实施例5中相同的方式对8个品系的辣椒植物中的愈伤组织进行诱导。结果表明愈伤组织在所有品系中的平均诱导率为13％，不过辣椒植物品系之间的愈伤组织诱导率不同。特别是，用2，4-D或IAA单独处理的情况下表现出比用2，4-D和玉米素的混合物处理的情况更高的愈伤组织诱导率。此外，实施例5的愈伤组织诱导率比实施例1的约高10倍(1.2％；见表2)。
此外，根据转化中使用的总外植体数在UV下表达GFP的愈伤组织比率为4.7％，而根据从外植体诱发的总愈伤组织数来说则为36.1％(233/645)(见表6)。这再次表明一旦愈伤组织从外植体中诱发，则转化率大大提高。表中列出的每种品系的数值表示预培养中使用的各种激素的全部结果。
表6根据愈伤组织诱导率和GFP表达的转化率
8-2检测来自愈伤组织的幼芽形成率和转化率在同土壤杆菌共同培养大约5个月之后，测定从外植体诱导的愈伤组织形成幼芽的几率，结果表明幼芽形成几率大约为37.7％(见表7)。在愈伤组织形成的幼芽上进行PCR试验以测定GFP基因的诱导率。PCR测定结果表明，在有愈伤组织形成的幼芽当中具有GFP基因插入的幼芽比率为45％(表7)。在转化所用的外植体总数基础上测得具有GFP基因的幼芽转化率为大约1％(27/2792)。这个值比实施例1中的约高(0.19％)5倍(见表4)。
表7来自愈伤组织的幼芽形成率和转化率
工业实用性如上所述，本发明中，辣椒外植体在愈伤组织诱导培养基中预培养，然后进行转化以人工形成愈伤组织，并从该愈伤组织诱导再生植物体。本发明的方法表现出非常高的转化率，并且可以以非品系特异性的方式转化辣椒植物。而且，本发明的方法可以高效率地大规模生产各种转基因辣椒植物，因为用于制备转基因辣椒植物的时间比现有技术方法得以缩短。
序列表FP06KR158.ST25SEQUENCE LISTING<110>株式会社农友生物(NONGWOOBIO)<120>利用愈伤组织诱导培育转基因辣椒的方法(METHOD FOR PREPARINGTRANSGENIC PEPPER USING CALLUS INDUCTION)<130>FP06KR158<150>KR 10-2004-0016722<151>2004-03-12<150>PCT/KR2004/001686<151>2004-07-09<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>forward primer for PCR<400>1atgacgcaca atcccactat 20<210>2<211>18<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>reverse primer for PCR<400>2cgaacccctg aaaataat18<210>3<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>forward primer for PCR<400>3atgacgcaca atcccactat 20
FP06KR158.ST25<210>4<211>17<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>reverse primer for PCR<400>4gtaccacttg aagaagc 17<210>5<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>forward primer for PCR<400>5atgacgcaca atcccactat20<210>6<211>23<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>reverse primer for PCR<400>6catgtggtct ctcttttcgt tgg2权利要求
1.一种制备转基因辣椒植物的方法，该方法包括步骤(a)在愈伤组织诱导培养基中预培养辣椒外植体；(b)将所述预培养的外植体与引入了靶基因的土壤杆菌共同培养；(c)在选择培养基中培养所述共同培养的外植体以便形成愈伤组织并选择所形成的愈伤组织；以及(d)切取所述愈伤组织并在幼芽诱导培养基中培养所切取的愈伤组织以形成幼芽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使步骤(a)的外植体损伤以促进愈伤组织诱导。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(a)的外植体为子叶或胚轴。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(a)的愈伤组织诱导培养基包括一种或多种选自玉米素、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、吲哚-3-乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)和苄氨基嘌呤(BA)所构成的组。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(a)的愈伤组织诱导培养基包括一种或多种选自0.01-5mg/l的2，4-D，0.01-5mg/l的IAA，0.01-5mg/l的NAA和0.01-5mg/l的BA所构成的组。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于其中所述培养基包括1mg/l的2，4-D或1mg/l的IAA。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于其中所述培养基包括0.01-2mg/l的玉米素与选自0.1-5mg/l的2，4-D、0.1-5mg/l的IAA、和0.01-2mg/l的NAA的组中之一的混合物。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(b)中的共同培养在与步骤(a)中使用的愈伤组织诱导培养基相同的培养基中进行。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(c)中的选择培养基包括0.1-5mg/l的玉米素和0.01-1mg/l的IAA的混合物或.0.1-5mg/l的玉米素和0.01-1mg/l的NAA的混合物。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(d)中的幼芽诱导培养基包括选自以下组的构成之一(i)0.5-10mg/l的玉米素；(ii)0.5-10mg/l玉米素和0.01-0.2mg/l IAA的混合物；以及(iii)0.5-10mg/l玉米素和0.01-0.2mg/l NAA的混合物。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(d)之后进一步包括以下步骤(e)(e)将所述幼芽转移到根系形成培养基中，然后培养所转移的幼芽以形成根系。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述靶基因是植物防御机制相关的基因或与有用代谢物的生物合成相关的基因。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于其中与植物防御机制相关的基因是编码选自以下组的蛋白质的基因核糖体失活蛋白(RIP)，茉莉酸羧甲基转移酶，海藻糖合成酶，植物防御素1.2，硫堇合成酶，葡聚糖酶，几丁质酶，苯丙氨酸解氨酶，查尔酮合酶，谷胱苷肽巯基转移酶，邻氨基苯甲酸合成酶，储存蛋白，钙调蛋白，色氨酸合成酶，蛋白酶抑制素II，氮氧化物合成酶，半胱胺(cystemine)，脂肪酸过氧化酶，丙二烯氧化合酶，辣椒-PMMV相互作用1转录因子(PPI1)，WRKY域转录因子，病原体响应蛋白和病毒外壳蛋白。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于其中编码病毒外壳蛋白的基因选自TMV-CP，CMV-CP和PepMoV-CP基因所构成的组。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于其中与有用代谢物的生物合成相关的基因选自与生物合成以下物质相关的基因的群组丹宁酸，芥子酸胆碱，皂苷，蒜素，酸枣黄酮碳甙，肉桂酸，类黄酮，萜类，儿茶素，维生素，青霉素，吲哚，胰岛素，前列腺素，紫杉醇，泽泻醇，蓖麻毒蛋白，类胡萝卜素和蕃椒油。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述辣椒为番椒(Capsicum)属辣椒。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于其中所述番椒(Capsicum)属辣椒为甜椒(Capsicum annuum L)。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于其中所述甜椒(Capsicum annuum L)选自以下组红辣椒(Capsicum annuum L.var.acuminatum)、甜椒或灯笼椒(Capsicum annuum L.var.grossum)，尖椒(Capsicum annuum L.var.conoides)，樱桃辣椒(Capsicum annuum L.var.cerasiforme)，朝天椒(Capsicum annuum L.var.fasciculatum)，长辣椒(Capsicum annuum L.var.longum)
19.一种编码PPI1蛋白的基因转化的辣椒，其特征在于其通过权利要求13的方法制备而成。
20.一种编码TMV-CP的基因转化的TMV抗性辣椒，其特征在于其通过权利要求14的方法制备而成。
全文摘要
本发明涉及一种制备转基因辣椒植物的方法，特别是一种利用愈伤组织诱导来大规模生产转基因辣椒植物的方法。本发明的方法表现出了高转化率，并且可以以非品系特异性的方式生产转基因辣椒植物。而且，因为用于制备转基因辣椒植物的时间比现有技术方法得以缩短，本发明的方法可以高效率地大规模生产各种品系的转基因辣椒植物。
文档编号A01H4/00GK1925740SQ200480042428
公开日2007年3月7日 申请日期2004年7月9日 优先权日2004年3月12日
发明者韩智学, 李允姬, 金主渊, 金孝淳, 郑珉, 崔淳浩, 梁承均 申请人:株式会社农友生物