一种复合凝胶的制备方法及其在诱导干细胞成软骨分化中的应用与流程

本发明涉及医学和生物医学工程领域，具体地涉及京尼平-胶原-碳点复合凝胶的制备方法及其在诱导干细胞向软骨分化中的应用。

背景技术：

关节软骨缺损一直是骨科临床的治疗难题，主要是因为关节软骨没有供血，且软骨细胞埋于稠厚的细胞外基质中，无法移动到损伤部位参与修复。传统的治疗方法如关节内清理和灌洗术等难以获得满意的临床效果。

组织工程技术通过种子细胞符合支架材料构建组织工程化软骨，植入到缺损部位而实现治疗目的。近年来，随着纳米技术的兴起，其结合组织工程技术相结合应用于再生医学领域正在形成一个崭新的研究方向。

碳点(cdots)是一种荧光纳米材料，具有光致发光特性、优良的光学稳定性及无毒性。在激光作用下，碳点能产生一定量的ros，其中低浓度的ros可以激活转录因子并促进细胞增殖、分化；而中、高浓度的ros通过细胞应激反应诱导细胞凋亡甚至导致细胞坏死。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明的目的之一在于提供一种京尼平-胶原-碳点复合凝胶的制备方法，方便用药。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种复合凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)胶原的制备，采用浓度为0.4-0.6m醋酸作为溶剂加入一定量的无菌牛皮胶原冻干片制备浓度为10-20mg/ml的无菌牛皮胶原冻干品-醋酸溶液，待无菌牛皮胶原冻干品充分溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；

(2)京尼平原液的制备，取一定量的京尼平完全溶于无水乙醇中，并加入pbs定容，制备浓度为60-200mg/ml的京尼平原液

(3)复合凝胶的制备，取一定体积由步骤(1)制备的胶原并加入一定体积的由步骤(2)制备的京尼平原液和碳点，制备浓度分别为0.4-2vol％的京尼平和碳点的混合液，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平-胶原-碳点复合凝胶。

上述技术方案的有益效果在于：采用京尼平和胶原联合制作复合有碳点的生物材料，方便碳点作为外用药物，而且经过京尼平交联后的胶原负载碳量子点后其ros释放比单纯的碳量子点与胶原混合后的量降低，说明经过京尼平交联之后，碳点的ros释放受到限制，减少过多的ros产生对细胞或机体产生毒性，而是控制碳点释放的ros处于低量状态，发挥其对细胞增殖和分化的促进作用，并且保持碳点的作用的时效。

进一步的，上述技术方案中，具体的，包括如下步骤：

(1)胶原的制备，采用浓度为0.45-0.55m醋酸作为溶剂加入一定量的无菌牛皮胶原冻干片制备浓度为12-18mg/ml的无菌牛皮胶原冻干品-醋酸溶液，待无菌牛皮胶原冻干品充分溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；

(2)京尼平原液的制备，取一定量的京尼平完全溶于无水乙醇中，并加入pbs定容，制备浓度为100-160mg/ml的京尼平原液；

(3)复合凝胶的制备，取一定体积由步骤(1)制备的胶原并加入一定体积的由步骤(2)制备的京尼平原液和碳点，制备浓度分别为0.7-1.3vol％的京尼平和碳点的混合液，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平-胶原-碳点复合凝胶。

上述技术方案的有益效果在于：调整京尼平、胶原和碳点的配比进一步的提高其疗效。

更进一步的，上述技术方案中，具体的，包括如下步骤：

(1)胶原的制备，采用浓度为0.5m醋酸作为溶剂加入一定量的无菌牛皮胶原冻干片制备浓度为15mg/ml的无菌牛皮胶原冻干品-醋酸溶液，待无菌牛皮胶原冻干品充分溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；；

(2)京尼平原液的制备，取一定量的京尼平完全溶于无水乙醇中，并加入pbs定容，制备浓度为133mg/ml的京尼平原液；

(3)复合凝胶的制备，取一定体积由步骤(1)制备的胶原并加入一定体积的由步骤(2)制备的京尼平原液和碳点，制备浓度分别为1vol％的京尼平和碳点的混合液，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平-胶原-碳点复合凝胶。

上述技术方案的有益效果在于：进一步的调整京尼平、胶原和碳点的配比进一步的提高其疗效。

上述技术方案中所述步骤(2)中所述京尼平与无水乙醇的用量比为1mg京尼平对应1-3μl的无水乙醇。

上述技术方案的有益效果在于，使用乙醇将京尼平完全溶解。

本发明的目的之二在于提供一种如上所述方法制备的复合凝胶在诱导干细胞成软骨分化中的应用。

上述技术方案的有益效果在于：通过京尼平抑制碳点对ros的释放量并延长碳点释放ros的时效，确保ros长期处于一种低水平状态，从而长期发挥其对促进细胞增殖和分化的作用，达到诱导干细胞分化为软骨细胞。

附图说明

图1为用京尼平-胶原交联碳点后的红外图谱；

图2为京尼平-胶原-碳点复合凝胶的xrd图；

图3各组分材料及复合材料溶胀率；

图4各组分材料及复合材料降解率

图5各组分材料及复合材料荧光强度；

图6各组分材料及复合材料ros释放度；

图7各组分材料及复合材料储能模量的动态力学；

图8各组分材料及复合材料损耗模量的动态力学；

图9各组分材料软骨对acan因子表达；

图10各组分材料软骨对col2a1因子表达；

图11各组分材料软骨对sox9因子表达；

图12各组分材料软骨对col1a1因子表达；

图13各组分材料的gag含量。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

复合凝胶的制备，包括如下步骤：(1)胶原的制备，取15mg无菌牛皮胶原冻干品加入1ml浓度为0.5m的醋酸，经溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；(2)京尼平原液的制备，称取2mg京尼平溶解于2μl无水乙醇后加pbs定容至15μl；(3)复合凝胶的制备，取100μl由步骤(1)制备的胶原，然后加入步骤(2)制备的京尼平原液和碳点各1μl，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平-胶原-碳点复合凝胶a。

实施例2

复合凝胶的制备：包括如下步骤：(1)胶原的制备，取10mg无菌牛皮胶原冻干品加入1ml浓度为0.4m的醋酸，经溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；(2)京尼平原液的制备，称取2mg京尼平溶解于2μl无水乙醇后加pbs定容至15μl；(3)复合凝胶的制备，取120μl由步骤(1)制备的胶原，然后加入步骤(2)制备的京尼平原液和碳点各1.5μl，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平-胶原-碳点复合凝胶b。

实施例3

复合凝胶的制备：包括如下步骤：(1)胶原的制备，取20mg无菌牛皮胶原冻干品加入1ml浓度为0.6m的醋酸，经溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；(2)京尼平原液的制备，称取2mg京尼平溶解于6μl无水乙醇后加pbs定容至15μl；(3)复合凝胶的制备，取80μl由步骤(1)制备的胶原，然后加入步骤(2)制备的京尼平原液和碳点各0.5μl，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平-胶原-碳点复合凝胶c。

实施例4

复合凝胶的制备：包括如下步骤：(1)胶原的制备，取12mg无菌牛皮胶原冻干品加入1ml浓度为0.45m的醋酸，经溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；(2)京尼平原液的制备，称取2mg京尼平溶解于5μl无水乙醇后加pbs定容至15μl；(3)复合凝胶的制备，取110μl由步骤(1)制备的胶原，然后加入步骤(2)制备的京尼平原液和碳点各1.2μl，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平-胶原-碳点复合凝胶d。

实施例5

复合凝胶的制备：包括如下步骤：(1)胶原的制备，取18mg无菌牛皮胶原冻干品加入1ml浓度为0.55m的醋酸，经溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；(2)京尼平原液的制备，称取2mg京尼平溶解于3μl无水乙醇后加pbs定容至15μl；(3)复合凝胶的制备，取90μl由步骤(1)制备的胶原，然后加入步骤(2)制备的京尼平原液和碳点各0.8μl，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平-胶原-碳点复合凝胶e。

实施例6

复合凝胶的理化表征，如图1所示，为京尼平-胶原交联碳点后的红外图谱，3350cm^-1处的吸收峰位胶原中nh2的吸收峰，1631cm^-1处的吸收峰归属为酰胺键的c＝o的伸缩振动吸收峰，而且在2800cm^-1-3000cm^-1的吸收峰消失，这些特征峰的出现或变化说明京尼平分子成功连接到碳量子点表面，而且胶原进行交联后，体系中胶原占主要，红外光谱主要显现的是胶原的特征吸收。

如图2所示，为京尼平-胶原-碳点复合凝胶的xrd图，2θ为18.75o出现了弱的衍射峰，是碳量子点的衍射峰，2θ为31.6o出现了强而尖锐的衍射峰，为胶原的特征峰，说明交联之后，胶原占主要，其峰形更明显，跟红外光谱的结果是一致的。

实施例7

将实施例1所对应的bmscs包裹于京尼平-胶原-碳点混合物，置于37℃条件下15分钟形成负载细胞的凝胶，并分别设置相应的空白对照组即胶原组(h组)、胶原-京尼平组(hg组)、胶原-碳点组(hc组)和胶原-京尼平-碳点组(hgc组)，实验组即为胶原-京尼平-碳点-激光组(hgcl组)五组。

各组分材料及复合材料的溶胀率及降解率，如图3和图4所示，分别为胶原组(h组)、胶原-京尼平组(hg组)、胶原-碳点组(hc组)、胶原-京尼平-碳点组(hgc组)四组凝胶的溶胀和降解的性能进行评价，从溶胀率图线可以看出，交联后支架溶胀率较未交联组明显降低。而且交联组的降解率随着时间的推移逐渐增加，但与未交联组比较均有显著的差异。

各组分材料及复合材料荧光及ros释放度

如图5和6所示，对交联前后的材料进行ros测定，可以发现经过京尼平交联后的胶原负载碳量子点后其ros释放比单纯的碳量子点与胶原混合后的量降低，说明经过京尼平交联之后，材料的ros释放受到限制，减少过多的ros产生对细胞或机体产生毒性。进一步通过dpbf来检测ros的消耗量也能说明ros的产生情况。

各组分材料及复合材料的动态力学

如图7和8所示，为各组分材料及复合材料动态力学，同时对材料的进行检测，储能模量反映材料弹性大小，动态力学检测发现hgc组的储能模量最高，说明纳米材料与胶原交联后能够显著提高胶原力学强度。损耗模量反映材料粘性大小，其中hgc的损耗模量最大，说明交联后材料粘性增加。

pcr检测各组分材料软骨相关因子表达

京尼平-胶原-碳点复合凝胶诱导bmscs成软骨分化的作用

胶原组(h组)、胶原-京尼平组(hg组)、胶原-碳点组(hc组)、胶原-京尼平-碳点组(hgc组)、胶原-京尼平-碳点-激光组(hgcl组)，分别培养7、14、21天后，其中，hgcl组隔天用808nm激光照射(光密度为1j/cm²，3min)一次，分别检测上述五组实验的软骨特异性基因sox9、acan、col2a1、软骨分化型基因col1a1及软骨细胞外基质相关蛋白gag的表达情况，评价京尼平-胶原-碳点复合凝胶诱导bmscs成软骨分化的作用。如图9-13所示，结果表明京尼平-胶原-碳点复合凝胶配合激光极大促进gag合成及软骨特异性基因sox9、acan和col2a1的表达，而相对抑制软骨分化型基因col1a1，说明京尼平-胶原-碳点复合凝胶在激光作用下具有促进bmscs成软骨分化的作用，是治疗临床关节软骨缺损的一种非常有潜质的生物材料。

pcr结果显示各组的基因表达水平。随着时间的延长，各个材料对acan、col2a1、sox9基因的表达量具有增强效果，其中京尼平交联后的胶原负载碳量子点对基因表达量的增强效果最为显著。但是经过激光照射后，促使复合材料释放较多的ros，其相应的基因含量明显提高，说明一定量的ros可以促进软骨细胞分化。而col1a1的表达量随着时间的推移逐渐降低，交联后的材料经激光照射后col1a1的表达量降低更为明显，说明复合之后的材料对骨髓间充质干细胞(bmscs)有成软骨诱导效果，而通过激光作用后产生少量的ros使诱导效果更为明显。

各组分材料的gag含量

gag的含量代表成软骨分化能力。图中可以看出随着时间的推移，各组材料对蛋白多糖分泌量具有一定增强的效果。但激光照射后，京尼平交联后的胶原负载碳量子点组材料的gag分泌量显著提高，与图9-12的结果一致，进一步说明激光作用碳量子点产生少量的ros使诱导效果更为明显。

通过对实施例2-实施5所对应的复合凝胶分别进行如实施例7对应的操作，结果均证实通过激光照射后，碳点能释放少量的ros以发挥其诱导作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。