植物抗干旱蛋白GmNARK及编码基因和应用的制作方法

本发明属于生物工程领域，具体涉及植物抗干旱蛋白gmnark及编码基因和应用。

背景技术：

在作物种植及繁育过程中，非生物胁迫给我国农业带来的危害非常严重，其中干旱与土壤盐碱化是限制我国农业可持续性发展的主要因素。我国可耕农地的50％受干旱影响，即使在降水较多的华中和华南地区，由于雨量分布不均，这些地区的水稻几乎每年在扬花的关键时期都受干旱的影响，直接影响产量，情节严重时甚至颗粒无收。我国北方大部分地区的降雨量偏低，加重土壤的盐碱化，严重影响农业生产，使作物减产，造成很大的经济损失。干旱对于农作物的影响已成为全球关注的问题，而且随着气候的不断的恶化，这一问题变得日益严重。提高植株的自我抗干旱对产量和品质十分的重要。培育抗干旱品种是抵御干旱、保证产量的有效途径。

目前植物遗传转化研究已取得一些进展，因此可以通过转基因方法提高小麦的抗干旱性。转基因是植物在胁迫条件下通过分子手段来控制其蛋白成分的重要手段。这种方法具有选育速度快，易于获得抗性植株，且具有较好的遗传稳定性等优点，已成为获得抗性植株的主要手段。但是到目前为止，获得的植物抗干旱基因还是太少，还不能满足改良植株产量和品质分子设计的需要。所以植物抗干旱基因工程在农业生产和商业上的应用受到很大限制；因此，获得高效、广谱的抗干旱基因，并分析其对植物抗干旱能力的影响是植物抗干旱基因工程的研究重点。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种植物抗干旱蛋白gmnark及编码基因和应用，解决现有植物抗干旱基因少，不能满足改良植株产量和品质分子设计的需要的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：植物抗干旱蛋白gmnark及编码基因，其特征在于（gmnark表示大豆中的基因nark，下同），所述gmnark基因的cdna序列如seqidno.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。

进一步，所述植物抗干旱蛋白gmnark及编码基因的应用，是将gmnark的编码基因导入目的的植物中，得到抗干旱提高的转基因植物。

所述转基因植株制备方法包括以下步骤：

1）gmnark基因的获得：

以大豆品种的cdna为模板，以gmnark-oe-f和gmnark-oe-r为引物，pcr扩增获得gmnark基因；

所述引物gmnark-oe-f和gmnark-oe-r的序列如下：

gmnark-oe-f：cccccgggatgagaagctgtgtgtgct；

gmnark-oe-r：cgggatccctagagattaattaggttgtgag；

其中，gmnark-oe-f的下划线序列为smai序列，gmnark-oe-r的下划线序列为bamhi序列

2）重组表达载体的构建：

用smai和bamhi双酶切步骤1）获得的gmnark基因，回收gmnark片段，克隆进经bamhi和smai双酶切的植物表达载体，得到重组表达载体ptf101-camv35s-gmnark；

3）转基因植株的获得：

将步骤2）获得的重组表达载体ptf101-camv35s-gmnark转化入农杆菌eha101感受态细胞，得到gmnark的农杆菌转化子，并进行植物遗传转化，再对植株进行反转录pcr鉴定，获得转基因植株。

所述植物表达载体为ptf101、pezrk或pcambia。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明从大豆（glycinemaxwilliams82）中筛选到了一个具有优良抗干旱功能的基因，利用此基因可很好地进行优良抗干旱品种的选育，为优良作物品种的选育提供资源。丰富了植物抗干旱基因资源库，为改良植株产量和品质分子设计提供了更多的选择。

2、本发明采用生物领域前沿的生物工程技术将大豆中受体激酶蛋白gmnark以转基因的形式导入到其它植物中，使植物可在水分缺失的条件下仍然具有较高的存活率。也说明了该基因与植物的抗干旱作用有密切关系。

3、采用本发明培育优质的耐旱作物品种可在干旱胁迫条件下提高了作物产量和品质，具有很大的应用价值，还将为有效利用该基因资源通过分子设计培育耐逆稳产的农作物新品种提供理论依据。

附图说明

图1是亚细胞中gmnark基因的定位图；

a：细胞膜染色剂fm4-64与gmnark-gfp荧光定位叠加图像；b：带绿色荧光蛋白标签的gmnark-gfp荧光结果；c：fm4-64细胞膜染色剂荧光结果；

图2是过表达载体ptf101-camv35s-gmnark的示意图；

图3是gmnark转基因拟南芥和野生型植株中gmnark基因定量pcr结果图；

图4是gmnark转基因拟南芥和野生型植株干旱处理5周、复水5天后的表型图；

图5是gmnark转基因拟南芥和野生型植株干旱处理5周、复水5天后的存活率的统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1gmnark基因的克隆

根据gmnark蛋白编码序列设计引物gmnark-oe-f和gmnark-oe-r，引物末端分别引入smai和bamhi酶切位点，以大豆品种（glycinemaxwilliams82）的cdna为模板，以gmnark-oe-f和gmnark-oe-f为引物进行pcr扩增。

所述引物序列如下：

gmnark-oe-f：cccccgggatgagaagctgtgtgtgct；

gmnark-oe-r：cgggatccctagagattaattaggttgtgag。

其中，gmnark-oe-f的下划线序列为smai序列，gmnark-oe-r的下划线序列为bamhi序列。

pcr反应体系：2.5µl10×extaqbuffer，2µldntpmix，2.5µl25mmol/l的mgcl2溶液，10µmol/l的gmnark-oe-f和gmnark-oe-r各1µl，0.2µlextaqdna聚合酶，1µlcdna模板，加水补至总体积为25µl；所述taqdna聚合酶为5u/ul；所述dntpmix为datp、dctp、dgtp和dttp的钠盐水溶液预混合的产品，其中，四种物质在dntpmix中的浓度均为2.5mmol/l；

pcr反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30sec，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸5min；

将pcr扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。采用agarosegeldnapurificationver.2.0（takara公司，codeno.：dv807a）回收纯化目的片段（2.9kb左右），即获得gmnark基因片段。

实施例2重组载体构建及在烟草细胞中瞬时表达观察亚细胞定位

用限制性内切酶smai和bamhi分别酶切gmnark基因片段和表达载体ptf101-gfp，回收gmnark基因片段和ptf101-gfp载体片段。再利用t4dna连接酶将酶切回收后的gmnark基因片段和ptf101-gfp载体片段相连接。将连接后的重组载体热激转化大肠杆菌dh5α菌株感受态细胞（购自clontech公司），37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行pcr扩增检测和测序验证，得到了重组质粒ptf101-gfp-gmnark。

将构建成功的重组载体ptf101-gfp-gmnark转化到农杆菌（agrobacteriumtumefacienseha101）中并保存菌种。将含ptf101-gfp-gmnark质粒的农杆菌在平板培养上划线培养，挑单菌落采用yep液体培养基（含50mg/ml利福平，100mg/ml壮观霉素）过夜摇菌，至od600达到2.5-3.0。取1ml菌液以3000rpm室温离心10min后收集菌体。去除上清，用10mmmgcl2重悬菌体，3000rpm室温离心10min。去除上清，用10mmmgcl2重悬菌体，3000rpm室温离心10min，去除上清。用10mmmgcl2将菌液调至od600=0.4，同时将携带病毒ptgs抑制子p19的农杆菌悬浮液调至od600=0.4，将二者等体积混匀，其中各菌种的od600浓度均变为0.2。加入as（乙酰丁香酮）使其终浓度为200μm，摇晃混匀，室温静止2h。将所要注射的烟草从培养室（22-23℃）取出，放在白光灯下培养1h，使叶片的气孔完全张开时转化。挑选适宜转化的叶片，一般选顶端叶片下第三或第四片叶子，用去除针头的注射器将含农杆菌的注射缓冲液缓慢推入叶片背面。把转化后的植株重新放回培养室中培养，补足水分。将烟草培养36-48h后，剪下转化叶片在激光共聚焦显微镜下观察蛋白荧光表达情况。如图1所示，b图单独显示带有绿色荧光蛋白标签的gmnark蛋白在烟草细胞膜上的定位轮廓，c图单独显示经fm4-64染色后的烟草细胞膜轮廓，而a图显示带有绿色荧光蛋白标签的gmnark分布在烟草叶片细胞膜上，并且能与经细胞膜染色剂fm4-64所示的烟草细胞膜轮廓完全重叠；所以说蛋白gmnark主要在细胞膜上表达，在细胞核内无表达。

实施例3过表达gmnark转基因拟南芥植物的获得

将gmnark基因片段连入ptf101载体上的camv35s组成型启动子来完成基因过表达载体的构建。

用限制性内切酶smai和bamhi分别酶切gmnark基因片段和表达载体ptf101，回收gmnark基因片段和ptf101载体片段。再采用t4dna连接酶将酶切回收后的gmnark基因片段和ptf101载体片段相连接。将连接后的重组载体热激转化大肠杆菌dh5α菌株感受态细胞（购自clontech公司），37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行pcr扩增检测，得到了重组质粒ptf101-camv35s-gmnark。其具有如图2所示的结构，其中camv35s：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子，bar^r:草丁膦抗性基因，lb：t-dna左边界；rb：t-dna右边界；

用重组质粒ptf101-camv35s-gmnark转化农杆菌（agrobacteriumtumefacienseha101），经验证得到重组农杆菌。将得到的重组农杆菌接种于5mlyep液体培养基（含50mg/ml利福平，100mg/ml壮观霉素）中，28℃，200rpm培养约30小时。将培养后的菌液转至200mlyep液体培养基（含50mg/ml利福平，100mg/ml壮观霉素）中，28℃，200rpm培养约14小时。收集菌体，4℃，4000g离心10分钟，用含10%的蔗糖ms液体培养基稀释至od600=0.8-1.0。将拟南芥（哥伦比亚生态型col-0，salk公司购买）整株与花盆一起倒扣在盛有稀释后菌体的ms液体培养基中，使花浸泡5分钟左右，将花盆取出，侧放在托盘中，盖上黑色塑料布，24小时候揭开塑料布，将花盆放置在人工气候室中培养，收获t1代种子，以50ug/l的草甘膦筛选阳性植株。t2代表示t1代自交产生的种子及由它长成的植株，t3代表示t2代自交产生的种子及由它长成的植株。从阳性t3代阳性植株中筛选得到转基因植株gmnark-oe-4、gmnark-oe-8和gmnark-oe-11作为纯合转基因株系，进行过表达鉴定。

其中对植株进行表达鉴定采用反转录pcr（rt-pcr）的方法进行，操作如下：

选取阳性植株，使用百泰克公司（biotekecorporation）的tripurereagent试剂盒进行总rna提取，使用tiangen公司生产的fastquantrtkit（withgdnase）试剂盒将总rna反转录成cdna。以cdna为模板，以ubc5-f和ubc5-r为引物，对拟南芥ubc5内参基因进行扩增，观察pcr扩增产物条带并将对照植株(转化空载体ptf101，用col-0表示)和3个gmnark过表达株系（gmnark-oe-4、gmnark-oe-8和gmnark-oe-11）的总cdna浓调节至一致水平（以ubc5的pcr扩增产物电泳条带亮度相同为标准）。分别以相同体积的浓度调节一致的野生型及过表达植株cdna为模板，以rt-gmnark-f和rt-gmnark-r为引物，对目的片段gmnark进行扩增，比较转基因株系与野生型株系（对照）中gmnark基因表达水平。如图3所示。

rt-pcr引物序列如下：

ubc5-f：ccagacctggagcccgatg

ubc5-r：gcagctgcttcaccattc

rt-gmnark-f：aaccccaacctctgtacc

rt-gmnark-r：ctagagattaattaggttgtgag

从图3可以看出，对照组col-0中无gmnark基因表达，而3株转基因的拟南芥（gmnark-oe-4、gmnark-oe-8和gmnark-oe-11）均成功超量表达gmnark基因。

实施例4转gmnark基因拟南芥的抗旱性检测

将经实施例3的rt-pcr鉴定分析结果均为阳性的t3代转化体gmnark-oe-4，gmnark-oe-8和gmnark-oe-11的3个转化体株系的种子得到的幼苗和对照(转化空载体ptf101，在图中用col-0表示)幼苗进行如下抗旱性检测，每个转化体株系和对照均10株。

将获得的gmnark-oe-4、gmnark-oe-8、gmnark-oe-11和col-0株系的拟南芥种子在ms培养基上萌发，将萌发后1周的幼苗转移到吸水至饱和的含有培养基质花盆中（蛭石：营养土=2:1），放置于人工气候室中培养，光周期为白天：黑夜=16h:8h，温度为22℃。对培养的植株进行5周时间的干旱处理，处理后观察植株生长状态。然后浇水对植株进行复水处理，5天后统计植株存活率和表型分析。如图4和5所示。

从图4可以看出，在未经干旱处理前，常规培养2周期间，拟南芥野生型col-0和3个过表达gmnark的转基因株系gmnark-oe-4、gmnark-oe-8和gmnark-oe-11长势一致（图4左）；干旱处理5周后，拟南芥野生型col-0叶片干枯卷曲，植株死亡，而3个转基因株系植株虽表现出干旱胁迫表型，但仍具有一定生活力（图4中）；复水后，对照组植株全部死亡，而3个过表达gmnark的转基因株系gmnark-oe-4、gmnark-oe-8和gmnark-oe-11仍有至少一半比例的植株恢复正常的生长活力（图4右）。

从图5可以看出，干旱处理-复水处理后对照组的植株全部死亡，而3个过表达gmnark的转基因株系gmnark-oe-4、gmnark-oe-8和gmnark-oe-11的存活率分别为50%、80%和70%，说明该基因编码的蛋白具有抗干旱功能。

综上，通过上述转基因，将gmnark转化到植株中可以显著增强植株抗旱性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>长江师范学院；

<120>植物抗干旱蛋白gmnark及编码基因和应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2964

<212>dna

<213>大豆(glycinemaxwilliams82)

<400>1

atgagaagctgtgtgtgctacacgctattattgtttattttcttcatatggctgcgcgtg60

gcaacgtgctcttcgttcactgacatggaatcgcttctgaagctgaaggactccatgaaa120

ggagataaagccaaagacgacgctctccatgactggaagtttttcccctcgctttctgca180

cactgtttcttttcaggcgtaaaatgcgaccgagaacttcgagtcgttgctatcaacgtc240

tcgtttgttcctctcttcggtcaccttccgccggagatcggacaattggacaaactcgag300

aacctcaccgtctcgcagaacaacctcaccggcgtacttcccaaggagctcgccgccctc360

acttccctcaagcacctcaacatctctcacaacgtcttctccggccatttccccggccaa420

attatccttccgatgacgaaactggaggtcctcgacgtctacgacaacaacttcaccgga480

ccgcttcccgtagagttggtgaaactggagaaattaaaatacctgaagctcgacggaaac540

tatttctccggcagcataccggagagttactcggagtttaagagcttggagtttttaagc600

ttaagcaccaatagcttatcggggaagattcccaagagtttgtcgaagttgaagacgctg660

aggtacctaaaactcggatacaacaacgcttacgaaggtggaattccaccggagtttggc720

agcatgaaatctctgagataccttgacctctctagctgcaacctcagcggcgagattcca780

ccgagccttgcaaatctgacaaaccttgacacgttgttcctgcaaattaacaacctcacc840

ggaaccattccgtcggagctctccgctatggtgagcctcatgtcacttgatctctccatc900

aacgacctcaccggtgagataccgatgagcttctcacagcttagaaacctcactctcatg960

aacttcttccaaaacaatcttcgcggctcagttccgtccttcgtcggcgagcttccgaat1020

ctggaaacgctgcagctctgggataacaacttctccttcgtgctacctccgaaccttggg1080

caaaacggcaagttaaagttcttcgacgtcatcaagaatcacttcaccgggttgatccct1140

cgagatttgtgtaagagtgggaggttacaaacgatcatgatcacagataacttcttccgc1200

ggtccaatccctaacgagattggtaactgcaagtctctcaccaagatccgagcctccaat1260

aactaccttaacggcgtggttccgtcagggattttcaaactaccttctgtcacgataatc1320

gagctggccaataaccgttttaacggcgaactgcctcctgagatttccggcgaatccctg1380

gggattctcactctttccaacaacttattcagtgggaaaattcccccagcgttgaagaac1440

ttgagggcactgcagactctctcacttgacgcaaacgagttcgttggagaaataccggga1500

gaggtttttgacctaccgatgctgactgtggtcaacataagcggcaacaatctaaccgga1560

ccaatcccaacgacgttgactcgctgcgtttcactcaccgccgtggacctcagccggaac1620

atgcttgaagggaagattccgaagggaatcaaaaacctcacggacttgagcattttcaat1680

gtgtcgataaaccaaatttcagggccagtccctgaggagattcgcttcatgttgagtctc1740

accacattggatctatccaacaacaatttcatcggcaaggtcccaaccgggggtcagttc1800

gcggtcttcagcgagaaatcctttgcagggaaccccaacctctgtacctcccactcttgc1860

ccgaattcctcgttgtaccctgacgacgccttgaagaagaggcgcggcccttggagtttg1920

aaatccacgagggtgatagtcatcgtgattgcactgggcacagccgcgctgctggtggcg1980

gtgacggtgtacatgatgaggaggaggaagatgaaccttgcgaagacgtggaagctgacg2040

gcgttccagcggctgaacttcaaagccgaggacgtggtggagtgtctgaaggaggagaac2100

ataataggaaaaggaggggcagggatcgtgtaccgcgggtccatgccaaacggaacagac2160

gtggcgataaagcggttggttggggcggggagtggaaggaacgattacggattcaaagcg2220

gagatagaaacgctggggaagataaggcacaggaacataatgaggcttttaggttacgtg2280

tcgaacaaggagacgaacttgctgctgtatgagtacatgccaaatgggagcttaggggaa2340

tggctgcatggtgccaaaggagggcacttgaagtgggaaatgaggtacaagattgcggtg2400

gaagctgctaagggactgtgctatttgcaccatgattgttcccctcttatcattcacagg2460

gatgtcaagtctaataatatattgctggatggggacttggaggcccatgttgctgatttt2520

ggccttgccaagttcttgtacgaccctggcgcctctcagtccatgtcctccattgctggc2580

tcctacggctacattgctccagagtatgcatacactttgaaagtggacgagaaaagtgat2640

gtgtacagctttggcgttgtgctgctggagctgataatagggaggaagccagtgggagag2700

tttggagacggggtggacatcgttggatgggtcaacaaaacgagattggagctcgctcag2760

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aggcctaccatgagggaagtcgttcatatgctctcagagcctcctcactctgctactcac2940

actcacaacctaattaatctctag2964

<210>2

<211>987

<212>prt

<213>大豆(glycinemaxwilliams82)

<400>2

mrscvcytlllfiffiwlrvatcssftdmesllklkdsmkgdkakddalhdwkffpslsa60

hcffsgvkcdrelrvvainvsfvplfghlppeigqldklenltvsqnnltgvlpkelaal120

tslkhlnishnvfsghfpgqiilpmtklevldvydnnftgplpvelvkleklkylkldgn180

yfsgsipesysefksleflslstnslsgkipkslsklktlrylklgynnayeggippefg240

smkslryldlsscnlsgeippslanltnldtlflqinnltgtipselsamvslmsldlsi300

ndltgeipmsfsqlrnltlmnffqnnlrgsvpsfvgelpnletlqlwdnnfsfvlppnlg360

qngklkffdviknhftgliprdlcksgrlqtimitdnffrgpipneigncksltkirasn420

nylngvvpsgifklpsvtiielannrfngelppeisgeslgiltlsnnlfsgkippalkn480

lralqtlsldanefvgeipgevfdlpmltvvnisgnnltgpipttltrcvsltavdlsrn540

mlegkipkgiknltdlsifnvsinqisgpvpeeirfmlslttldlsnnnfigkvptggqf600

avfseksfagnpnlctshscpnsslypddalkkrrgpwslkstrvivivialgtaallva660

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vaikrlvgagsgrndygfkaeietlgkirhrnimrllgyvsnketnlllyeympngslge780

wlhgakgghlkwemrykiaveaakglcylhhdcspliihrdvksnnilldgdleahvadf840

glakflydpgasqsmssiagsygyiapeyaytlkvdeksdvysfgvvlleliigrkpvge900

fgdgvdivgwvnktrlelaqpsdaalvlavvdprlsgypltsviymfniammcvkemgpa960

rptmrevvhmlsepphsaththnlinl987

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>3

cccccgggatgagaagctgtgtgtgct27

<210>4

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>4

cgggatccctagagattaattaggttgtgag31

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>5

aaccccaacctctgtacc18

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>6

ctagagattaattaggttgtgag23

<210>7

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>7

ccagacctggagcccgatg19

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>8

gcagctgcttcaccattc18