本发明属于微生物发酵工程
技术领域：
，具体涉及一种ph稳定型发酵培养基及其应用。
背景技术：
：巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)是近年发展起来的一种以甲醇为碳源的真核表达系统，酵母可对异源蛋白进行修饰，采用有信号肽的质粒时，蛋白能被正确折叠和加工，然后分泌到培养基中。具有操作简便，营养要求低，培养价格低廉，便于高密度发酵，高产量分泌表达外源蛋白以及表达产物易于纯化等优点。现有的巴斯德毕赤酵母培养基中，主要成分是酵母提取物、蛋白胨和无氨基酵母氮源等。这类培养基只适用于小规模培养，放大后成本过高，因而应用受到限制。且目前大规模发酵培养基中，往往含有大量的koh和磷酸盐，ph稳定性较差，生产操作难度大。因此，有效提高发酵过程中ph稳定性，对发酵放大和工业化生产，具有深远重要意义。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide，nad+)广泛存在于各种生物体中，对生命活动具有极为重要的作用。目前合成nad+的方法主要是生物或化学合成法，即通过筛选或诱变获取高烟酰胺单核酸苷酸腺苷转移酶(nicotinamidemononucleotideadenylyltransferase，nmnats)活力的野生菌株，但这部分菌株的nmnats产量都比较低，不足够满足生产需求。另外有研究尝试通过大肠杆菌对nmnats进行重组表达，但也不能获得高表达的菌株。技术实现要素：基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种ph稳定型发酵培养基，其可显著提高巴斯德毕赤酵母的ph稳定性及重组蛋白的表达水平，可用于烟酰胺单核酸苷酸腺苷转移酶的发酵生产，具有产量高、生产过程简单、易于控制和发酵周期短等优点。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种ph稳定型发酵培养基，其特征在于，包含以下浓度的组分：酵母粉20～30g/l、大豆蛋白胨30～40g/l、甘油10～30g/l、甲醇30～60g/l、乙二醇10～20g/l和ptm1溶液0.5～5ml/l，且所述培养基的ph值为6～8。所述ph稳定型发酵培养基的组分酵母粉的浓度为20～30g/l，表示每升培养基中含20～30g的酵母粉。所述ph稳定型发酵培养基的组分ptm1为微量元素，配方为：cuso4-5h2o6.0g；nai0.08g；mnso4-h2o3.0g；na2moo4-2h2o0.2g；硼酸0.02g；cocl20.5g；zncl220.0g；feso4-7h2o65.0g；生物素0.2g；硫酸5.0ml；加水至1000ml；过滤除菌，室温保存。优选地，所述ph稳定型发酵培养基包含以下浓度的组分：酵母粉25g/l、大豆蛋白胨35g/l、甘油25g/l、甲醇35g/l、乙二醇12g/l和ptm1溶液3ml/l，且所述培养基的ph值为6.5。优选地，所述ph稳定型发酵培养基包含以下浓度的组分：酵母粉20g/l、大豆蛋白胨32g/l、甘油27g/l、甲醇45g/l、乙二醇20g/l和ptm1溶液5ml/l，且所述培养基的ph值为6。本发明的另一目的，在于提供所述ph稳定型发酵培养基在培养巴斯德毕赤酵母中的用途。优选地，所述培养为种子培养或发酵培养。优选地，所述巴斯德毕赤酵母为野生型菌株或经过改造的含有外源基因的重组工程菌株。本发明的又一目的在于提供一种生产重组蛋白的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种生产重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取含有所述重组蛋白编码基因的巴斯德毕赤酵母菌株，培养得到种子液；(2)将步骤(1)中的种子液接种到含有所述ph稳定型发酵培养基的发酵罐中，开始发酵；(3)发酵结束后，收集发酵液，分离纯化所述重组蛋白，干燥，即得。优选地，所述步骤(2)中种子液的体积是发酵罐中ph稳定型发酵培养基体积的5％。优选地，所述重组蛋白为烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶。优选地，所述烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的生产方法还包括对分离纯化得到的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶进行酶活力测定。酶活力定义为：在37℃，1ml反应体系中，每分钟转化1umol底物所需的酶量为1个活力单位(u)。比活力定义为：每mg酶蛋白所具有的酶活力，u/mg。酶的比活力越高，酶越纯。烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶进行酶活力测定方法为：配制包括100mmph7.4hepe缓冲液、300mmnmn、50mmatp、50mmmgcl2、1g/ml待测酶液和7u乙醇脱氢酶的酶活力测定体系，37℃水浴2h后，加入0.155m的edta终止反应，5min后，取上清于340nm处测定反应产物的吸光值。相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明提供的ph稳定型发酵培养基可显著提高酵母菌的ph稳定性及重组蛋白的表达水平，使重组蛋白的产量高达100mg/l以上，并且可以提高重组蛋白的纯度。此外，还避免了酸、碱对环境、人员和发酵设备的危害，降低了发酵的生产成本，且具有生产过程简单、易于控制和发酵周期短等优点。具体实施方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1本发明所述ph稳定型发酵培养基的一种实施例，包含以下浓度的组分：酵母粉20g/l、大豆蛋白胨30g/l、甘油10g/l、甲醇30g/l、乙二醇10g/l和ptm1溶液0.5ml/l，且所述培养基的ph值为8。实施例2本发明所述ph稳定型发酵培养基的一种实施例，包含以下浓度的组分：酵母粉30g/l、大豆蛋白胨40g/l、甘油30g/l、甲醇60g/l、乙二醇20g/l和ptm1溶液5ml/l，且所述培养基的ph值为6。实施例3本发明所述ph稳定型发酵培养基的一种实施例，包含以下浓度的组分：酵母粉25g/l、大豆蛋白胨35g/l、甘油25g/l、甲醇35g/l、乙二醇12g/l和ptm1溶液3ml/l，且所述培养基的ph值为6.5。实施例4本发明所述ph稳定型发酵培养基的一种实施例，包含以下浓度的组分：酵母粉20g/l、大豆蛋白胨32g/l、甘油27g/l、甲醇45g/l、乙二醇20g/l和ptm1溶液5ml/l，且所述培养基的ph值为6。实施例5本实施例对实施例1～4制备得到的ph稳定型发酵培养基生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶效果进行检测。(一)发酵生产方法设置测试组1～4，分别使用实施例1～4制备得到的ph稳定型发酵培养基进行烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶发酵生产。1、取含有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶编码基因的重组巴斯德毕赤酵母菌种，在100mlypd培养基中，于27℃、250rpm/min条件下振荡培养19小时。然后将其转移到1000mlypd培养基中，于27℃，250rpm/min振荡培养19小时，得到种子液。2、分别配制10l实施例1～4中的ph稳定型发酵培养基，加入测试组1～5的发酵罐中。在接种前标定10l发酵罐溶氧电极的溶氧值为100％，然后按5％的接种量将种子液装入上述发酵罐中，开始发酵。分别取各测试组发酵0h、4h、8h、12h、16h、19h、24h、28h、32h和36h的发酵液，检测ph值。3、发酵48h后，终止发酵，收集发酵液。离心后取上清，用制备型高效液相色谱分离纯化烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶、冻干干燥，得到纯酶，计算烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的产量。4、对分离纯化得到的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的酶活力进行测定：配制包括100mmph7.4hepe缓冲液、300mmnmn、50mmatp、50mmmgcl2、1g/ml待测酶液和7u乙醇脱氢酶的酶活力测定体系，37℃水浴2h后，加入0.155m的edta终止反应，5min后，取上清于340nm处测定反应产物的吸光值。(二)检测结果1、发酵液ph值检测结果：对实施例1～4制备得到的ph稳定型发酵培养基在发酵生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶过程中发酵液的ph值检测结果如表1所示：表1发酵液ph值检测结果由表1可知，用实施例1～4制备得到的ph稳定型发酵培养基来发酵生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶，发酵过程中巴斯德毕赤酵母菌具有很好的ph稳定性，发酵液ph值较稳定，变化范围不大。2、烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶产量和比活力检测结果：对实施例1～4制备得到的ph稳定型发酵培养基发酵生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的酶产量和比活力检测结果如表2所示：表2烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶产量和比活力检测结果由表2可知，用实施例1～4制备得到的ph稳定型发酵培养基来发酵生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶，产量可高达100mg/l以上，且制备得到的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶比活力可达40u/mg，说明本发明实施例1～4提供的ph稳定型发酵培养基可大大提高烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的产量，同时提高其纯度。其中，实施例3制备得到的ph稳定型发酵培养基效果最好。实施例6本实施例对本发明ph稳定型发酵培养基和普通巴斯德毕赤酵母培养基发酵生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的效果进行对比实验。(一)实验设计为了评价本发明ph稳定型发酵培养基和普通巴斯德毕赤酵母培养基发酵生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的效果差异，设置实验组1～2，具体如表3所示：表3实验设计实验组发酵生产用培养基实验组1实施例3制备得到的ph稳定型发酵培养基实验组2ypd培养基(二)实验方法分别用实验组1和2所述培养基发酵生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶，发酵生产方法同实施例5。(三)实验结果1、发酵液ph值检测结果：对实验组1和2所述培养基在发酵生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶过程中发酵液的ph值检测结果如表4所示：表4发酵液ph值检测结果由表4可知，利用实验组1中的ph稳定型发酵培养基(实施例3培养基)来发酵生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶，在生产过程中，发酵液的ph值处于较稳定的状态，变化范围不大。而实验组2中的培养基(常用培养基)在发酵生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的过程中，发酵液的ph值处于不稳定状态，变化范围较大。说明本发明提供的培养基可有效提高酵母菌的ph稳定性。2、烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶产量和比活力检测结果：对实验组1和2所述培养基发酵生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的酶产量和比活力检测结果如表5所示：表5烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶产量和比活力检测结果由表5可知，利用实验组1中的ph稳定型发酵培养基(实施例3培养基)来发酵生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶，其产量和比活力显著优于实验组2培养基(普通培养基)，说明本发明提供的ph稳定型发酵培养基可有效提高烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶产量和纯度。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12