一种治疗胶质瘤的基于靶向FMRP的CAP23145多肽的生产方法与流程

本发明涉及一种多肽的生产方法，尤其涉及一种治疗胶质瘤的基于靶向fmrp的cap23145多肽的生产方法。

背景技术：

脑胶质瘤是神经系统最为常见的原发性恶性肿瘤，其中一半以上为恶性程度较高的胶质母细胞瘤，目前胶质瘤发病率呈逐年增高趋势，且死亡率高，术后生存率低，是影响我国居民健康的重要恶性肿瘤。

目前胶质瘤的治疗仍以手术切除治疗为主，辅以放化疗，但总体效果欠佳，脑胶质瘤细胞成分的复杂性、肿瘤生长的侵润性以及血脑屏障对治疗药物的阻断作用是造成这种局面的主要因素。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提出一种治疗胶质瘤的基于靶向fmrp的cap23145多肽的生产方法，该多肽对胶质瘤的靶向性更强，在杀伤胶质瘤细胞的同时不对正常胶质细胞产生明显的杀伤，减轻药物化疗的副作用。

本发明技术方案的具体步骤如下：

一种治疗胶质瘤的基于靶向fmrp的cap23145多肽的生产方法，包括如下步骤：

(1)根据fmrp、caprin-1序列及相互作用特点，利用计算机空间模拟软件，设计可与fmrp特异性结合、并能阻断这两者相互作用的cap23145多肽；

(2)合成所设计的多肽，包括如下生产流程：

a、合成原料及相关试剂、仪器；

a、树脂:取代度为1.03mmol/g的2-chlorotritylchlorideresin；b、氨基酸:

fmoc-tyr(tbu)-oh，fmoc-asn(trt)-oh，fmoc-ser(tbu)-oh等；

c、特殊原料:

d-biotin；

d、合成试剂:

dmf，dcm，meoh，diea，hbtu；

e、脱保护试剂:哌啶；

f、检测试剂:苯酚试剂，吡啶试剂，茚三酮试剂；

g、裂解试剂:

95％切割液:tfa，tis，edt，无水乙醚；

h、氮气；

i、仪器:

①.十二通道半自动多肽合成仪；

②.shimadzu高效液相色谱仪；

③.labconco冻干机；

b、多肽合成步骤如下:合成顺序:从c端到n端；

a、树脂溶涨：

将2-chlorotritylchlorideresin放入反应管中，加dcm并振荡；

b、接第一个氨基酸：

通过沙芯抽滤掉溶剂，加入fmoc-tyr(tbu)-oh氨基酸，加入dmf溶解，再加入diea并振荡，用甲醇封闭；

c、脱保护：

去掉dmf，加哌啶dmf溶液，去掉再加一次哌啶dmf溶液；

d、检测:

抽掉哌啶溶液，取树脂若干粒，用乙醇洗净，然后加入检测试剂检测，变深蓝色为阳性反应；

e、第一次洗:

dmf(10ml/g)两次，dcm(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；

f、缩合:

将保护氨基酸、hbtu均用dmf溶解，加入反应管，立刻加入diea进行反应；

g、检测:

取树脂若干粒，用乙醇洗净后，加入检测试剂检测，然后加热,无色为阴性反应；

h、第二次洗:

dmf(10ml/g)一次，dcm(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；

i、重复三至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸，最后接d-biotin；

j、抽干，按照下列方法洗树脂:

先dmf洗，再用甲醇洗，接着用再dmf洗，接着用dcm洗，最后抽干；

k、从树脂上切割多肽:

配制切割液、水、edt、tis，然后进行切割；

l、吹干洗涤:

将裂解液用氮气吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干；

m、分析提纯:

用高效液相色谱将粗品提纯；

n、冻干：

收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。

作为本发明之优选，所述b步骤的a步骤中，所述树脂溶涨具体为：将2-chlorotritylchlorideresin放入反应管中，加dcm(15ml/g)，振荡30min。

作为本发明之优选，所述b步骤的b步骤中，通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的fmoc-tyr(tbu)-oh氨基酸，加入dmf溶解，再加入10倍摩尔过量的diea，振荡60min，然后用甲醇封闭。

作为本发明之优选，，所述b步骤的c步骤中，去掉dmf，加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，15min。

作为本发明之优选，所述b步骤的d步骤中，抽掉哌啶溶液，取10-20粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。

作为本发明之优选，所述b步骤的f步骤中，保护氨基酸三倍过量，hbtu三倍过量，均用10到15ml/g的dmf溶解，加入反应管，立刻加入diea十倍过量，反应30min。

作为本发明之优选，所述b步骤的g步骤中，取10-20粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5min,无色为阴性反应。

作为本发明之优选，所述b步骤的j步骤中，所述抽干、洗树脂具体为：dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次，dcm(10ml/g)两次，抽干10min。

作为本发明之优选，所述b步骤的k步骤中，从树脂上切割多肽时，配制切割液(10/g)tfa95％，水1％，edt2％，tis2％，切割时间为120min。

作为本发明之优选，所述b步骤的l步骤中，吹干洗涤时，先将裂解液用氮气吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。

本发明是一种胶质瘤治疗的一种新型靶向药物，体外实验和体内动物实验证实对胶质瘤细胞具有特异性杀伤作用，而对正常神经胶质细胞无明显杀伤作用后，可对胶质瘤的治疗起到良好的作用。

附图说明

图1所示为体外细胞实验中胶质瘤细胞dbtrg加入多肽后的效果图；

图2所示为体外细胞实验中胶质瘤细胞u251加入多肽后的效果图；

具体实施方式

为了便于本领域普通技术人员理解和实施本发明，下面结合附图及实施例对本发明作进一步的详细描述，应当理解，此处所描述的实施示例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

(1)根据fmrp、caprin-1序列及相互作用特点，利用计算机空间模拟软件，设计可与fmrp特异性结合、并能阻断这两者相互作用的cap23145多肽；

(2)合成所设计的多肽，包括如下生产流程：

a、合成原料及相关试剂、仪器；

a、树脂:取代度为1.03mmol/g的2-chlorotritylchlorideresin(天津市南开合成科技有限公司)

b、氨基酸:

fmoc-tyr(tbu)-oh(成都诚诺，>99％)，fmoc-asn(trt)-oh(成都诚诺，>99％)，fmoc-ser(tbu)-oh(成都诚诺，>99％)等。

c、特殊原料:

d-biotin(博美生物，99％)。

d、合成试剂:

dmf(原产地韩国)，dcm(原产地韩国)，meoh(原产地日本)，diea(新德化工，99％)，hbtu(昊帆生物科技，99％)；

e、脱保护试剂:哌啶(国药集团上海化学试剂公司，99％)；

f、检测试剂:苯酚试剂(自配)，吡啶试剂(自配)，茚三酮试剂(自配)；

g、裂解试剂:

95％切割液:tfa(j.t.baker，99％)，tis(上海达瑞精细化工，98％)，edt(上海达瑞精细化工，98％)，无水乙醚(上海实验，实测99.7％)；

h、氮气:(新联气体)；

i、仪器:

①.十二通道半自动多肽合成仪上海强耀生物科技有限公司自主设计并申请专利的半自动多肽合成仪，专利号为201020226529.2

②.shimadzu高效液相色谱仪(型号:制备型，分析型，软件:class-vp.sevialsystem，厂商:shimadzu)

③.labconco冻干机(型号:freezone.plus.6，厂商:labconco)4.离心机(上海安亭科学仪器厂型号:tdl-40b)

b、多肽合成步骤如下:合成顺序:从c端到n端；

a、树脂溶涨：

将2-chlorotritylchlorideresin放入反应管中，加dcm并振荡；

b、接第一个氨基酸：

通过沙芯抽滤掉溶剂，加入fmoc-tyr(tbu)-oh氨基酸，加入dmf溶解，再加入diea并振荡，用甲醇封闭；

c、脱保护：

去掉dmf，加哌啶dmf溶液，去掉再加一次哌啶dmf溶液；

d、检测:

抽掉哌啶溶液，取树脂若干粒，用乙醇洗净，然后加入检测试剂检测，变深蓝色为阳性反应；

e、第一次洗:

dmf(10ml/g)两次，dcm(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；

f、缩合:

将保护氨基酸、hbtu均用dmf溶解，加入反应管，立刻加入diea进行反应；

g、检测:

取树脂若干粒，用乙醇洗净后，加入检测试剂检测，然后加热,无色为阴性反应；

h、第二次洗:

dmf(10ml/g)一次，dcm(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；

ii、重复三至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸，最后接d-biotin；

j、抽干，按照下列方法洗树脂:

先dmf洗，再用甲醇洗，接着用再dmf洗，接着用dcm洗，最后抽干；

k、从树脂上切割多肽:

配制切割液、水、edt、tis，然后进行切割；

l、吹干洗涤:

将裂解液用氮气吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干；

m、分析提纯:

用高效液相色谱将粗品提纯；

n、冻干：

收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。

优选的，在b步骤的a步骤中，树脂溶涨具体为：将2-chlorotritylchlorideresin放入反应管中，加dcm(15ml/g)，振荡30min。

优选的，在b步骤的b步骤中，通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的fmoc-tyr(tbu)-oh氨基酸，加入dmf溶解，再加入10倍摩尔过量的diea，振荡60min，然后用甲醇封闭。

优选的，在b步骤的c步骤中，去掉dmf，加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，15min。

优选的，在b步骤的d步骤中，抽掉哌啶溶液，取10-20粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。

优选的，在b步骤的f步骤中，保护氨基酸三倍过量，hbtu三倍过量，均用10到15ml/g的dmf溶解，加入反应管，立刻加入diea十倍过量，反应30min。

优选的，在b步骤的g步骤中，取10-20粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5min,无色为阴性反应，在实际操作中，树脂通常取12粒。

优选的，在b步骤的j步骤中，抽干、洗树脂具体为：dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次，dcm(10ml/g)两次，抽干10min。

优选的，在b步骤的k步骤中，从树脂上切割多肽时，配制切割液(10/g)tfa95％，水1％，edt2％，tis2％，切割时间为120min。

优选的，在b步骤的l步骤中，吹干洗涤时，先将裂解液用氮气吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。

为了进一步证实cap23145对治疗胶质瘤的作用，现作对比实验如下：

1.胶质瘤细胞(u251、dbtrg)，按照5000个/孔，铺入96孔板，每天更换培养基，分别加入相同浓度的不同多肽，空白对照仅加入dmem培养基，每组做3个复孔。

2.以mtt法每天检测细胞生长状态。

从图1、2可以明显地看出，在胶质瘤细胞dbtrg、u251中，与对照组相比，caprin23145多肽可显著抑制胶质瘤细胞的生长，而gfp、fitc-caprin3608(1)和fmr42443多肽对胶质瘤细胞的生长并无明显影响。

本发明是一种胶质瘤治疗的一种新型靶向药物，体外实验和体内动物实验证实对胶质瘤细胞具有特异性杀伤作用，而对正常神经胶质细胞无明显杀伤作用后，可对胶质瘤的治疗起到良好的作用。