本发明属于遗传分子技术领域,涉及中药资源开发利用及遗传多样性研究,具体涉及一种筛选拳卷地钱ssr引物的方法。
背景技术：
目前，运用分子标记对生物体进行遗传学研究已成为诞下的重点和热点，如何在众多的分子标记中选择适当方法对遗传研究的效率和成败具有决定意义。而在众多分子标记技术中，基于ssr标记特异性的扩增、良好的稳定性及重复性、能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化等特点，被视为比较理想的遗传标记方法。特别是近年在品种鉴定、地理来源鉴别研究、居群遗传研究、有效成分与遗传多样研究等当中得到应用。然而ssr标记具有种属特异性，不同物种间的ssr引物没有通用性，必须针对每个物种开发特异引物进行pcr检测。
拳卷地钱经广西中医药大学生药学专家鉴定为地钱科地钱属植物拳卷地钱(marchantiaconvolutagaoetchang)，采自广西各地。据文献报道，关于拳卷地钱生药学鉴别研究、挥发性成分分析、黄酮类化合物研究、脂溶性成分研究、抗急性肝损伤及抗乙肝病毒药理研究及issr-pcr扩增体系研究均见报道，但目前未见关于ssr遗传标记研究内容。本文采用改良的ctab法提取拳卷地钱dna，经酶切、连接、抑制性pcr、预扩增、sam法扩增得到预期片段，通过pcr筛选出有效扩增的拳卷地钱ssr引物，为拳卷地钱分子资源生药鉴别、资源开发利用提供了技术基础。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种筛选拳卷地钱ssr引物的方法，以及由此方法得到拳卷地钱ssr引物，通过对拳卷地钱ssr引物筛选的研究，得到了拳卷地钱ssr引物30对，是一种研究拳卷地钱遗传多样性较好研究方法。采用改良的ctab法提取拳卷地钱dna，经酶切、连接、抑制性pcr、预扩增、sam法扩增得到预期片段，通过pcr筛选出有效扩增的拳卷地钱ssr引物，为拳卷地钱分子资源生药鉴别、资源开发利用提供了技术基础。
本发明的技术方案如下：
一种筛选拳卷地钱ssr引物的方法，该方法首先提取拳卷地钱的基因组dna，然后进行酶切和连接、抑制性pcr、再进行预扩增和sam法扩增、pcr筛选出拳卷地钱ssr引物。
作为技术方案的进一步改进，以上所述的一种筛选拳卷地钱ssr引物的方法，其特征在于：所述的提取拳卷地钱的基因组dna为采用ctab法从拳卷地钱叶片中提取到拳卷地钱的基因组dna样品。紫外分光光度计测定显示用改良的ctab法提取的拳卷地钱的基因组dna的od260/od280比值，同时经1％琼脂糖凝胶电泳检测dna纯度。
作为技术方案的进一步改进，以上所述的一种筛选拳卷地钱ssr引物的方法，所述的酶切、连接为用限制性内切酶msei和psti对拳卷地钱的基因组dna样品进行双酶切和连接，得到拳卷地钱dna酶切和连接产物，拳卷地钱dna酶切和连接产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测，其片段大小为100-1500bp。
作为技术方案的进一步改进，以上所述的一种筛选拳卷地钱ssr引物的方法，所述的预扩增为将拳卷地钱dna酶切和连接产物进行预扩增，得到预扩增产物，所述的预扩增条件为：takaraextaq1u；10×extaqbuffer2μl；稀释好的suppressionpcr产物1μl；25mmmgc121.5μl；dntpmix(各2.5mm)1.5μl；mseiadapterprimer15pmol；pstiadapterprimer5pmol；ddh20至20μl；其中：
mseiadapterprimer1的序列：5'-gacgaccgacgagtaac-'3
pstiadapterprimer的序列：5'-agactgcgtacatgcagga-'3。
作为技术方案的进一步改进，以上所述的一种筛选拳卷地钱ssr引物的方法，所述的sam法扩增是将预扩增产物在反应体系为：10×extaqbuffer2μl；稀释好的预扩增产物2μl；takaraextaqlu；25mmmgcl21.5μl；dntpmix(各2.5mm)1.5μl；mseiadapterprimer3(4～10)5pmol；ssrprimer(pct6)20pmol；加ddh20至20μl，的条件下进行sam扩增，得到sam扩增产物。
作为技术方案的进一步改进，以上所述的一种筛选拳卷地钱ssr引物的方法，所述的sam法扩增还包括sam扩增产物的回收与克隆，所述的sam扩增产物的回收与克隆为：通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将sam扩增产物分离，随机挑选200个大小不同的sam扩增片段，枪头压碎并用双蒸水浸泡离心，进行第二次sam扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳纯化，dna纯化试剂盒回收，回收产物通过与pmd18-tvector的连接，转入感受态细胞，经amp+lb平板筛选得到阳性克隆，随机从每个平板上挑选2个白色菌落，共克隆得到了100个sam片段用于测序。
作为技术方案的进一步改进，以上所述的一种筛选拳卷地钱ssr引物的方法，所述的pcr筛选为：根据测序得到的dna片段中所含的ssr的侧翼序列采用primerpremier5.0软件设计特异引物，从86个片段中根据ssr位点的一侧或两侧序列设计特异引物进行合成，然后与5′锚定兼并引物ssrprimer(pct6)组成引物对，以拳卷地钱的基因组dna为模板，经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出30对清晰条带的特异引物，即为拳卷地钱ssr引物。
作为技术方案的进一步改进，以上所述的一种筛选拳卷地钱ssr引物的方法，所述的pcr筛选为：所述的取到拳卷地钱的基因组dna样品后，还包括用紫外分光光度计测定显示用拳卷地钱的基因组dna的od260/od280比值，同时经1％琼脂糖凝胶电泳检测dna纯度
本发明的有益效果为：
1.本发明首次利用sam法设计了拳卷地钱的ssr引物；
2.本发明利用改良的ctab法提取拳卷地钱dna；
3.本发明经酶切、连接、抑制性pcr、预扩增、sam法扩增得到预期片段，连接扩增产物转化大肠杆菌，随机挑取白斑，筛选得到100个阳性克隆进行测序，得到ssr引物的86条序列。通过pcr筛选出有效扩增的拳卷地钱ssr引物30对；
4.本发明涉及的ssr分子标记将应用于拳卷地钱的品种鉴定，遗传分析，遗传图谱建立，分类研究和种质资源鉴定等各个领域。
附图说明
图1sam扩增产物电泳图
图2引物电泳图
具体实施方式
1试验方法及步骤：
(1)提取与纯化拳卷地钱基因组dna
吸取800μlctab抽提液于2ml离心管，60℃水浴预热；加入0.1g拳卷地钱叶片，200μlctab抽提液充分研磨后转入步骤(1)离心管中；60℃孵育2小时，15min摇匀一次；室温8000rpm，离心6min，吸取上清液转入2ml离心管；加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，充分混合；8000rpm，离心10min，回收水相；加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，再抽提一次；吸水相，加1/10倍体积naac(5.2m)，2.5倍冰冻无水乙醇，混匀后8000rpm，离心5min；收集沉淀，75％的乙醇洗涤3遍，风干；沉淀物用去离子水溶解；加入rnaase液3μl，35℃水浴20min；水浴后，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)再次抽提；10000rpm离心5min，吸水相转新离心管；离心管冰浴，1/10体积的naac、2倍体积的冰冻无水乙醇加入离心管中，-20℃冰箱过夜；4℃，12000rpm离心5min，收集沉淀；75％乙醇洗2次，风干；100μl的去离子水溶解dna，-20℃保存备用。
(2)拳卷地钱dna样品的酶切消化和检测
限制性内切酶酶切的反应体系：基因组dna样品10μl；10×nebbufferii5.0μl；msei5u；psti5u；去离子水补至总体积50μl。上述条件于36℃保温2h，随后65℃水浴保温10min，停止酶切反应，2％的琼脂糖凝胶检测酶切效果，剩余产物-20℃保存。
(3)拳卷地钱基因组dna样品的酶切与接头的连接
酶切效果合格后进行以下程序：
msei和psti接头退火
分别用annealingbuffer溶解mseiadaptersensestrand和mseiadapterantisensestrand；吸取等摩尔上述两种溶液加入冻存管混合，5000rpm离心10s；65℃水浴保温10min，冷却。psti接头退火方法同上。
附：annealingbuffer:10mmtris·cl,ph7.5
100mmnaci
1mmedta，ph8.0
mseiadaptersensestrand的序列:5'-gagcaaggctctcacaaggacgaccgacgag-'3
mseiadapterantisensestrand的序列:5'phos-tactcgtcggtcgtccttgtgagagccttgct-'3
pstiadaptersensestrand的序列:5'-ctcggaagcctcagtcccagactgcgtacatgca-'3
pstiadapterantisensestrand的序列:5'phos-tgtacgcagtctggcactgcttccgaga-'3
dna样品的限制性双酶切
酶切体系：基因组dna样品20μl；msei0.5μl；psti0.5μl；10×nebbufferii5μl；bsa0.5μl；ddh2o50μl。混匀，离心，放入水浴箱37℃水浴2h。
dna酶切样品连接接头
吸取50pmolmsei和5pmolpsti接头加入dna中，45℃水浴5min。随后加入：10mg/mlbsa0.05μl、10×nebbufferii0.5μl、t41igase0.5μl、10mmdatp3.5μl、ddh20至60μl；5000rpm离心10s；37℃保温1h，室温放置2h。
(4)suppressionpcr和检测
反应体系：10×extaqbuffer2μl；25mmmgc121.5μl；己完成酶切和连接的dna样品4μl；dntpmix(各2.5mm)1.5μl；takaraextaqlu；mseisuppressorprimer5pmol；pstisuppressorprimer5pmol；ddh2o至20μl。5000rpm离心10s。按以下条件进行pcr扩增：94℃预变性1min；变性94℃1min，56℃复性1min，72℃延伸1min，25个循环后；72℃再延伸5min，4℃保存。
附:mseisuppressorprimer的序列:5'-gagcaaggctctcaca-'3
pstisuppressorprimer的序列:5'-ctcggaagcctcagtc-'3
(5)dna样品的预扩增和检测
预扩增反应体系：takaraextaq1u；10×extaqbuffer2μl；稀释好的suppressionpcr产物1μl；25mmmgc121.5μl；dntpmix(各2.5mm)1.5μl；mseiadapterprimer15pmol；pstiadapterprimer5pmol；ddh20至20μl。按以下条件扩增。
附：mseiadapterprimer1的序列：5'-gacgaccgacgagtaac-'3
pstiadapterprimer的序列：5'-agactgcgtacatgcagga-'3
(6)sam扩增
sam扩增反应体系：10×extaqbuffer2μl；稀释好的预扩增产物2μl；takaraextaqlu；25mmmgcl21.5μl；dntpmix(各2.5mm)1.5μl；mseiadapterprimer3(4～10)5pmol；ssrprimer(pct6)20pmol；加ddh20至20μl，然后按表1设置pcr扩增参数。扩增产物4℃贮存备用。
表1sampcr参数
附：采用的ssr引物——pct6是由两条等摩尔数的寡核甘酸所组成的混合物。
序列为:5’-kkvrvrvctctctctctct’-3
5’-kkrvrvrtctctctctctc’-3
mseiadapterprimer3的序列：5'-gacgaccgacgagtaacaa-‘3
mseiadapterprimer4的序列：5'-gacgaccgacgagtaacac-‘3
mseiadapterprimer5的序列：:5'-gacgaccgacgagtaacag-‘3
afseiadapterprimer6的序列：5'-gacgaccgacgagtaacat-‘3
afseiadapterprimer7的序列：5'-gacgaccgacgagtaacta-‘3
mseiadapterprimer8的序列：5'-gacgaccgacgagtaactc-‘3
mseiadapterprimer9的序列：5'-gacgaccgacgagtaactg-‘3
mseiadapterprimer10的序列：5'-gacgaccgacgagtaactt-‘3
(7)sam扩增产物的回收
将清晰的sam扩增产物的条带切下，转0.5ml的离心管；加入0.2ml去离子ddh2o浸泡胶条，浸泡lmin后，用移液枪吸干水分；将胶条尽量捣碎后加入50μl的无菌ddh2o浸泡1h；3000rpm，离心3min，取上清液2μl作为模板进行第二次sam扩增，反应体系和扩增参数同第一次；回收二次sam扩增产物。
(8)sam扩增产物的克隆
连接反应
根据宝生物工程(大连)有限公司生产的试剂盒的说明书，按程序将pmd18-tvector与pcr回收产物相连接。
感受态细胞的制备
从lb平板上用无菌牙签挑取新培养的单菌落，接种于25mllb液体培养基中，在震荡培养箱中恒温37℃，200rpm不间断振荡培养13h；灭菌的10ml离心管中转入培养液，冰浴冷却10min；4℃，8000rpm离心5min；去上清液，沉淀物加入10ml预冷的100mm的cac12溶液；冰浴30min，4℃，8000rpm离心5min，去上清；用600μl预冷的100mm的cac12溶液重悬沉淀物，4℃保存备用。
转化
在含有100μle.colixl1感受态细胞1.5ml离心管中加入10μl连接反应液，混均，埋入碎冰，冰浴30min；立即放入42℃水浴箱，热激处理90s，埋入冰中1-2min；吸取400μllb培养基转离心管，混匀，恒温培养箱37℃，200rpm震荡培养1h；无菌条件下吸取200μl转化液在lb固体平板(含100μg/mlamp)上均匀涂布，吹干后恒温培养箱37℃培养12-16h。重组子的菌液pcr鉴定
1mllb液培养基(含100μg/mlamp)的离心管，加入转化平板上单菌落，恒温培养箱37℃培养12-16h；反应体系:稀释好的预扩增产物2μl、10×extaqbuffer2μl、dntpmix(各2.5mm)1.5μl、takaraextaqlu、25mmmgcl21.5μl、mseiadapterprimer3(4～10)5pmol、ssrprimer(pct6)20pmol、无菌ddh2020μl；混匀后4500rpm离心10sec，放入pcr扩增仪，按表2pcr参数扩增，扩增后产物1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
重组子的穿刺培养
2ml穿刺管倒如lb固体培养基(含100μg/mlamp)，待凝固后，挑取重组子的菌液插入培养基中数次，37℃培养箱，过夜。测序由宝生物工程(大连)有限公司完成。
(9)有用引物的筛选
根据测序结果，特异引物采用primerpremier5.0软件设计。由上海生物工程技术服务有限公司合成。
以拳卷地钱的基因组dna为模板，使用特异引物，建立pcr反应体系：taqdnapolymerase1u、拳卷地钱的基因组dna(100ng/μl)2μl、10×pcrbuffer(sangon)2μl、25mmmgci21.2μl、dntpmixture(各10mm)0.4μl、specialprimer5pmol、ssrprimer(pct6)5pmol、无菌ddh2o20μl；混匀后5000rpm离心10s；pcr扩增，参数如表2，扩增产物2％琼脂糖电泳检测。
表2pcr扩增参数
2.结果
(1)拳卷地钱的基因组dna的提取
紫外分光光度计测定显示用改良的ctab法提取的拳卷地钱的基因组dna的od260/od280比值在1.80左右，od260/od230比值大于2.0，表明纯度比较高，同时经1％琼脂糖凝胶电泳检测，提取纯化后的拳卷地钱的基因组dna为一条清晰完整的带，没有拖带，没有可见的rna，且亮度高。
(2)dna的酶切及抑制性pcr、预扩增产物的检测
用限制性内切酶mseι和pstι对拳卷地钱的基因组dna进行双酶切，酶切产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测，在泳道中双酶切的dna呈片状弥散分布，其片段大小主要集中在大约100-1500bp范围内。抑制性pcr产物呈现为清晰可见的弥散片段，大小约100-1000bp。预扩增产物的扩增产物片段大小集中于150-800左右。
(3)sam扩增结果分析
通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将sam扩增产物分离，凝胶银染结果如图1:几乎在聚丙烯酰胺凝胶板的每个泳道均有10-30条清晰的条带，大小在50-700bp之间，不同泳道的扩增条带由于是用3′端含不同选择性碱基的msei接头引物扩增出来的，各泳道间的dna谱带都各不相同。
(4)sam扩增产物的回收与克隆
随机挑选200个大小不同的sam扩增片段，枪头压碎并用双蒸水浸泡离心，进行第二次sam扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳纯化，dna纯化试剂盒回收，回收的产物的2％琼脂糖凝胶电泳检测，各泳道只现出一条清晰的条带，片段大小约150bp。
回收产物通过与pmd18-tvector的连接，转入感受态细胞，经amp+lb平板筛选得到阳性克隆，随机从每个平板上挑选2个白色菌落。经菌液pcr检测，含有目的插入片段的重组子进行穿刺培养后寄出测序分析。总共克隆得到了100个sam片段用于测序。
(5)特异引物的设计
拳卷地钱ssr特异引物的设计是根据测序得到的dna片段中所含的ssr的侧翼序列采用primerpremier5.0软件设计特异引物，有些片段含引物间二聚体、发夹结构或因侧翼序列太短而无法设计出合适的引物，从86个片段中根据ssr位点的一侧或两侧序列设计了特异引物进行合成。
(6)有用引物的筛选
使用所设计的不同的ssr特异引物，与5′锚定兼并引物ssrprimer(pct6)组成引物对，以拳卷地钱的基因组dna为模板，经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出30对清晰条带的特异引物。