本发明涉及一种具有荧光标记的核酸分型标准物及其制备方法和应用。
背景技术：
：毛细管凝胶电泳技术(capillaryelectrophoresis,ce)又称高效毛细管电泳(hpce)或毛细管分离法(cesm)，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，当带电溶质在电场作用下通过凝胶的多孔性结构时，将会因溶质分子大小不同而产生不同的阻力，根据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。1987年，cohen发表了毛细管凝胶电泳的工作。电泳从凝胶板上转移到毛细管中以后，分析灵敏度提高到能检测一个碱基的变化，分离效率高达百万理论塔板数；分析片段能大能小，小到能分辨单个核苷酸的序列，大到能分离mb的dna；分析时间由原来的以小时计算缩减到以分、秒计算。被广泛用于dna片段大小分析，应用于测序、snp检测、法医dna分型等。核酸分型标准物是指一组分子量已知的dna分子的混合物，电泳后按照其分子量的大小和迁移率的不同，在凝胶上形成一个dna片段分布的梯度，用以指示电泳过程中的未知dna样本的分子量。与传统的分子量标准相比，核酸分型标准物(又称分子量内对照)与待测样品在同一泳道内电泳，二者运动规律完全一致，因此校对结果更加准确。结合毛细管凝胶电泳技术的高灵敏度、高分离效果，能够同时对大量差异不小于1bp的dna片段实现快速准确分离。目前市面上常用的分子量内标，如abi的liz-500，其由15条带有liz荧光素标记的双链dna片段组成(分子量分别是：50bp、75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、340bp、350bp、400bp、450bp、490bp和500bp)，其片段较少、部分区间的dna片段较稀疏。在str分型的过程中，由于遗传分析仪上buffer、pop胶和甲酰胺等可能出现过期或不合格现象，在复合扩增的片段较多的情况下，当扩增的片段比较大且大小相近且标记引物颜色相同时，不能保证单个碱基分辨率，导致分型不成功。技术实现要素：本发明的目的是提供一种具有荧光标记的核酸分型标准物及其制备方法和应用。本发明首先保护一种核酸电泳标准物，由20个dna片段组成；所述20个dna片段的末端均具有荧光染料标记；所述20个dna片段用于标识如下20种核酸大小：75bp、90bp、100bp、115bp、135bp、150bp、160bp、180bp、200bp、225bp、250bp、275bp、300bp、340bp、350bp、380bp、400bp、450bp、490bp、500bp。所述20个dna片段的5’末端均具有荧光染料标记。所述20个dna片段具体如下：80bp片段、95bp片段、105bp片段、119bp片段、138bp片段、152bp片段、162bp片段、182bp片段、202bp片段、227bp片段、253bp片段、278bp片段、303bp片段、342bp片段、352bp片段、383bp片段、403bp片段、453bp片段、493bp片段、503bp片段。所述20个dna片段具体如下：seqidno:22中第119-198位核苷酸所示dna片段、自上游至下游依次由seqidno:22中第119-208位核苷酸和“tcacc”组成的dna片段、自上游至下游依次由seqidno:22中第119-219位核苷酸和“aaac”组成的dna片段、自上游至下游依次由seqidno:22中第119-230位核苷酸和“tctgatc”组成的dna片段、自上游至下游依次由seqidno:22中第119-249位核苷酸和“tctgatc”组成的dna片段、自上游至下游依次由seqidno:22中第119-264位核苷酸和“cataat”组成的dna片段、自上游至下游依次由seqidno:22中第119-273位核苷酸和“tctgatc”组成的dna片段、seqidno:22中第119-300位核苷酸所示dna片段、自上游至下游依次由seqidno:22中第119-314位核苷酸和“accagc”组成的dna片段、seqidno:22中第119-345位核苷酸所示dna片段、自上游至下游依次由seqidno:22中第119-365位核苷酸和“ctgatc”组成的dna片段、自上游至下游依次由seqidno:22中第119-389位核苷酸和“tctgatc”组成的dna片段、自上游至下游依次由seqidno:22中第119-420位核苷酸和“t”组成的dna片段、自上游至下游依次由seqidno:22中第119-458位核苷酸和“ac”组成的dna片段、seqidno:22中第119-470位核苷酸所示dna片段、自上游至下游依次由seqidno:22中第119-499位核苷酸和“gt”组成的dna片段、自上游至下游依次由seqidno:22中第119-519位核苷酸和“gc”组成的dna片段、自上游至下游依次由seqidno:22中第119-564位核苷酸和“tctgatc”组成的dna片段、自上游至下游依次由seqidno:22中第119-604位核苷酸和“aatcggc”组成的dna片段、seqidno:22中第119-621位核苷酸所示dna片段。所述核酸电泳标准物为以下任一所述方法制备得到的核酸电泳标准物。本发明还保护一种用于制备核酸电泳标准物的试剂盒，包括模板质粒、引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12、引物对13、引物对14、引物对15、引物对16、引物对17、引物对18、引物对19和引物对20；所述模板质粒为具有seqidno:22中第119-621位核苷酸所示dna片段的质粒；引物对1由seqidno:1所示上游引物和seqidno:2所示下游引物组成；引物对2由seqidno:1所示上游引物和seqidno:3所示下游引物组成；引物对3由seqidno:1所示上游引物和seqidno:4所示下游引物组成；引物对4由seqidno:1所示上游引物和seqidno:5所示下游引物组成；引物对5由seqidno:1所示上游引物和seqidno:6所示下游引物组成；引物对6由seqidno:1所示上游引物和seqidno:7所示下游引物组成；引物对7由seqidno:1所示上游引物和seqidno:8所示下游引物组成；引物对8由seqidno:1所示上游引物和seqidno:9所示下游引物组成；引物对9由seqidno:1所示上游引物和seqidno:10所示下游引物组成；引物对10由seqidno:1所示上游引物和seqidno:11所示下游引物组成；引物对11由seqidno:1所示上游引物和seqidno:12所示下游引物组成；引物对12由seqidno:1所示上游引物和seqidno:13所示下游引物组成；引物对13由seqidno:1所示上游引物和seqidno:14所示下游引物组成；引物对14由seqidno:1所示上游引物和seqidno:15所示下游引物组成；引物对15由seqidno:1所示上游引物和seqidno:16所示下游引物组成；引物对16由seqidno:1所示上游引物和seqidno:17所示下游引物组成；引物对17由seqidno:1所示上游引物和seqidno:18所示下游引物组成；引物对18由seqidno:1所示上游引物和seqidno:19所示下游引物组成；引物对19由seqidno:1所示上游引物和seqidno:20所示下游引物组成；引物对20由seqidno:1所示上游引物和seqidno:21所示下游引物组成；每个引物对中，一条引物的5’末端具有荧光染料标记。每个引物对中，上游引物的5’末端具有荧光染料标记。所述模板质粒具体为seqidno:22所示的质粒pbr322。本发明还保护一种核酸电泳标准物的制备方法，包括如下步骤：以所述模板质粒为模板，进行20个体系的pcr扩增，得到20种扩增产物；所述20个体系的pcr扩增分别采用所述的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12、引物对13、引物对14、引物对15、引物对16、引物对17、引物对18、引物对19或引物对20；将20种扩增产物混合，得到核酸电泳标准物。本发明还保护一种核酸电泳标准物的制备方法，包括如下步骤：以所述模板质粒为模板，进行20个体系的pcr扩增，得到20种扩增产物；所述20个体系的pcr扩增分别采用所述的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12、引物对13、引物对14、引物对15、引物对16、引物对17、引物对18、引物对19或引物对20；将20种扩增产物分别进行dna纯化，得到20种纯化产物；将20种纯化产物混合，得到核酸电泳标准物。本发明还保护一种核酸电泳标准物的制备方法，包括如下步骤：以所述模板质粒为模板，进行20个体系的pcr扩增，得到20种扩增产物；所述20个体系的pcr扩增分别采用所述的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12、引物对13、引物对14、引物对15、引物对16、引物对17、引物对18、引物对19或引物对20；采用引物对1时扩增得到的dna片段命名为片段1，采用引物对2时扩增得到的dna片段命名为片段2，采用引物对3时扩增得到的dna片段命名为片段3，采用引物对4时扩增得到的dna片段命名为片段4，采用引物对5时扩增得到的dna片段命名为片段5，采用引物对6时扩增得到的dna片段命名为片段6，采用引物对7时扩增得到的dna片段命名为片段7，采用引物对8时扩增得到的dna片段命名为片段8，采用引物对9时扩增得到的dna片段命名为片段9，采用引物对10时扩增得到的dna片段命名为片段10，采用引物对11时扩增得到的dna片段命名为片段11，采用引物对12时扩增得到的dna片段命名为片段12，采用引物对13时扩增得到的dna片段命名为片段13，采用引物对14时扩增得到的dna片段命名为片段14，采用引物对15时扩增得到的dna片段命名为片段15，采用引物对16时扩增得到的dna片段命名为片段16，采用引物对17时扩增得到的dna片段命名为片段17，采用引物对18时扩增得到的dna片段命名为片段18，采用引物对19时扩增得到的dna片段命名为片段19，采用引物对20时扩增得到的dna片段命名为片段20；将20种扩增产物分别进行纯化，得到20种纯化产物；将20种纯化产物混合，得到核酸电泳标准物；所述核酸电泳标准物满足如下条件：将0.3μl核酸电泳标准物、1μl样本和8.7μl甲酰胺混合后进行毛细管凝胶电泳(具体可为毛细管变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)，片段1至片段20的峰值均为500-1000之间，并且片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8、片段9、片段10、片段11、片段12、片段13、片段14、片段15、片段16、片段17、片段18、片段19和片段20的目标峰值理论配比为1:1:1.5:1:1:1:1:1:1.5:1:1:1:1.5:1:1:1:1.5:1:1:1.5。本发明还保护一种核酸电泳标准物的制备方法，包括如下步骤：(1)以所述模板质粒为模板，进行20个体系的pcr扩增，得到20种扩增产物；所述20个体系的pcr扩增分别采用所述的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12、引物对13、引物对14、引物对15、引物对16、引物对17、引物对18、引物对19或引物对20；采用引物对1时扩增得到的dna片段命名为片段1，采用引物对2时扩增得到的dna片段命名为片段2，采用引物对3时扩增得到的dna片段命名为片段3，采用引物对4时扩增得到的dna片段命名为片段4，采用引物对5时扩增得到的dna片段命名为片段5，采用引物对6时扩增得到的dna片段命名为片段6，采用引物对7时扩增得到的dna片段命名为片段7，采用引物对8时扩增得到的dna片段命名为片段8，采用引物对9时扩增得到的dna片段命名为片段9，采用引物对10时扩增得到的dna片段命名为片段10，采用引物对11时扩增得到的dna片段命名为片段11，采用引物对12时扩增得到的dna片段命名为片段12，采用引物对13时扩增得到的dna片段命名为片段13，采用引物对14时扩增得到的dna片段命名为片段14，采用引物对15时扩增得到的dna片段命名为片段15，采用引物对16时扩增得到的dna片段命名为片段16，采用引物对17时扩增得到的dna片段命名为片段17，采用引物对18时扩增得到的dna片段命名为片段18，采用引物对19时扩增得到的dna片段命名为片段19，采用引物对20时扩增得到的dna片段命名为片段20；(2)将20种扩增产物分别进行纯化，得到20种纯化产物；(3)步骤(2)得到的20种纯化产物，各取1μl并混合，得到20μl液体，然后用tebuffer稀释至600μl，记为稀释液1；(4)将8.7μl甲酰胺、0.3μl稀释液1和1μl样本混合后点样，进行毛细管凝胶电泳(具体可为毛细管变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)；(5)根据步骤(4)的电泳结果，分别统计20个片段的峰值，计算新加液量；某一片段的新加液量＝该片段的目标峰值×该片段在步骤(3)中的加液量÷该片段步骤(4)的电泳中显示的峰值；各片段的目标峰值均为500-1000之间；片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8、片段9、片段10、片段11、片段12、片段13、片段14、片段15、片段16、片段17、片段18、片段19和片段20的目标峰值理论配比为1:1:1.5:1:1:1:1:1:1.5:1:1:1:1.5:1:1:1:1.5:1:1:1.5；各片段在步骤(3)中的加液量均为1μl；(6)步骤(2)得到的20种纯化产物，分别按照步骤(5)计算的新加液量取液并混合，然后用tebuffer稀释至600μl，记为稀释液2；稀释液2即为核酸电泳标准物。以上任一所述目标峰值理论配比可允许15％以下的偏差。以上任一所述目标峰值理论配比可允许5％以下的偏差。以上任一所述目标峰值理论配比可允许5-15％的偏差。以上任一所述方法中，所述pcr扩增的扩增体系具体见表2。以上任一所述方法中，所述pcr扩增的扩增程序具体见表3。本发明还保护以上任一所述方法制备得到的核酸电泳标准物。以上任一所述核酸电泳标准物为毛细管电泳中的核酸标准物。以上任一所述核酸电泳标准物为毛细管凝胶电泳中的核酸标准物。以上任一所述核酸电泳标准物为毛细管变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的核酸标准物。以上任一所述核酸电泳标准物为毛细管电泳中用于核酸分型的核酸标准物。以上任一所述核酸电泳标准物为毛细管凝胶电泳中用于核酸分型的核酸标准物。以上任一所述核酸电泳标准物为毛细管变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中用于核酸分型的核酸标准物。以上任一所述荧光染料为liz、fam、hex、rox或tamra。本发明还保护以上任一所述核酸电泳标准物在毛细管电泳中的应用。所述应用中，核酸电泳标准物作为内标。所述应用中，核酸电泳标准物作为核酸分型的核酸标准物。所述毛细管电泳为毛细管凝胶电泳。所述毛细管电泳为毛细管变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。所述应用中，核酸电泳标准物、样本和甲酰胺的体积配比为：0.3：1μl：8.7。所述应用中，将0.3μl核酸电泳标准物、1μl样本和8.7μl甲酰胺混合后进行毛细管电泳。本发明还保护以上任一所述核酸电泳标准物作为核酸分型标准物的应用。所述应用中，核酸电泳标准物作为毛细管电泳中的核酸分型标准物。所述应用中，核酸电泳标准物作为毛细管凝胶电泳中的核酸分型标准物。所述应用中，核酸电泳标准物作为毛细管变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的核酸分型标准物。所述应用中，核酸电泳标准物、样本和甲酰胺的体积配比为：0.3：1μl：8.7。所述应用中，将0.3μl核酸电泳标准物、1μl样本和8.7μl甲酰胺混合后进行电泳。采用本发明提供的方法制备具有荧光标记的核酸分型标准物，扩增效率高、生产成本低，适合大批量生产。本发明提供的具有荧光标记的核酸分型标准物，标准片段的数量增多，提高了内标校准能力，减少了偏差，校准结果更加准确。附图说明图1为实施例2中控制各片段的目标峰值为理论配比但未控制各片段目标峰值均为500-1000之间的结果。图2为实施例2中控制各片段的目标峰值为理论配比且控制各片段目标峰值均为500-1000之间的结果。图3为实施例3中人类dna分型盒中的“allelicladder”作为样本，96次电泳的结果图。图4为实施例3中人类dna分型盒(炎黄)中的“allelicladder(yh)”作为样本，96次电泳的结果图。图5为根据图3计算的核酸分型标准物线性方程图。图6为实施例3中人类dna分型盒中的“allelicladder”作为样本，某一次电泳检测的电泳图。图7为实施例4中人类strtyper-21g扩增荧光检测试剂盒中的“strtyper-21gallelicladder”作为样本，某一次电泳检测的电泳图。图8为实施例4中goldeneye20am复合扩增检测试剂中的“等位基因阶梯20a”作为样本，某一次电泳检测的电泳图。图9为实施例4中microreadertm21(direct)idsystem中的“21idallelicladder”作为样本，某一次电泳检测的电泳图见图9。图10为实施例4中动物dna片段大小分析的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的电泳均为毛细管电泳。实施例中的电泳均采用abi3500基因分析仪。普通dna产物纯化试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司，货号dp204-03。人类dna分型盒：深圳华大法医科技有限公司，货号fgi1902。人类dna分型盒中含有组分“allelicladder”。人类dna分型盒(炎黄)(含等位基因阶梯物)：深圳华大法医科技有限公司，货号fgi1905。人类dna分型盒(炎黄)中含有组分“allelicladder(yh)(等位基因阶梯物yh)”。人类strtyper-21g扩增荧光检测试剂盒：海尔施基因科技，货号1060140。人类strtyper-21g扩增荧光检测试剂盒中含有组分“strtyper-21gallelicladder(等位基因分型标准参照物)”。goldeneye20am复合扩增检测试剂：基点认知技术有限公司，货号ge2001-200m。goldeneye20am复合扩增检测试剂中含有组分“等位基因阶梯20a”。microreadertm21(direct)idsystem：阅微基因技术有限公司，货号10403003。microreadertm21(direct)idsystem中含有组分“21idallelicladder”。实施例1、引物的设计和制备质粒pbr322如seqidno:22所示。设计上游引物。采用荧光染料liz标记上游引物(实际操作用，采用fam、hex、rox、tamra等荧光染料均可)。上游引物(seqidno:1)：5’-tcctctacgccggacgca-3’。根据预期扩增片段的长度设计初始下游引物。通过预实验验证下游引物的效果，对下游引物的5’末端进行改造(提高引物特异性，避免复杂二级结构、发夹结构、引物间的二聚体)，得到改造后的下游引物。改造后的下游引物见表1。表1实施例2、标准品的制备1、以质粒pbr322为模板，分别采用20个pcr体系进行pcr扩增。pcr体系1中，采用seqidno:1所示的上游引物和seqidno:2所示的下游引物；pcr体系2中，采用seqidno:1所示的上游引物和seqidno:3所示的下游引物；依次类推；pcr体系20中，采用seqidno:1所示的上游引物和seqidno:21所示的下游引物。采用abi9700pcr扩增仪。每个pcr扩增体系相同，均为10μl体积，具体见表2。表2每个pcr扩增程序相同，具体见表3。表32、pcr扩增产物含有蛋白质和盐离子，会导致dna片段降解，不利于长期保存，因此需将其纯化去除杂质。采用普通dna产物纯化试剂盒分别纯化步骤1得到的20组pcr扩增产物(按试剂盒说明书操作)。每种pcr扩增产物得到30-50μl纯化产物。3、步骤2得到的20种纯化产物，各取1μl并混合，得到20μl液体，然后用tebuffer稀释至600μl，记为稀释液1。4、将8.7μl甲酰胺、0.3μl稀释液1和1μl样本(实际检测中的任意要进行电泳的样本均可，例如pcr扩增产物，本实施例中具体采用人类dna分型盒中的“allelicladder”)混合后点样，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。参数设置见表4。表4上样电压1kv上样时间15s电泳电压15kv电泳时间1400s5、根据步骤4的电泳结果，分别统计20个片段(片段1至片段20)的峰值，计算新加液量。某一片段的新加液量＝该片段的目标峰值×该片段在步骤3中的加液量÷该片段步骤4的电泳中显示的峰值。各扩增片段的目标峰值均为500-1000之间。片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8、片段9、片段10、片段11、片段12、片段13、片段14、片段15、片段16、片段17、片段18、片段19和片段20的目标峰值理论配比为1:1:1.5:1:1:1:1:1:1.5:1:1:1:1.5:1:1:1:1.5:1:1:1.5，允许15％以下的偏差。各片段在步骤3中的加液量均为1μl。6、步骤2得到的20种纯化产物，分别按照步骤5计算的新加液量取液并混合，然后用tebuffer稀释至600μl，记为稀释液2。图1为控制各片段的目标峰值为理论配比但未控制各片段目标峰值均为500-1000之间的结果。图2为控制各片段的目标峰值为理论配比且控制各片段目标峰值均为500-1000之间的结果。稀释液2即为本发明制备的核酸分型标准物。实施例3、本发明制备的核酸分型标准物作为内标分析基因片段的准确度人类dna分型盒中的“allelicladder”作为样本。将1μl样本、8.7μl甲酰胺和0.3μl实施例2制备的核酸分型标准物混合，然后采用人类dna分型盒并按照说明书将混合物上样，重复进行96次变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。分析“allelicladder”中每个位点的每个基因型的每个数值，取平均数并计算标准偏差(sd)，sd的值小于0.1个碱基。用genemapper-idx分析，sizecallingcurve中的bestfitsecondordercurve的r2>0.99999。r2体现了分型标准物的线性关系，r2越接近1，线性关系越高，分型标准物精确度更高。理论上，在特定区间内，随着片段数量的增加，分型标准物的精确度也相应提高，实际上，在增加片段数量的基础上，r2值趋于1的难度也相应增加。96次电泳的结果图见图3，横坐标表示核酸的大小(bp)，纵坐标表示的是总体标准偏差(sd)，圆点表示的是每个ladder片段。某一次电泳检测的电泳图见图6，1-4行是人类dna分型盒中的“allelicladder”，第5行是实施例2制备的核酸分型标准物，图中显示所有ladder正确分型。根据图3，软件genemapperid-x中localsouthernmethod方法计算的核酸分型标准物线性方程图见图5。人类dna分型盒(炎黄)中的“allelicladder(yh)”作为样本。将1μl样本、8.7μl甲酰胺和0.3μl实施例2制备的核酸分型标准物混合，然后采用人类dna分型盒(炎黄)并按照说明书将混合物上样，重复进行96次变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。分析“allelicladder”中每个位点的每个基因型的每个数值，取平均数并计算标准偏差(sd)，sd的值小于0.1个碱基。用genemapper-idx分析，sizecallingcurve中的bestfitsecondordercurve的r2>0.99999。r2体现了分型标准物的线性关系，r2越接近1，线性关系越高，分型标准物精确度更高。理论上，在特定区间内，随着片段数量的增加，分型标准物的精确度也相应提高，实际上，在增加片段数量的基础上，r2值趋于1的难度也相应增加。96次电泳的结果图见图4，横坐标表示核酸的大小(bp)，纵坐标表示的是总体标准偏差(sd)，圆点表示的是每个ladder片段。实施例4、本发明制备的核酸分型标准物作为内标分析基因片段的适用性人类strtyper-21g扩增荧光检测试剂盒中的“strtyper-21gallelicladder”作为样本。将1μl样本、8.7μl甲酰胺和0.3μl实施例2制备的核酸分型标准物混合，然后采用人类strtyper-21g扩增荧光检测试剂盒并按照说明书将混合物上样，重复进行16次变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。对比每个位点的分型结果。分析ladder中每个位点的每个基因型的数值，取平均数并计算标准偏差(sd)，sd的值小于0.1个碱基。某一次电泳检测的电泳图见图7，1-4行是人类strtyper-21g扩增荧光检测试剂盒中的“strtyper-21gallelicladder”，第5行是实施例2制备的核酸分型标准物，图中显示所有ladder片段正确分型。人类strtyper-21g扩增荧光检测试剂盒中的“strtyper-21gallelicladder”正确分型。goldeneye20am复合扩增检测试剂中的“等位基因阶梯20a”作为样本。将1μl样本、8.7μl甲酰胺和0.3μl实施例2制备的核酸分型标准物混合，然后采用goldeneye20am复合扩增检测试剂并按照说明书将混合物上样，重复进行16次变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。对比每个位点的分型结果。分析ladder中每个位点的每个基因型的数值，取平均数并计算标准偏差(sd)，sd的值小于0.1个碱基。某一次电泳检测的电泳图见图8，1-4行是goldeneye20am复合扩增检测试剂中的“等位基因阶梯20a”，第5行是实施例2制备的核酸分型标准物，图中显示所有ladder片段正确分型。goldeneye20am复合扩增检测试剂中的“等位基因阶梯20a”正确分型。microreadertm21(direct)idsystem中的“21idallelicladder”作为样本。将1μl样本、8.7μl甲酰胺和0.3μl实施例2制备的核酸分型标准物混合，然后采用microreadertm21(direct)idsystem并按照说明书将混合物上样，重复进行16次变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。对比每个位点的分型结果。分析ladder中每个位点的每个基因型的数值，取平均数并计算标准偏差(sd)，sd的值小于0.1个碱基。某一次电泳检测的电泳图见图9，1-4行是microreadertm21(direct)idsystem中的“21idallelicladder”，第5行是实施例2制备的核酸分型标准物，图中显示所有ladder片段正确分型。microreadertm21(direct)idsystem中的“21idallelicladder”正确分型。犬的扩增产物作为样本。将1μl样本、8.7μl甲酰胺和0.3μl实施例2制备的核酸分型标准物混合，重复进行16次变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。对比每次片段大小的数据结果，取平均数并计算标准偏差(sd)，sd的值小于0.1个碱基。动物dna片段大小分析的结果见图10，第1,2行表示不同的动物样本，第3行是实施例2制备的核酸分型标准物。正确分析扩增产物的片段大小。可以理解的是，上面的描述仅是本发明的示例，因而本发明权利要求所保护的范围并不仅仅以此处公开的特定实施方案来限定。任何等同的实施方案将被认为在本发明的范围之内。事实上，根据前面的描述，对本发明进行有关的修改，调整，添加和替换对于本领域技术人员来讲都将是可能的，因此，这种修改和变化也将落在本发明所附的权利要求的范围之内。sequencelisting<110>深圳华大法医科技有限公司<120>一种具有荧光标记的核酸分型标准物及其制备方法和应用<130>gncyx172009<160>22<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>artificialsequence<400>1tcctctacgccggacgca18<210>2<211>20<212>dna<213>artificialsequence<400>2ggtgatgtcggcgatatagg20<210>3<211>25<212>dna<213>artificialsequence<400>3ggtgacttccccatcggtgatgtcg25<210>4<211>21<212>dna<213>artificialsequence<400>4gtttgcgagcccgatcttccc21<210>5<211>27<212>dna<213>artificialsequence<400>5gatcagaagcccgaagtggcgagcccg27<210>6<211>26<212>dna<213>artificialsequence<400>6gatcagagccgaaacaagcgctcatg26<210>7<211>25<212>dna<213>artificialsequence<400>7attatgtgccaccatacccacgccg25<210>8<211>27<212>dna<213>artificialsequence<400>8gatcagacacggggcctgccaccatac27<210>9<211>17<212>dna<213>artificialsequence<400>9ggagatggcgcccaaca17<210>10<211>27<212>dna<213>artificialsequence<400>10gctggtaatggtgcatgcaaggagatg27<210>11<211>18<212>dna<213>artificialsequence<400>11gttgaggccgttgagcac18<210>12<211>26<212>dna<213>artificialsequence<400>12gatcagaggaagcagcccagtagtag26<210>13<211>27<212>dna<213>artificialsequence<400>13gatcagatctcccttatgcgactcctg27<210>14<211>22<212>dna<213>artificialsequence<400>14agttgaaggctctcaagggcat22<210>15<211>20<212>dna<213>artificialsequence<400>15gtatagtcatgccccgcgcc20<210>16<211>17<212>dna<213>artificialsequence<400>16agtgcggcgacgatagt17<210>17<211>20<212>dna<213>artificialsequence<400>17accgagttgcatgataaaga20<210>18<211>23<212>dna<213>artificialsequence<400>18gccgctgccggcacctgtcctac23<210>19<211>28<212>dna<213>artificialsequence<400>19gatcagacgtcgcgctccagcgaaagcg28<210>20<211>26<212>dna<213>artificialsequence<400>20gccgattcgtgcaagattccgaatac26<210>21<211>20<212>dna<213>artificialsequence<400>21gaaggcttgagcgagggcgt20<210>22<211>4361<212>dna<213>artificialsequence<400>22tgcgcacccgttctcggagcactgtccgaccgctttggccgccgcccagtcctgctcgct60tcgctacttggagccactatcgactacgcgatcatggcgaccacacccgtcctgtggatc120ctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcc180tatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgct240tgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctcc300ttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgc360ttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaccgatgcccttgagagccttcaac420ccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtc480ttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgag540gaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttg600cacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcag660gccattatcgccggcatggcggccgacgcgctgggctacgtcttgctggcgttcgcgacg720cgaggctggatggccttccccattatgattcttctcgcttccggcggcatcgggatgccc780gcgttgcaggccatgctgtccaggcaggtagatgacgaccatcagggacagcttcaagga840tcgctcgcggctcttaccagcctaacttcgatcactggaccgctgatcgtcacggcgatt900tatgccgcctcggcgagcacatggaacgggttggcatggattgtaggcgccgccctatac960cttgtctgcctccccgcgttgcgtcgcggtgcatggagccgggccacctcgacctgaatg1020gaagccggcggcacctcgctaacggattcaccactccaagaattggagccaatcaattct1080tgcggagaactgtgaatgcgcaaaccaacccttggcagaacatatccatcgcgtccgcca1140tctccagcagccgcacgcggcgcatctcgggcagcgttgggtcctggccacgggtgcgca1200tgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagc1260agaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcga1320cctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcgga1380agtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccct1440gtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctct1500ggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcat1560gttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattaccc1620ccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgccc1680ttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagc1740tggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagcttt1800accgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcc1860cggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcg1920cgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcg1980gagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatat2040gcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgc2100ttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctca2160ctcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtg2220agcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttcca2280taggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaa2340cccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcc2400tgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggc2460gctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagct2520gggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcg2580tcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacag2640gattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaacta2700cggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcgg2760aaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttt2820tgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatctt2880ttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgag2940attatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaat3000ctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacc3060tatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagat3120aactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagaccc3180acgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcag3240aagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctag3300agtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgt3360ggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcg3420agttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgt3480tgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattc3540tcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtc3600attctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaacacgggataa3660taccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcg3720aaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacc3780caactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaag3840gcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactctt3900cctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatt3960tgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgcc4020acctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcac4080gaggccctttcgtcttcaagaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttaat4140gcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcaggcaccgtgtatgaaatctaaca4200atgcgctcatcgtcatcctcggcaccgtcaccctggatgctgtaggcataggcttggtta4260tgccggtactgccgggcctcttgcgggatatcgtccattccgacagcatcgccagtcact4320atggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatgcaatttcta4361当前第1页12