一种具有还原响应性的水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针的制备方法与流程

本发明涉及一种具有还原响应性和聚集诱导发光特性的水溶性壳聚糖基荧光探针(TPE-CS-ss-COOH)的制备方法。

背景技术：

荧光探针是以荧光物质作为指示剂，并在一定波长光的激发下使指示剂产生荧光，通过检测所产生的荧光实现对被检测物质的定性或者定量分析。当前，荧光探针主要应用于生物、医学和环境监测等领域。然而传统的荧光探针面临着聚集诱导淬灭(ACQ)效应和细胞毒性两大问题。聚集诱导发光(AIE)荧光分子的发现无疑提供了一种解决上述问题的思路。在生化检测领域，使用具有AIE特性的荧光探针可实现高灵敏度特异性检测，且AIE体系对细胞生理学及增殖影响不大。但是，AIE体系多为共轭类带有疏水芳香核的分子，不溶于生理水环境，且小分子荧光探针容易从细胞渗透、泄露，继而引起检测误差等问题，因此水溶性大分子AIE荧光探针的研发具有重要意义。

壳聚糖(CS)作为一种富含氨基的天然多糖，具有良好的生物相容性和生物活性，无毒且易于生物降解，被广泛应用于生物医学领域。然而，由于分子内和分子间的氢键作用，壳聚糖不溶于纯水和常见有机溶剂，可通过在壳聚糖分子链上引入亲水性基团(如羧基、季铵盐等)破坏分子内和分子间氢键从而改善其水溶性。

基于肿瘤细胞与正常细胞之间还原型谷胱甘肽(GSH)浓度的显著性差异，在壳聚糖分子链中引入带有双硫键结构的羧酸基团，可使设计得到的分子具有良好的水溶性和还原响应性，通过聚集诱导发光荧光基团进一步标记可获得具有还原响应性的水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针。该探针被肿瘤细胞胞吞后，由于胞内高浓度GSH与分子链上的双硫键反应，双硫键断裂脱去羧基降低其水溶性，粒子发生进一步团聚，从而增强其聚集诱导发光强度，实现肿瘤细胞的特异性示踪，可拓展壳聚糖在生物检测领域中的应用。因此，制备一种具有还原响应性的水溶性壳聚糖基荧光探针分子具有重要的科学意义和良好的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具有还原响应性的水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针的制备方法。

本发明涉及一种具有还原响应性的水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

1)称取一定质量粘均分子量为1万-100万、脱乙酰度60％-95％的壳聚糖为溶质，以0.1mol/L的HCl溶液为溶剂，配制获得壳聚糖浓度为0.01-0.05g/mL的溶液A；

2)以无水甲醇为溶剂，配制浓度为0.01－0.05g/mL的二硫代二丙酸(DTDP)溶液，并使DTDP与溶液A中壳聚糖链上的氨基摩尔比为1:1-2:1，加入一定量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，使DTDP与EDC的摩尔比为1:1.2-1:2，且EDC与NHS的摩尔比为1:1-1:1.5，在0-4℃冰浴条件下于无水甲醇中活化0.5-2h，获得溶液B；

3)采用恒压滴液漏斗向溶液B中滴加溶液A，用1mol/L NaOH调节体系pH＝4-5，室温条件下反应24-48h，旋蒸(通常为50-90℃)除去甲醇得浓缩液，加入体积为浓缩液5-7倍的水，过滤(或离心)除去不溶物，获得溶液C；

4)将溶液C装入截留分子量为14000的透析袋中并置于去离子水中透析3-5天，取出透析后的溶液C冻干，获得具有还原响应性的水溶性壳聚糖样品D；

5)以具有还原响应性的水溶性壳聚糖样品D为溶质，以DMSO为溶剂，在50-65℃溶胀24-48h，再向该溶液中加入TPEITC(含异硫氰酸酯官能团的四苯基乙烯衍生物)，TPEITC与样品D中氨基的摩尔比为1％-20％，反应24-48h，获得溶液E；

6)向溶液E中加入无水乙醇，无水乙醇与溶液E的体积比为20，搅拌均匀后静置至溶液分层，去除上清液，离心后，将沉淀用去离子水溶解，过滤得到滤液；

7)将四氢呋喃和去离子水以体积比1:1混合配制透析液，将步骤6)的滤液装入截留分子量为3500的透析袋中并置于透析液中透析5-7天，取出后冻干，获得具有还原响应性的水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针。

该荧光探针的结构如下：

其中，x₁为TPE接枝率，m为1-壳聚糖的脱乙酰度，y为羧化度，且x₁+x₂+m+y为1。

本发明采用盐酸/甲醇混合溶剂体系和EDC/NHS催化体系对壳聚糖分子进行双硫羧化改性，从而制得双硫键连接的羧化壳聚糖CS-ss-COOH；再通过将四苯基乙烯(TPE)荧光分子标记到CS-ss-COOH链上得到具有还原响应性和AIE特性的TPE-CS-ss-COOH。本发明产物TPE-CS-ss-COOH的合成线路如图1所示，产物TPE-CS-ss-COOH的化学式和¹H核磁共振谱图如图2所示。

本发明制得的荧光探针具有很好的还原响应性和水溶性，且具有聚集诱导发光特性，与传统荧光探针相比，不仅具有灵敏度高，光稳定性好，高浓度时无淬灭，荧光光谱不漂移等优点，在谷胱甘肽溶液中还可实现荧光强度的进一步增强，成像效果佳，有望应用于肿瘤细胞特异性示踪、细胞代谢检测、药物代谢检测、环境监测等领域。

附图说明

图1是具有还原响应性的水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针分子合成路线示意图。

图2是具有还原响应性的水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针分子式和¹H核磁共振谱图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实例进一步说明本发明。

实施例1：

1)称取1g壳聚糖(粘均分子量为1万，脱乙酰度60％)加入到100mL烧杯中，向烧杯中加入50mL的0.1mol/L的HCl溶液，搅拌均匀后获得壳聚糖浓度为0.02g/mL的溶液A；

2)称取一定质量的二硫代二丙酸(DTDP)加入到三颈烧瓶中，使DTDP与壳聚糖链上的氨基摩尔比为1:1，再加入一定量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，使DTDP与EDC的摩尔比为1:1.2，且EDC与NHS的摩尔比为1:1，向三颈烧瓶中加入适量无水甲醇，使DTDP浓度为0.01g/mL，在0℃冰浴条件下活化0.5h，获得溶液B；

3)采用恒压滴液漏斗向溶液B中滴加溶液A，用1mol/L NaOH调节体系pH＝4.0，室温条件下反应24h，旋蒸(50℃)除去甲醇，加入5倍的水，过滤(离心)除去不溶物，获得溶液C；

4)将溶液C装入截留分子量为14000的透析袋中并置于去离子水中透析3天，取出透析后的溶液C冻干，获得具有还原响应性的水溶性壳聚糖样品D；

5)称取0.5g具有还原响应性的水溶性壳聚糖样品D，加入5mL DMSO，在50℃溶胀24h，再向该溶液中加入TPEITC(含异硫氰酸酯官能团的四苯基乙烯衍生物)，TPEITC与样品D中氨基的摩尔比为1％，反应24h，获得溶液E；

6)向溶液E中加入100mL无水乙醇，无水乙醇与溶液E的体积比为20，搅拌均匀后静置至溶液分层，去除上清液，离心后，将沉淀用去离子水溶解，过滤得到滤液；

7)将四氢呋喃和去离子水以体积比1:1混合配制透析液，将步骤6)的滤液装入截留分子量为3500的透析袋中并置于透析液中透析5天，取出后冻干，获得具有还原响应性的水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针。

本例制得的TPE-CS-ss-COOH荧光探针TPE标记率为1.68％，羧化度为13.8％。

实施例2：

1)称取2g壳聚糖(粘均分子量为10万，脱乙酰度65％)加入到100mL烧杯中，向烧杯中加入50mL的0.1mol/L的HCl溶液，搅拌均匀后获得壳聚糖浓度为0.04g/mL的溶液A；

2)称取一定质量的二硫代二丙酸(DTDP)加入到三颈烧瓶中，使DTDP与壳聚糖链上的氨基摩尔比为1.2:1，再加入一定量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，使DTDP与EDC的摩尔比为1:1.4，且EDC与NHS的摩尔比为1:1.4，向三颈烧瓶中加入适量无水甲醇，使DTDP浓度为0.02g/mL，在2℃冰浴条件下活化1h，获得溶液B；

3)采用恒压滴液漏斗向溶液B中滴加溶液A，用1mol/L NaOH调节体系pH＝4.5，室温条件下反应24h，旋蒸(80℃)除去甲醇，加入6倍的水，过滤(离心)除去不溶物，获得溶液C；

4)将溶液C装入截留分子量为14000的透析袋中并置于去离子水中透析3天，取出透析后的溶液C冻干，获得具有还原响应性的水溶性壳聚糖样品D；

5)称取0.5g具有还原响应性的水溶性壳聚糖样品D，加入5mL DMSO，在55℃溶胀24h，再向该溶液中加入TPEITC(含异硫氰酸酯官能团的四苯基乙烯衍生物)，TPEITC与样品D中氨基的摩尔比为8％，反应24h，获得溶液E；

6)向溶液E中加入100mL无水乙醇，无水乙醇与溶液E的体积比为20，搅拌均匀后静置至溶液分层，去除上清液，离心后，将沉淀用去离子水溶解，过滤得到滤液；

7)将四氢呋喃和去离子水以体积比1:1混合配制透析液，将步骤6)的滤液装入截留分子量为3500的透析袋中并置于透析液中透析5天，取出后冻干，获得具有还原响应性的水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针。

本例制得的TPE-CS-ss-COOH荧光探针TPE标记率为2.35％，羧化度为20.5％。

实施例3：

1)称取0.5g壳聚糖(粘均分子量为30万，脱乙酰度70％)加入到100mL烧杯中，向烧杯中加入50mL的0.1mol/L的HCl溶液，搅拌均匀后获得壳聚糖浓度为0.01g/mL的溶液A；

2)称取一定质量的二硫代二丙酸(DTDP)加入到三颈烧瓶中，使DTDP与壳聚糖链上的氨基摩尔比为1.4:1，再加入一定量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，使DTDP与EDC的摩尔比为1:1.6，且EDC与NHS的摩尔比为1:1.1，向三颈烧瓶中加入适量无水甲醇，使DTDP浓度为0.02g/mL，在1℃冰浴条件下活化1.5h，获得溶液B；

3)采用恒压滴液漏斗向溶液B中滴加溶液A，用1mol/L NaOH调节体系pH＝4.8，室温条件下反应36h，旋蒸(90℃)除去甲醇，加入7倍的水，过滤(离心)除去不溶物，获得溶液C；

4)将溶液C装入截留分子量为14000的透析袋中并置于去离子水中透析3天，取出透析后的溶液C冻干，获得具有还原响应性的水溶性壳聚糖样品D；

5)称取0.5g具有还原响应性的水溶性壳聚糖样品D，加入5mL DMSO，在55℃溶胀36h，再向该溶液中加入TPEITC(含异硫氰酸酯官能团的四苯基乙烯衍生物)，TPEITC与样品D中氨基的摩尔比为10％，反应36h，获得溶液E；

6)向溶液E中加入100mL无水乙醇，无水乙醇与溶液E的体积比为20，搅拌均匀后静置至溶液分层，去除上清液，离心后，将沉淀用去离子水溶解，过滤得到滤液；

7)将四氢呋喃和去离子水以体积比1:1混合配制透析液，将步骤6)的滤液装入截留分子量为3500的透析袋中并置于透析液中透析6天，取出后冻干，获得具有还原响应性的水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针。

本例制得的TPE-CS-ss-COOH荧光探针TPE标记率为3.95％，羧化度为28.5％。

实施例4：

1)称取1.5g壳聚糖(粘均分子量为80万，脱乙酰度80％)加入到100mL烧杯中，向烧杯中加入50mL的0.1mol/L的HCl溶液，搅拌均匀后获得壳聚糖浓度为0.03g/mL的溶液A；

2)称取一定质量的二硫代二丙酸(DTDP)加入到三颈烧瓶中，使DTDP与壳聚糖链上的氨基摩尔比为1.6:1，再加入一定量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，使DTDP与EDC的摩尔比为1:1.8，且EDC与NHS的摩尔比为1:1.2，向三颈烧瓶中加入适量无水甲醇，使DTDP浓度为0.03g/mL，在4℃冰浴条件下活化1h，获得溶液B；

3)采用恒压滴液漏斗向溶液B中滴加溶液A，用1mol/L NaOH调节体系pH＝5.0，室温条件下反应36h，旋蒸(80℃)除去甲醇，加入5倍的水，过滤(离心)除去不溶物，获得溶液C；

4)将溶液C装入截留分子量为14000的透析袋中并置于去离子水中透析4天，取出透析后的溶液C冻干，获得具有还原响应性的水溶性壳聚糖样品D；

5)称取0.5g具有还原响应性的水溶性壳聚糖样品D，加入5mL DMSO，在60℃溶胀24h，再向该溶液中加入TPEITC(含异硫氰酸酯官能团的四苯基乙烯衍生物)，TPEITC与样品D中氨基的摩尔比为15％，反应48h，获得溶液E；

6)向溶液E中加入100mL无水乙醇，无水乙醇与溶液E的体积比为20，搅拌均匀后静置至溶液分层，去除上清液，离心后，将沉淀用去离子水溶解，过滤得到滤液；

7)将四氢呋喃和去离子水以体积比1:1混合配制透析液，将步骤6)的滤液装入截留分子量为3500的透析袋中并置于透析液中透析7天，取出后冻干，获得具有还原响应性的水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针。

本例制得的TPE-CS-ss-COOH荧光探针TPE标记率为7.32％，羧化度为35.8％。

实施例5：

1)称取2.5g壳聚糖(粘均分子量为100万，脱乙酰度95％)加入到100mL烧杯中，向烧杯中加入50mL的0.1mol/L的HCl溶液，搅拌均匀后获得壳聚糖浓度为0.05g/mL的溶液A；

2)称取一定质量的二硫代二丙酸(DTDP)加入到三颈烧瓶中，使DTDP与壳聚糖链上的氨基摩尔比为2:1，再加入一定量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，使DTDP与EDC的摩尔比为1:2，且EDC与NHS的摩尔比为1:1.5，向三颈烧瓶中加入适量无水甲醇，使DTDP浓度为0.05g/mL，在3℃冰浴条件下活化2h，获得溶液B；

3)采用恒压滴液漏斗向溶液B中滴加溶液A，用1mol/L NaOH调节体系pH＝4.2，室温条件下反应48h，旋蒸(75℃)除去甲醇，加入7倍的水，过滤(离心)除去不溶物，获得溶液C；

4)将溶液C装入截留分子量为14000的透析袋中并置于去离子水中透析5天，取出透析后的溶液C冻干，获得具有还原响应性的水溶性壳聚糖样品D；

5)称取0.5g具有还原响应性的水溶性壳聚糖样品D，加入5mL DMSO，在65℃溶胀48h，再向该溶液中加入TPEITC(含异硫氰酸酯官能团的四苯基乙烯衍生物)，TPEITC与样品D中氨基的摩尔比为20％，反应48h，获得溶液E；

6)向溶液E中加入100mL无水乙醇，无水乙醇与溶液E的体积比为20，搅拌均匀后静置至溶液分层，去除上清液，离心后，将沉淀用去离子水溶解，过滤得到滤液；

7)将四氢呋喃和去离子水以体积比1:1混合配制透析液，将步骤6)的滤液装入截留分子量为3500的透析袋中并置于透析液中透析7天，取出后冻干，获得具有还原响应性的水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针。

本例制得的TPE-CS-ss-COOH荧光探针TPE标记率为8.24％，羧化度为40.2％。