本发明涉及一种单核苷酸多态性的花生真假杂种鉴定引物组及其方法。
背景技术：
花生(arachishypogaeal.)是世界第四大油料作物，也是热带、亚热带重要的油料作物，目前已在100多个国家种植，中国是世界最大的花生生产国。花生是严格的自花授粉作物，杂交育种过程中，需要人工完成母本花粉去雄，取父本花粉、授粉等全过程，过程中存在诸多不可控因素，致使杂交产生假杂种的几率很高。及时准确的鉴别杂交f1代的真假杂种是杂交育种成功的关键。传统真假杂交种鉴定工作主要通过田间性状观测和微卫星标记两种方法进行，但是受制于花生育成种间日益狭窄的遗传基础，以及亲本间越来越小的表型差异，这两种方法鉴别杂种的难度不断增大。
传统通过田间性状观测鉴定真假杂种的方案如下：将双亲和f1代杂交种种于同一区域，首先观察双亲间性状差异，锁定3-5个双亲间存在明显差异的性状，然后观察f1代杂交种的性状，如f1杂交种的性状与双亲存在明显差异，或者是双亲的中间表型，则认为f1杂交种为真。如f1杂交种的性状与母本完全一致，则认为f1杂交种为假。
利用微卫星标记检测鉴定真假杂种的方案如下：首选利用已经设计好的微卫星标记对双亲进行筛选，找到在双亲间存在差异，且双亲均为纯合的微卫星标记3-5个，然后利用筛选出的微卫星标记对f1代杂交种进行检测，如微卫星标记结果表现为双亲等位变异同时存在，则认为f1杂交种为真，如f1杂交种的条带与母本完全一致，则认为f1杂交种为假。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术存在以下问题：
1、田间性状观测的方法：田间性状观测受小环境、生长周期的影响很大，同时田间性状很多无法准确测定，这些都会影响结果鉴定的准确性。
2、微卫星检测方法：①花生微卫星标记检测流程复杂、通量低、极其费事费力，微卫星的检测流程包括：pcr、制胶、电泳、读带等过程。以1个杂交组合为例，花生材料间5％-10％的多态性计算，该杂交组合需要筛选50-60个标记才能获得足够的差异标记，然后再利用筛选出的标记对f1杂交种进行检测，整个实验需要两天时间才能完成；②微卫星标记的电泳检测分辨率低，检测结果不准确，由此导致的结果是无法准确判断杂合状态，导致鉴定结果准确度降低；③微卫星标记在pcr过程中存在滑峰现象，这样等位变异之间的条带存在重叠可能，从而无法准确判断电泳结果。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种高效、准确的基于单核苷酸多态性的花生杂种鉴定引物组及利用上述引物组进行鉴定的方法。
本发明采用如下技术方案：
引物的获得：
对18份国内育成花生品种进行全基因组重测序，单份样品测序数据量不少于30g。重测序数据利用bwa-mem(http://bio-bwa.sourceforge.net/)回贴到花生参考基因组上，利用gatk(https://software.broadinstitute.org/gatk/)进行单核苷酸变异鉴定。
鉴定出的单核苷酸变异位点集，通过最小等位变异频率>45％、单核苷酸变异位点位于染色体特异区域(100bp序列与花生基因组上任何其他序列都存在2个碱基以上差别的区域定义为染色体特异区)、均匀分布在基因组上为筛选条件，共筛选出单核苷酸变异位点176个。
对176个单核苷酸变异位点进行引物设计，并对引物特异性进行筛选，共获得染色体特异引物132对。从检测成本和实用角度综合考虑，同样按花生样本间5-10％的多样性原则，我们最终选取其中68对引物混合进行花生真假杂交种鉴定。
鉴定方法：
其包括如下步骤：
(1)对花生基因组dna进行准确定量；
(2)以花生基因组dna为模板，用引物混合液进行一轮pcr扩增，获得目标区域；
(3)将所获得的pcr扩增产物，进行产物纯化；
(4)在步骤(3)中获得的体系中，配置二轮pcr体系，进行二轮pcr扩增；
(5)对二轮pcr扩增产物进行纯化，完成测序文库的制备；
(6)将测序文库等质量混合后上机测序，获得测序数据。
(7)识别亲本间差异位点，并识别这些差异位点在f1代种子中的杂合度，位点杂合则认定为真杂种，杂合度低则认定为假杂种。
进一步的，所述步骤(1)用
进一步的，所述步骤(2)中，一轮pcr扩增体系为：引物混合液10μl；dna用量100ng；3*m酶15μl；加水补足45μl；一轮pcr扩增程序为：95℃预变性3min；(95℃变性30s、60℃退火4min，72℃延伸30s)，17个循环；72℃延伸4min。
进一步的，所述引物混合液为68个引物对，seqidno.1～seqidno.136，每条引物取10μl，定容至10ml。
进一步的，所述步骤(3)包括如下步骤：
a)加入一轮pcr体积0.5倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，取上清转移至新的管中；
b)加入一轮pcr体积0.6倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
c)添加一轮pcr体积0.8倍的磁珠悬浮液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
d)加入100μl的80％乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤。用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
进一步的，所述步骤(4)中，二轮pcr扩增体系为：3*m酶10μl；primerf；primerr；h2o18μl；二轮pcr扩增程序为：95℃预变性3min；(95℃变性15s、58℃退火15s、72℃延伸30s)，7个循环；72℃延伸4min。
进一步的，所述primerf的序列如seqidno.137所示，所述primerr的序列如seqidno.138所示。
进一步的，所述步骤(5)包括如下步骤：
a)加入0.8倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
b)添加等pcr体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
c)加入100μl的80％乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤。用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
d)加入23μlelutionbuffer，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱dna。将磁珠用磁铁吸附，所得到的上清dna溶液吸至一新的管中，获得测序文库。
进一步的，所述elutionbuffer为10mmtris-hcl，ph8.0-8.5。所述磁珠为ampurebeads
本发明的有益效果在于：
高效：本发明可在一天时间内对最多可对多达384个样品进行68个位点的检测，相对于微卫星检测方法，效率提高50-100倍(微卫星检测两天可完成80-100个样本的检测)，可直接获取亲本和f1杂交种基因型，省去标记筛选的时间。
准确：微卫星标记电泳检测分辨率低，同时存在滑峰现象，直接影响结果的准确性，本方法是利用测序技术直接读取单核苷酸多态，结果直观，可靠，不存在样本间干扰问题。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述。
1、材料的选取，选取21份花生，提取花生样品的基因组dna，采用bioteke磁珠法植物基因组dna提取试剂盒(cat#au31111)。
2、以花生基因组dna为模板，用引物混合液进行一轮pcr扩增，获得目标区域；
所述一轮pcr扩增体系：引物混合液10μl；dna用量100ng；3*m酶15μl；加水补足45μl。
所述一轮pcr扩增体系：95℃3min；(95℃30s，60℃4min，72℃30s)，17个循环；72℃4min。
引物混合液：本发明共计136条引物，如表1所示，每条引物取10μl，定容至10ml。每条引物的浓度0.1μm。
表1引物组
3、将所获得的pcr扩增产物，进行产物纯化；
3.1、加入一轮pcr体积0.5倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，取上清转移至新的管中；
3.2、加入一轮pcr体积0.6倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
3.3添加一轮pcr体积0.8倍的磁珠悬浮液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
3.4加入100μl的80％乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤。用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净；
所述磁珠为：ampurebeads
4、在步骤3中获得的含磁珠的体系中，配置二轮pcr体系，进行二轮pcr扩增；
所述pcr体系：3*m酶10μl；primerf；primerr；h2o18μl
所述pcr程序：95℃3min；(95℃15s，58℃15s，72℃30s)，7个循环；72℃4min。
所述primerf的序列如seqidno.137所示：
seqidno.137：
aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccg。
所述primerr的序列如seqidno.138所示：
seqidno.138：
caagcagaagacggcatacgagatxxxxxxxxgtgactggagttccttggcacccgaga。其中“xxxxxxxx”为用于识别样品的唯一条形码barcode，以区分样本。
本实施例中21个样本的barcode分别为cggctaaa、tccccgtg、tctggcgc、agcgatag、catcgttt、tgagacca、acgtcctg、gtcagtac、taccctgc、catttcct、ttgactat、agagtaga、gtaaggag、actgcata、ctaaagta、aagggcct、gcgatcta、ctaggata、tatattac、agagctct、gacgctat。
5、利用0.80倍的磁珠对二轮pcr扩增产物进行纯化，完成测序文库的制备；
5.1加入0.8倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
5.2添加等pcr体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
5.3加入100μl的80％乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤。用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
5.4加入23μlelutionbuffer，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱dna。将磁珠用磁铁吸附，所得到的上清dna溶液吸至一新的管中，获得测序文库(elutionbuffer为10mmtris-hcl，ph8.0-8.5)；
6、将测序文库等质量混合后上机测序，获得测序数据。
7、识别亲本间差异位点，并识别这些差异位点在f1代种子中的杂合度，位点杂合则认定为真杂种，杂合度低则认定为假杂种。结果如表2所示。
表2鉴定结果
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，但并不限于此，本领域的技术人员很容易根据上述实施例领会本发明的精神，并作出不同的引申和变化，但只要不脱离本发明的精神，都在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>石家庄博瑞迪生物技术有限公司
<120>基于单核苷酸多态性的花生真假杂种鉴定引物组及其鉴定方法
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